Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
LỜI CẢM ƠN
Sau 4 năm học tập và rèn luyện tại trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội, đặc
biệt là sau khi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng nỗ lực của
bản thân tôi còn nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ quý báu của nhà
trường, các thầy giáo, cô giáo, gia đình và bạn bè.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Tuyết Lê đã tận tình
hướng dẫn, chỉ bảo và động viên tôi trong suốt quá trình thực tập cũng như
hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy giáo, cô giáo trong bộ môn
Dinh dưỡng- Thức ăn, Khoa Chăn nuôi và Nuôi trồng thủy sản, Trường đại
học Nông Nghiệp Hà Nội đã góp ý và chỉ bảo để tôi hoàn thành khóa luận.
Để hoàn thành khóa luận này, tôi còn nhận được rất nhiều sự động viên,
khích lệ của những người thân trong gia đình và bạn bè. Tôi xin chân thành
cảm ơn những tình cảm cao quý đó.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 15 tháng 08 năm 2013
Sinh viên
Đàm Thị Hoa
Khoa CN & NTTS 1 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Viết Tắt Tiếng Việt
VK Vi khuẩn
B Bacillus
ĐK Đường kính
MT Môi trường
TB Tế bào
LB Luria-Broth
ml Mililit
mm Milimet
đặc tính sinh học cao nhưng chúng rất dễ bị biến đổi đặc tính sinh học hoặc
sinh những biến dị không mong muốn nếu khâu bảo quản và giữ giống không
tốt.
Hiện nay có rất nhiều các phương pháp bảo quản, giữ giống vi sinh vật
hiệu quả như đông lạnh, đông khô…. Tuy nhiên, các phương pháp này đòi hỏi
Khoa CN & NTTS 3 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
phải có thiết bị, máy móc hiện đại mà nhiều phòng thí nghiệm trong nước
chưa đáp ứng được. Vì vậy, các chủng giống sau phân lập chọn lọc vẫn được
giữ giống với phương pháp truyền thống là cấy truyền trên thạch nghiêng và
bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4
o
C. Phương pháp này đơn giản, dễ thực
hiện, không tốn kém nhưng lại có một số nhược điểm như thời gian bảo quản
ngắn, dễ bị biến đổi đặc tính sinh học của giống hoặc gây thoái hóa giống.
Xuất phát từ thực tế trên, để đánh giá sự biến đổi các đặc điểm về hình
thái cũng như đặc tính sinh học của một số chủng Bacillus sử dụng làm chế
phẩm sinh học trong chăn nuôi trong quá trình giữ giống, chúng tôi tiến hành
đề tài: “Đánh giá sự biến đổi chất lượng giống của một số chủng Bacillus
trong thời gian bảo quản ở nhiệt độ 4ºC”.
1.2. MỤC ĐÍCH YÊU CẦU
1.2.1. Mục đích
Theo dõi các chủng Bacillus trong quá trình bảo quản, đánh giá sự biến
đổi đặc tính sinh học của chúng trong các điều kiện và khoảng thời gian khác
nhau, từ đó xác định điều kiện thích hợp để bảo quản vi khuẩn Bacillus.
1.2.2. Yêu cầu
Trong quá trình theo dõi đánh giá, vi khuẩn phải đạt được các yêu cầu:
- Không có sự biến đổi về mặt hình thái.
- Không có sự biến đổi về đặc tính sinh hóa.
- Giữ được khả năng phân giải Protein.
làm phình tế bào. Ở điều kiện 100
o
C, bào tử của B. subtilis chịu được 180
Khoa CN & NTTS 5 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
phút, có tính ổn định cao với nhiệt độ thấp và sự khô cạn, tác động của hóa
chất, tia bức xạ.
Trên môi trường thạch nghiêng, vi khuẩn mọc dày, khuẩn lạc khô đục
mờ, rìa răng cưa hoặc lượn sóng. Mọc lan tràn, có màu trắng xám. Trên môi
trường dịch thể: Môi trường trong, hình thành màng dày, dai, nhăn nheo, lượn
sóng.
