Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
TĂNG THỊ NGỌC MAI
ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU LẠNH
VÀ TẠO NGUỒN VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU CHO CHỌN DÒNG
CHỊU LẠNH TỪ CÁC GIỐNG LÚA XUÂN CHÂU HƢƠNG,
Q5, C27, KHANG DÂN, U17 VÀ NHỊ ƢU 63 BẰNG KỸ
THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Thái Nguyên – Năm 2011
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.46.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thị Tâm Thái Nguyên – Năm 2011 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực. Một số kết quả đã được công bố
cùng PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kì
công trình nào khác.
Tác giả
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
2,4D
2,4D – Axit dichlorphenoxyacetic
ADN
Axit deoxyribo nucleic
BAP
6 – Benzyl amino purin
bp
Cặp base (base pair)
cs
Cộng sự
cADN
Sợi ADN bổ sung tổng hợp từ mARN nhờ enzym phiên mã ngược
ĐC
Đối chứng
ĐVHĐ
Đơn vị hoạt độ
EDTA
Axit ethylen diamin tetra axetic
kb
Kilobase
MS
Môi trường Murashige và Skoog
mARN
ARN thông tin
NAA
Axit α – naphthyl axetic (α – naphthyl acetic acid)
PCR
Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi polymerase
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Giới thiệu về cây lúa 3
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây lúa 3
1.1.2. Giá trị kinh tế của cây lúa 3
1.1.3. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới và Việt Nam 4
1.1.4. Đặc điểm sinh học của cây lúa nước 6
1.2. Lạnh và cơ chế chịu lạnh 7
1.2.1. Khái niệm về tính chịu lạnh của thực vật 7
1.2.2. Tác động của lạnh lên thực vật 8
1.2.3. Cơ chế chịu lạnh của thực vật và khả năng khắc phục 9
1.2.4. Tác hại của lạnh và tính chịu lạnh ở lúa 10
1.3. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro vào việc đánh giá và nâng cao khả năng
chống chịu ở cây trồng 11
1.3.1. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro vào việc đánh giá khả năng chống chịu
của cây trồng ở mức độ mô - tế bào 11
1.3.2. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro để nâng cao khả năng chống chịu ở
cây trồng 12
1.4. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích hệ gen thực vật 14
1.4.1. Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) 14
1.4.2. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
iii
Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
2.1. Nguyên liệu nghiên cứu 17
2.1.1. Vật liệu thực vật 17
2.1.2. Hoá chất và thiết bị 17
2.2. Phương pháp nghiên cứu 18
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
iv
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Đặc điểm của các giống lúa nghiên cứu 17
Bảng 2.2. Trình tự các nucleotit của 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu 25
Bảng 3.1. Hàm lượng đường khử của 6 giống lúa ở giai đoạn hạt nảy mầm sau khi
xử lý lạnh ở 12
0
C ± 0,5
0
C 27
Bảng 3.2. Hoạt độ α - amylase của 6 giống lúa ở giai đoạn hạt nảy mầm sau khi xử
lý lạnh ở 12
0
C ± 0,5
0
C 30
Bảng 3.3. Tương quan giữa hoạt độ α - amylase và hàm lượng đường khử 32
Bảng 3.4. Tỷ lệ chết và tỷ lệ thiệt hại khi xử lý lạnh ở 4
0
C± 0,5
0
C trong 32 giờ ở
giai đoạn mạ 3 lá của các giống nghiên cứu 34
Bảng 3.5. Hàm lượng diệp lục trong lá lúa sau khi xử lý lạnh ở 12
0
C ± 0,5
v
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 18
Hình 3.1. Hàm lượng đường khử của 6 giống lúa nghiên cứu ở giai đoạn nảy mầm
khi xử lý lạnh ở 12
0
C ± 0,5
0
C 29