B. subtilis có khả năng phân giải tinh bột và protein (gelatin và casein)
để tạo thành vòng phân giải có đường kính lớn. Trong môi trường Litmus
milk, chúng gây peptone hóa chậm và thường bị kiềm hóa
Bacillus subtilis là loài tự dưỡng hiếu khí, một vài chủng sinh trưởng
yếm khí tùy tiện. Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng từ 28-40
o
C, tối đa là 50
o
C,
một số chủng có thể sinh trưởng ở 55
o
C. Phân bố: trong đất, cỏ khô, các hợp
chất hữu cơ bị phân hủy
B. subtilis được sử dụng trong công nghiệp để sản xuất nhiều loại
enzyme, ví dụ như amylase được sử dụng để rũ hồ hàng dệt, làm biến hình
tinh bột trong sản xuất giấy. B. subtilis cũng sản xuất các protease bao gồm
subtilisin được sử dụng chất tẩy rửa và công nghiệp thuộc da. Tuy nhiên, đáng
chú ý là B. subtilis được sử dụng để sản xuất nhiều loại kháng sinh như
difficidin, oxydifficidin, bacilli, bacillomyin B và Bacitracin. Các loại kháng
C, tối đa từ 50-56
o
C. Một số
chủng B. licheniformis có khả năng sản sinh hoạt chất kháng khuẩn là
Bacitracin.
Cũng giống như B. subtilis, B. licheniformis được nuôi cấy để thu
enzyme alkaline proteases (làm sạch không khí, làm mềm lông trong công
nghiệp da, bột giặt sinh học…), alpha-amylases (biến tính tinh bột trong sản
xuất giấy…); các hoạt chất kháng khuẩn như penicillinases, pentosanases,
bacitracin, proticin, 5'-inosinic acid, inosine, citric acid, và L-tryptophan
(Gherna et al., 1989).
c. Bacillus megaterium
Là trực khuẩn Gram dương, hai đầu tròn, kích thước 1,2-1,5 x 2-4µm.
Đứng riêng rẽ hoặc nối thành chuỗi ngắn. Có khả năng di động. Sinh bào tử
hình elip nằm ở trung tâm hoặc lệch tâm tế bào. Vách bào tử mỏng, phần lớn
bào tử xuất hiện sau 48h nuôi cấy. Bào tử không làm phình tế bào.
Nuôi cấy trên môi trường thạch, hình thành khuẩn lạc lớn, dạng S, tròn
trơn nhẵn bóng, bề mặt vồng lên, rìa gọn, không lan, dạng kem màu trắng
ngà.
Sinh trưởng trong môi trường dịch thể: môi trường đục, đồng nhất, có
cặn, không xuất hiện màng trên bề mặt.
Khoa CN & NTTS 7 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
B. megaterium được coi là trực khuẩn không có hại. Có khả năng phân
giải tinh bột và protein (gelatin và casein). Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ 28-
35
o
C, tối đa từ 40-45
o
C. B. megaterium được sử dụng trong công nghiệp để
môi trường dịch thể, làm đục môi trường, đục nhiều, đồng nhất cặn mềm dễ
tan, có hoặc không hình thành màng trên bề mặt. B. cereus có khả năng phân
giải tinh bột và protein (gelatin và casein), sống hiếu khí, một số chủng là
Khoa CN & NTTS 8 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
yếm khí tùy tiện. Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng là 30
o
C, đối đa từ 37-48
o
C.
Chúng phân bố nhiều trong đất, bụi, trong thực vật, sữa…, có khả năng gây
bệnh ngộ độc thực phẩm cho người và động vật do ăn phải thực phẩm nhiễm
B. cereus.
f. Bacillus thuringiensis
B. thuringiensis là trực khuẩn Gram dương, phân bố ở trong đất. Về
mặt hình thái, tương tự như B. cereus. Trong quá trình hình thành bào tử B.
thuringiensis hình thành các tinh thể protein có khả năng kháng côn trùng là
δ-endotoxins (hay cry protein) được mã hóa bởi gen cry . Trong phần lớn các
chủng B. thuringiensis các gen cry nằm trong plasmid. Vì vậy, bào tử và các
tinh thể protein kháng côn trùng của B. thuringiensis đã được sử dụng như là
một loại thuốc trừ sâu sinh học từ những năm 1920. Ngày nay chúng có tên
thương mại là Dipel và Thuricide. Bacillus thuringiensis serovar israelensis,
là một chủng được sử dụng rộng rãi để kiểm soát ấu trùng muỗi (lavicide).
Tuy nhiên các chủng B. thuringiensis cũng sản sinh độc tố đường ruột
enterotoxins, .
2.1.2. Vai trò của trực khuẩn bacillus trong sản xuất chế phẩm probiotics
2.1.2.1. Khái niệm về Probiotic
Mặc dù khái niệm Probiotic đã được biết đến vào những năm đầu thế
kỷ 20 tuy nhiên định nghĩa về probiotic vẫn chưa được đưa ra cho đến thập
niên 60. Năm 1965, Lilly và Stillwel cho rằng, probiotic là “những chất do vi
- Probiotics phải cung cấp các lợi ích về mặt sinh lý cho vật chủ, các
lợi ích này phải được xác định qua thực nghiệm được tiến hành trên
các vật chủ được lựa chọn
- Probiotics không cần phải giới hạn về cách sử dụng (qua đường ăn
hoặc uống)
Ngày nay, các probiotics thường có những đặc điểm sau:
- Là vi sinh vật sống
- Tác động trực tiếp có lợi cho hệ tiêu hóa của người và động vật
- Đề kháng lại với các yếu tố chế biến thức ăn.
Khoa CN & NTTS 10 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
- Có khả năng chống lại stress trong dạ dày, ruột. Thích nghi và tăng
trưởng nhanh chóng trong đường ruột
- Giải phóng ra sản phẩm trao đổi chất hữu ích (Enzyme, các axit hữu
cơ…).
- Kiểm soát được quần thể vi sinh vật đường ruột
- Không hại đến tế bào niêm mạc ruột sinh vật chủ.
- Có tác dụng ngăn cản vi sinh vật gây bệnh
- Phải đạt các yêu cầu, qui định an toàn sinh học, vệ sinh thực phẩm
và có ảnh hưởng cơ lợi lên sức khoẻ.
Cơ chế tác động của probiotics (Sanders, 2009):
- Sản sinh các hợp chất kháng khuẩn như các axit hữu cơ, các
bacteriocins
- Tăng cường đáp ứng miễn dịch (ví dụ như tiết IgA) đối với các tác
nhân gây bệnh hoặc vaccine
- Làm giảm viêm nhiễm
- Hỗ trợ đáp ứng miễn dịch trong giai đoạn đầu, giúp cho đáp ứng miễn
dịch được cân bằng tốt hơn, giảm nguy cơ phát sinh dị ứng.
- Cải thiện chức năng của lớp “rào cản” ở niêm mạc ruột
- Tăng cường sự ổn định hoặc giúp phục hồi hệ vi sinh vật đường ruột
®
gồm các bào tử của 2 loài Bacillus là B.
subtilis và B. licheniformis, được sản xuất ở một số nước Đông Âu. B. subtilis
chủng 3 hoặc 2335 trong chế phẩm sản sinh kháng sinh loại isocourmarin,
aminocourmarin A, có khả năng chống lại Helicobacter pylori (Pinchuk và
cộng sự, 2001). Các chủng B. subtilis từ Biosporin
®
có khả năng thay đổi để
tạo thành một interferon và một sản phẩm mới là Subalin được chứng nhận
của Nga sử dụng trong điều trị thú y với mục đích kháng virus và kháng u
(Beliavskaia, 2001).
Ở một số nước Đông nam Á, do việc sử dụng kháng sinh tràn lan và
phổ biến, nên người ta đã sử dụng các chế phẩm probiotics như là một chất bổ
trợ. Chính vì vậy, một số lượng lớn các chế phẩm sinh học đã được sản xuất,
Khoa CN & NTTS 12 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
tất cả đều mang ít chủng được xác định. Ví dụ như: Biosubtyl (Việt Nam)
chứa B. pumilus hoặc B. cereus; Bibactyl (Việt Nam) chứa B. subtilis; Biscan
(Hàn Quốc) gồm bào tử của B. polyfermenticus… Nguồn gốc của các chủng
này khó được xác định.
Các sản phẩm probiotic có chứa Bacillus còn được sử dụng điều trị
bệnh uremia. Công ty Kibow Biotech (Mỹ) sản xuất sản phẩm probiotics từ
B. coagulans để điều trị bệnh viêm dạ dày ruột. Chế phẩm này được sản xuất
dựa vào khả năng tiết hợp chất kháng khuẩn là bacteriocin - Coagulin là loại
kháng sinh phổ rộng đối với các vi khuẩn đường ruột (Hyronimus và cộng sự,
1998). Các báo cáo khoa học cũng cho thấy lợi ích của các chế phẩm sinh học
Bacillus trong điều trị viêm đường tiết niệu (Meroni và cộng sự, 1983).