Hình 3.2. Hoạt độ α - amylase của 6 giống lúa ở giai đoạn hạt nảy mầm sau khi xử
lý lạnh ở 12
0
C ± 0,5
0
C 31
Hình 3.3. Tỷ lệ chết và tỷ lệ thiệt hại khi xử lý lạnh 4
0
C± 0,5
0
C ở giai đoạn cây mạ
3 lá của các giống nghiên cứu 34
Hình 3.4. Hàm lượng diệp lục của các giống sau khi xử lý lạnh ở 12
0
C ± 0,5
0
C 36
Hình 3.5. Tỷ lệ mô sẹo sống sót sau khi xử lý lạnh và nuôi phục hồi 40
Hình 3.6. Tốc độ sinh trưởng tương đối của mô sẹo sau xử lý lạnh 42
trưởng và phát triển của cây lúa là: nhiệt độ cực đoan, hạn hán hay ngập úng, độ
mặn, ánh sáng bất lợi… Một trong những yếu tố đó là nhiệt độ thấp. Vùng núi phía
Bắc, đồng bằng sông Hồng và Bắc Trung Bộ là những khu vực thường xuyên chịu
ảnh hưởng của lạnh và đây cũng chính là nguyên nhân là giảm năng suất lúa của
vùng. Lúa vụ đông xuân chịu tác động mạnh nhất của nhiệt độ thấp. Vì vậy, nghiên
cứu khả năng chịu lạnh và tăng cường khả năng chống chịu với nhiệt độ thấp nhằm
nâng cao năng suất và ổn định sản lượng của các giống lúa là yêu cầu thiết thực đối
với các tỉnh miền Bắc và khu vục Bắc Trung Bộ [3], [4].
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là một lĩnh vực nhằm cải tiến cây trồng,
đặc biệt trong chọn dòng tế bào có khả năng chống chịu với các điều kiện ngoại
cảnh bất lợi. Đây là hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng đã được sử dụng và tạo
ra những giống cây trồng mới có khả năng chống chịu cao trong một thời gian ngắn
so với các phương pháp truyền thống [2].
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: ‘‘Đánh giá khả
năng chịu lạnh và tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu lạnh từ các
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2
giống lúa Xuân Châu Hƣơng, Q5, C27, Khang Dân, U17 và Nhị Ƣu 63 bằng kỹ
thuật nuôi cấy in vitro’’.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định khả năng chịu lạnh của một số giống lúa ở giai đoạn nảy mầm,
giai đoạn cây non và ở mức độ mô sẹo.
- Tạo được vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu lạnh ở lúa bằng kỹ thuật
nuôi cấy mô - tế bào thực vật.
3. Nội dung nghiên cứu
(1) Đánh giá khả năng chịu lạnh ở một số giống lúa nghiên cứu
- Đánh giá khả năng chịu lạnh của lúa ở giai đoạn nảy mầm thông qua việc
xác định ảnh hưởng của nhiệt độ thấp tới hàm lượng đường khử và hoạt độ độ
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây lúa
Cây lúa (Oryza sativa L.) còn được gọi là lúa châu Á được thuần hoá từ
lúa dại ở ba trung tâm đầu tiên vùng Đông Nam Á: Assam (Ấn Độ), biên giới
Thái Lan - Myanmar, trung du Tây Bắc - Việt Nam. Theo tài liệu của Trung
Quốc, khoảng năm 2800 - 2700 trước Công Nguyên, Trung Quốc đã có nghề
trồng lúa. Markey và De Candolle, Roievich cho rằng nguồn gốc cây lúa trồng ở
miền Nam - Việt Nam và Campuchia [4].
Tuy có nhiều tài liệu khác nhau và các nhà khảo cổ đã chứng minh nguồn
gốc khác nhau của cây lúa nhưng đa số các tài liệu đều cho rằng nguồn gốc cây lúa
ở vùng đầm lầy Đông Nam Á. Tổ tiên các loài lúa hiện nay là các dạng lúa dại
Oryza fatua, Oryza off Cinalis, Oryza minuta [4].
Lúa thuộc họ hoà thảo (Proaceae, trước đây gọi là họ Gramineae). Lúa trồng
thuộc chi Oryza. Chi Oryza có 23 loài phân bố rộng trên thế giới, trong đó có 2 loài
lúa trồng. Loài Oryza sativa L. được trồng phổ biến khắp các nước trồng lúa trên
thế giới và phần lớn tập trung ở châu Á. Loài Oryza gluberrima S. được trồng ở một
số nước thuộc châu Phi. Sự tiến hoá của cây lúa gắn liền với sự tiến hoá của loài
người, đặc biệt ở châu Á [4].