* Nhóm thực phẩm bảo vệ sức khỏe và thực phẩm bổ sung
Một số lượng lớn các sản phẩm có chứa Bacillus được sử dụng cho
mục đích thức ăn bổ sung bảo vệ sức khỏe với những sự khuyến cáo như tăng
Paciflor
®
C10 chứa chủng B. cereus (CIP 5832) sản sinh độc tố; chế phẩm
Esporafeed Plus
®
chứa chủng B. cereus mang gen kháng kháng sinh
tetracycline là tetB.
Sử dụng các loài Bacillus trong chăn nuôi sản đem lại nhiều lợi ích cho
người chăn nuôi do:
- Bacillus tồn tại trong vật nuôi và trong môi trường sống
- Có khả năng sinh trưởng trong mọi điều kiện của môi trường (nhờ
hình thành bào tử
- Sản sinh nhiều loại enzyme khác nhau
- Hoạt động kháng các loại mầm bệnh một cách trực tiếp thông qua
ức chế sinh trưởng hoặc gián tiếp thông qua cơ chế cạnh tranh
- Đặc điểm của bào tử: tồn tại lâu trong cơ thể; Dễ dàng dịch chuyển
qua dạ dày, ruột mà không bị ảnh hưởng của axit, dịch mật; Đề
kháng tốt với nhiệt độ lên đến 60
o
C, đề kháng với sự khô hạn.
c. Bacillus được sử dụng trong các chế phẩm sinh học cho thủy sản
Trong nuôi trồng thủy sản, một số chế phẩm sinh học thương mại có
chứa bào tử của trực khuẩn Bacillus như chế phẩm kiểm soát sinh học
Biostart
®
(Mỹ) là một hỗn hợp gồm các loài B. megaterium, B. licheniformis,
Paenibacillus polymyxa và hai chủng B. subtilis; Liqualife
®
(Cargill), sử dụng
4 loài Bacillus không xác định; Promarine
Vi khuẩn trở nên mập hơn nếu được nuôi cấy trong môi trường giàu
chất dinh dưỡng, trái lại, trong môi trường nghèo dinh dưỡng, tế bào sẽ có
dạng mảnh hoặc dạng cầu bất thường.
- Sức căng bề mặt của môi trường như độ axit (pH) tăng cao cũng làm
vi khuẩn mập, ngắn hơn.
a. Biến dị hình thái vsv
Hình thái của vsv có thể thay đổi do ảnh hưởng của những yếu tố khác
nhau: Thành phần hóa học của môi trường; Điều kiện nuôi cấy (pH, nhiệt độ,
áp suất…); Những chất độc (chất sát trùng, kháng sinh…)
b. Biến dị về dạng khuẩn lạc
Khoa CN & NTTS 15 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
Được coi là biến dị gây ra bởi điều kiện môi trường. Nguyên nhân do
những tổn thương trong cấu trúc của tế bào vi khuẩn có thể tạo nên những
biến dạng của khuẩn lạc. Ví dụ: Những vi khuẩn cùng loài khi phát triển
trên môi trường đặc có thể hình thành khuẩn lạc láng (dạng S) hoặc nhám
(dạng R). Trong một số điều kiện nuôi cấy sẽ tạo ra khuẩn lạc trung gian
không ổn định như khuẩn lạc con, khuẩn lạc lùn nhỏ, khuẩn lạc G mọc trên
mặt, khuẩn lạc L mọc ở rìa khuẩn lạc bình thường, khuẩn lạc lớn nhầy…
Một số vsv có biến dị về màu sắc khuẩn lạc khi nuôi cấy trên môi
trường chọn lọc (Serratea marcesceus) hoặc sinh sắc tố làm biến đổi màu sắc
của môi trường
2.2.3.2. Biến dị kiểu gen
Biến dị kiểu gen là chỉ những biến đổi xảy ra trong cấu trúc gen. Mỗi
biến dị dẫn đến sự thay đổi trình tự nucleotid tạo ra các alen khác nhau. Đột
biến có thể xảy ra do biến đổi nhiều nucleotid hoặc do một nucleotid. Đột
biến gen không thể phát hiện được khi quan sát tế bào học.
Trong tự nhiên, dù giữ trong điều kiện nào, tất cả các gen đều có đột
biến, được gọi là đột biến tự nhiên hay ngẫu nhiên (spontanous mutation).
Các đột biến tự nhiên thường xuất hiện rất ít. Các gen khác nhau của cùng
hợp. Quá trình này được lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo chủng
vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Thực
tế có nhiều chủng vi sinh vật thích hợp với phương pháp bảo quản này như:
Staphylococi, Colifom… có thể sống được vài năm theo cách này. Cho dù khá
phổ biến và được dùng trong các cơ sở nghiên cứu, nhưng phương pháp này
cũng bộc lộ nhiều nhược điểm sau:
- Dễ bị tạp nhiễm và dẫn đến mất chủng giống gốc.
- Mất hoặc nhầm lẫn nhãn hiệu giữa các chủng trong quá trình bảo
quản.
- Phải nghiên cứu và theo dõi thời gian cấy truyền thích hợp đối với các
chủng bảo quản.
Khoa CN & NTTS 17 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
- Tốn nhiều công sức để cấy truyền.
- Giống gốc có thể mất do sai sót khi dùng môi trường cấy truyền
không thích hợp.
- Chủng vi sinh vật cấy truyền dễ bị thay đổi các đặc điểm sinh học do
đột biến xuất hiện sau mỗi lần cấy truyền.
a. Cấy truyền trên môi trường dịch thể
- Cách tiến hành rất đơn giản là chuẩn bị 10ml môi trường nuôi cấy vi
sinh vật trong lọ McCartney khử trùng ở nhiệt độ 121
o
C trong 15 phút.
Thường làm 2 lọ cho mỗi chủng bảo quản.
- Một vòng que cấy chủng vi sinh vật bảo quản được đưa vào môi
trường bằng thao tác vô trùng và giữ ở nhiệt độ thích hợp trong 72 giờ. Phải
kiểm tra sự phát triển của chủng bảo quản.
- Sau đó các mẫu được giữ ở 4
o
C.
Dùng cát sông rửa sạch bằng nước nhiều lần đến khi nước không đục,
sấy khô, sàng qua rây lỗ nhỏ để loại đất và rác bẩn. Có thể dùng axit clohydric
đặc để oxy hóa các chất hữu cơ. Sấy khô ở 120
o
C trong 3 – 4 giờ. Chia cát
khô vào ống nghiệm thủy tinh đã sấy thanh trùng ở 160 – 180
o
C khoảng 2 giờ.
Ta có thể kiểm tra độ vô trùng của cát bằng cách cho môi trường dịch đường
hóa và thịt – peptone vô trùng vào ống cát đã hấp thanh trùng. Sau đó cho vào
tủ ấm 28 – 30
o
C khoảng một tuần. Quan sát hàng ngày nếu thấy loại dịch này
đục thì coi như cát chưa vô trùng.
Đổ cát đã chuẩn bị vào các ống nghiệm giống đã thanh trùng sao cho
cát không rơi vào mặt thạch, không dính lên thành ống nghiệm. Úp mặt thạch,
dùng que cấy cào bào tử vào cát, đổ cát có bào tử vào ống nghiệm vô trùng
lắc đều. Chỉ bảo quản những ống cát vào bào tử khô không bị ướt và vón cục,
các ống cát giống đậy bằng nút bông. Dùng parafil nóng chảy phết lên nút
bông của ống nghiệm giúp cho ống giống không bị ẩm ướt và giữ ở nhiệt độ
phòng hay ở 4 – 6
o
C.
Phục hồi chủng bằng cách dùng que cấy lấy cát trong ống và cấy vào
các ống thạch nghiêng, sau đó chọn lựa và cấy chuyển tiếp.
b. Bảo quản giống trong đất khô
Nghiền đất và rây lấy những hạt bằng nhau. Chia đất nghiền vào các
ống nghiệm, thêm 1 – 2 giọt nước, có thể thêm 1 – 2% CaCO
3
để trung hòa
thích hợp và được làm lạnh trong môi trường chân không. Thiết bị đông khô
sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định. Mẫu được
hàn kín để cho môi trường chứa mẫu là chân không.