Loài lúa Oryza sativa L. được chia làm ba loài phụ: Loài phụ Japonica phân bố
ở nơi có vĩ độ cao (Bắc Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên), chịu rét cao, ít chịu sâu
bệnh; loài phụ Indica được trồng ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới (Ấn Độ,
Mianma, Philippin, Việt Nam, Thái Lan), có đặc điểm là hạt dài, thân cao, mềm, dễ đổ,
chịu sâu bệnh khá, năng suất thấp, mẫn cảm với chu kỳ ánh sáng; loài phụ Javancia
được trồng ở một vài nơi thuộc Indonesia, có đặc điểm trung gian, hạt dài nhưng dày
và rộng hơn hạt của loài phụ Indica [4].
1.1.2. Giá trị kinh tế của cây lúa
Trên thế giới, trong cơ cấu sản xuất lương thực, lúa gạo chiếm 26,5%. Sản
lượng lúa đã vượt lên đứng thứ nhất trong các cây lương thực với tổng sản lượng là
650 triệu tấn/năm mặc dù diện tích trồng lúa gạo đứng sau diện tích trồng lúa mỳ [4].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
trước đây. Báo cáo mới nhất của Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực Liên hiệp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
5
quốc (FAO) cho biết, thời tiết xấu đã ảnh hưởng tới vụ mùa ở châu Á làm sản lượng
lúa thế giới năm 2010 chỉ đạt 697,9 triệu tấn, giảm gần 6,5% so với dự báo trước
đó. Bộ Nông nghiệp Mỹ (USDA) ước tính sản lượng gạo thế giới năm nay sẽ đạt
451,4 triệu tấn, thiếu 1,1 triệu tấn so với nhu cầu và là năm thiếu hụt đầu tiên trong
vòng 4 năm trở lại đây [58].
1.1.3.2. Tình hình sản xuất lúa gạo ở Việt Nam
Việt Nam là một trong mười quốc gia sản xuất gạo lớn nhất thế giới. Theo
thống kê của FAO năm 2008, Việt Nam có diện tích lúa khoảng 7,4 triệu ha, đứng
thứ 7 sau các nước có diện tích trồng nhiều nhất châu Á: Ấn Độ (gần 44,0 triệu ha),
Trung Quốc (29,5 triệu ha), Indonesia (xấp xỉ 12,3 triệu ha), Bangladesh (gần 11,7
triệu ha), Thái Lan (10,2 triệu ha), Myanmar (xấp xỉ 8,2 triệu ha). Việt Nam có năng
suất lúa trung bình 5,2 tấn/ha đứng thứ 24 trên thế giới sau: Ai Cập (9,7 tấn/ha), Úc
(9,5 tấn/ha), El Salvador (7,9 tấn/ha), đứng đầu khu vực Đông Nam Á và đứng thứ
tư trong khu vực châu Á sau Hàn Quốc (7,4 tấn/ha), Trung Quốc (6,6 tấn/ha), Nhật
Bản (6,5 tấn/ha). Mức tăng năng suất trong 8 năm qua là 0,98 tấn/ha, đứng thứ 12
trên thế giới và đứng đầu của 8 nước có diện tích nhiều ở châu Á. Về khả năng cải
thiện năng suất lúa trên thế giới, Việt Nam vượt trội trong khu vực Đông Nam Á
nhờ thủy lợi được cải thiện đáng kể và áp dụng nhanh các tiến bộ kỹ thuật về giống,
phân bón và bảo vệ thực vật [57].
Theo thống kê của FAO năm 2008, Việt Nam có tổng sản lượng lúa hàng
năm đứng thứ 5 trên thế giới nhưng lại là nước xuất khẩu gạo đứng thứ 2 (5,2 triệu
tấn) sau Thái Lan (9,0 triệu tấn), chiếm 18% sản lượng xuất khẩu gạo thế giới,
22,4% sản lượng xuất khẩu gạo của châu Á, mang lại lợi nhuận 1275,9 tỷ USD
năm 2006 [58].
Hiệp hội Lương thực Việt Nam (VFA) cho biết, tính đến hết ngày
khả năng tự thụ phấn tương đối nghiêm ngặt, ít có khả năng thụ phấn chéo [4], [9].