Phương pháp này cũng phải cấy truyền và làm lại, nhưng thời gian giữa
các lần cấy chuyển kéo dài hơn so với phương pháp giữ giống trên thạch:
Giữ ở t
o
= -15
o
C đến -20
o
C : 6 tháng cấy chuyển một lần.
Giữ ở t
o
= -30
o
C : 9 tháng cấy chuyển một lần.
Giữ ở t
o
= -40
o
C : 1 năm cấy chuyển một lần.
Giữ ở t
o
= -50
o
C đến -60
o
C : 3 năm cấy chuyển một lần.
Giữ ở t
đến vỡ tế bào là do tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình
thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này, người ta
đã bổ sung các chất làm hạn chê tốc độ lạnh sâu như Glycerol, DMSO
(dimethyl sulfoxide).
Bảo quản ở mức nhiệt độ cao hơn -30
o
C thì hiệu quả thấp hơn do tế bào
chịu nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải.
Phương pháp này mặc dù có nhiều ưu điểm nhưng cũng bộc lộ một số
nhược điểm như: kinh phí đầu tư cho thiết bị cao, rủi ro cháy nổ… Đặc biệt,
Khoa CN & NTTS 21 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
phương pháp này không thích hợp với những chủng vi sinh vật thường xuyên
dùng đến.
Nói chung, phương pháp này được áp dụng cho những chủng vi sinh
vật có những đặc tính quý mà không thích hợp với phương pháp đông khô.
Khoa CN & NTTS 22 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
PHẦN III
ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNG- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỐI TƯỢNG –ĐỊA ĐIỂM – THỜI GIAN NGHIÊN CƯU
- Đối tượng: Một số chủng vi khuẩn Bacillus đang được bảo quản tại
phòng thí nghiệm bộ môn Dinh dưỡng-Thức ăn, khoa Chăn nuôi và nuôi
trồng thủy sản
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh, bộ môn Dinh dưỡng-Thức ăn,
khoa Chăn nuôi và Nuôi trồng thủy sản, Trường Đại học Nông nghiệp Hà
Nội.
- Thời gian : từ tháng 01đến tháng 07 năm 2013
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.2.1 Đánh giá sự biến đổi về mặt hình thái của vi khuẩn Bacillus trong thời
slope method) và bảo quản ở 4
o
C
Các chủng Bacillus sau khi phân lập và chọn lọc với mục đích sử dụng
làm giống khới động sẽ được nuôi cấy trên môi trường thạch LB ở 37
o
C/24-
48h để giữ giống. Kiểm tra tạp nhiễm giống trước khí bảo quản trong giống
trong tủ lạnh ở điều kiện nhiệt độ 4
o
C. Giống được cấy truyền 1 tháng một lần
sang môi trường LB mới.
Trong quá trình bảo quản, tiến hành đánh giá các chỉ tiêu về hình thái,
đặc tính sinh học của giống tại các thời điểm 0, 30, 60, 90 ngày.
3.3.3. Phương pháp xác định hình thái
- Hình thái tế bào được xác định bằng phương pháp nhuộm Gram (Xem
phụ lục) và quan sát tiêu bản nhuộm dưới kính hiển vi quang học với độ
phóng đại 1500 lần.
- Quan sát bào tử bằng phương pháp nhuộm với Lục Malachite. Bào tử
bắt màu xanh, tế bào bắt màu đỏ
- Hình thái của bào tử được nhuộm với thuôc
- Quan sát hình thái, tính chất khuẩn lạc nuôi cấy trên môi trường thạch
bằng kính lúp có độ phóng đại 20 lần.
3.3.4. Phương pháp đánh giá khả năng phân giải protein
Sử dụng phương pháp khuếch tán trên thạch
Khoa CN & NTTS 24 Trường đại học NN Hà Nội
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54
- Chuẩn bị môi trường thạch đĩa:
Cao nấm men 5g NaCl 10g
Sữa tách bơ 300ml Nước cất 700ml
o
C, 40
o
C, 50ºC, 55ºC. Đếm số lượng tế bào ở các thời điểm 0
giờ, 24 giờ, 48 giờ.
Khoa CN & NTTS 25 Trường đại học NN Hà Nội
Copyright: Tài liệu đại học ©