Chi Oryza có bộ nhiễm sắc thể cơ bản là 12. Trong số 23 loài lúa dại có 8
loài mang bộ nhiễm sắc thể tứ bội, còn lại đa số các loài lúa dại và lúa trồng hiện
nay có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội (2n = 24) [9].
Lúa là loại cây trồng mẫn cảm với các điều kiện ngoại cảnh. Quá trình
sinh trưởng, phát triển và năng suất của cây lúa chịu ảnh hưởng lớn bởi các
yếu tố môi trường [9].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
7
1.1.4.2. Đặc điểm sinh thái
Các nhân tố sinh thái (nhiệt độ, ánh sáng, nước, đất) thường xuyên ảnh
hưởng đến sinh trưởng và phát triển của cây lúa. Nhiệt độ là một trong những nhân
tố ảnh hưởng lên hầu hết các giai đoạn phát triển của cây lúa. Ở mỗi giai đoạn sinh
trưởng, cây lúa yêu cầu nhiệt độ khác nhau, nhiệt độ thích hợp nhất là 28
0
- 32
0
C,
ngừng sinh trưởng khi nhiệt độ dưới 13
0
C [4].
Ánh sáng tác động tới cây lúa ở hai mặt là cường độ và thời gian chiếu sáng.
Quang hợp của lúa được tiến hành thuận lợi ở 250 - 400 cal/cm
2
/ngày. Cường độ ánh
sáng trong ngày ảnh hưởng tới thời gian ra hoa, kết hạt ở lúa [4].
Nước là một yếu tố thiết yếu của lúa. Lúa cần nhiều nước hơn các cây trồng
khác. Để tạo ra 1g chất khô, cây lúa cần 628g nước. Lượng nước cần thiết cho cây
Tác động của lạnh lên thực vật và gây tổn thương tùy theo mức độ và
thời gian [2].
Tác động của lạnh ở nhiệt độ dưới 0
0
C chủ yếu là tác hại của nước ở dạng
tinh thể gây tổn thương đến nguyên sinh chất của tế bào. Tác động của lạnh ở nhiệt
độ trên 0
0
C gây ảnh hưởng đến một loạt chức năng sống của tế bào, thậm chí cấu
trúc tế bào cũng có thể bị tổn thương [3].
Lạnh gây tổn thương và chết ở thực vật là do độ nhớt chất nguyên sinh bị
thay đổi, ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất. Ở nhiệt độ thấp, xảy ra hiện tượng
đông các chất mỡ và giảm các quá trình sinh hóa. Độ nhớt chất nguyên sinh tăng lên
làm chậm quá trình trao đổi chất, phân giải protein, kết hạt và đông kết chất nguyên
sinh, làm suy yếu mối liên kết giữa protein và diệp lục. Mặc dù cường độ hô hấp
tăng lên nhưng không bù lại được sự thiếu hụt năng lượng của cơ thể [3], [4].
Có thể nhận thấy, thực vật không có khả năng chống chịu lạnh dưới 10
0
C có
hiện tượng phân hủy diệp lục, lá cây đặc biệt là lá non mất màu xanh trở thành bạch
tạng. Lạnh làm tổn thương chức năng của bộ rễ, làm cho quá trình hút nước vào cây
và cung cấp nước lên thân, lá bị ngưng trệ, ngay cả khi rễ cây ngập trong nước (cây
lúa nước) lá vẫn bị héo khô [3], [4].
Giai đoạn sinh sản ở thực vật bao gồm quá trình phân hóa hoa, trổ bông, thụ
phấn, kết hạt là giai đoạn chịu tác động mạnh mẽ của nhiệt độ thấp. Ở giai đoạn cây
lúa trổ bông, nếu gặp nhiệt độ dưới 20
0
C thì kết quả thụ phấn sẽ giảm và tỷ lệ hạt lép
sẽ tăng lên đáng kể. Nếu lạnh hơn và thời gian kéo dài có thể gây bất thụ hoàn toàn
[3].
số loại protein nhanh chóng được sinh tổng hợp, nhưng vai trò của các protein này
còn đang được nghiên cứu. Trước hết, người ta thấy trong cây ngô non, cây
Arabidopsis quá trình sinh tổng hợp ABA gia tăng khi cây bị lạnh. Protease loại thiol
cũng được tạo ra nhiều hơn [3].
Thành phần lipit trong màng tế bào được nhiều tác giả đề cập đến trong
nghiên cứu tác động của lạnh ở thực vật và có kết luận chung là thành phần axit béo
không no càng cao thì khả năng chịu lạnh, đặc biệt là chịu băng giá càng tốt [3].
Gen liên quan tới các khả năng chịu băng giá được tập trung nghiên cứu
nhiều. Các tác giả tập trung thảo luận về thành phần của các axit béo không no
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
10
trong hệ thống màng tế bào có tác dụng bảo vệ chức năng màng trong điều kiện
nhiệt độ thấp dưới 0
0
C [3].
Theo Lê Trần Bình và Lê Thị Muội (1998), tính chịu lạnh ở quãng nhiệt độ
trên 0
0
C có liên quan đến hoạt động của hai cơ quan chính là bộ máy quang hợp –
lục lạp và chức năng hút nước của rễ. Các tác giả này cho rằng, bản chất của tính
chống chịu nằm trong bộ máy di truyền của thực vật. Các tác giả cũng đã phân lập
và xác định được 4 trình tự gen liên quan đến tính chịu lạnh của cây lúa trong giai
đoạn mạ, ký hiệu là: PBC122, PBC442, PBC591, PBC601. Các trình tự gen này đã
được công bố và công nhận quyền tác giả, hiện đang được lưu giữ tại ngân hàng dữ
liệu gen thế giới [3].
Như vậy, thực vật thích nghi với lạnh là nhờ một số cơ chế như: giảm độ
nhớt chất nguyên sinh khi gặp lạnh, tích lũy các hợp chất có khả năng bảo vệ tế
bào, giảm sinh trưởng, thay đổi hoạt tính enzyme và thành phần protein. Các
20
0
C thì kết quả thụ phận sẽ giảm và tỷ lệ lép sẽ tăng lên đáng kể. Nếu lạnh hơn
và thời gian kéo dài có thể gây bất thụ hoàn toàn. Nhiệt độ dưới 15
0
C ức chế tổng
hợp chlorophyll, phân hủy lục lạp, sinh trưởng kém. Nếu nhiệt độ giảm xuống
dưới 10
0
C chức năng của rễ bị tổn thương, lá và cả thân bị khô héo, cây chết, mạ mũi
chông có thể ngừng sinh trưởng hoàn toàn [3].
1.3. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro vào việc đánh giá và nâng cao khả
năng chống chịu ở cây trồng
1.3.1. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro vào việc đánh giá khả năng chống
chịu của cây trồng ở mức độ mô - tế bào
Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã đạt được những thành công nhất
định trong việc nghiên cứu khả năng chống chịu của cây trồng. Nguyễn Hoàng Lộc
(1992) sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo thuốc lá kết hợp với tiền xử lý abscisic,
manitol và saccharose đã thu được các dòng mô thuốc lá SC1, SC2, SC3 có khả
năng chịu mất nước trên 90% trọng lượng tươi [18], [19]. Adkins và cs (1995) đã
chọn được dòng lúa chịu hạn từ mô sẹo giống lúa Khao Dawk Mali 105 với việc bổ
sung vào môi trường nuôi cấy PEG 8000 [35]. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội và cs
(1995, 1998) đã nghiên cứu khả năng chịu lạnh và chịu khô ở mô sẹo của các giống
lúa có nguồn gốc khác nhau [2], [3], [24]. Cùng hướng nghiên cứu chọn dòng chịu
lạnh, Lê Xuân Đắc (1998) đã thu được 1 dòng lúa duy trì khả năng chịu lạnh có
nhiều triển vọng làm giống khi xử lý mô sẹo 2 giống lúa C71 và TK90 ở nhiệt độ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
12
Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ thấp và tính chịu lạnh của cây trồng nói
chung và cây lúa nói riêng đã được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu [38], [39], [40].
Song lĩnh vực chọn dòng chịu lạnh bằng công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật còn ít
được công bố. Sự hoàn thiện kỹ thuật cơ bản và các điều kiện nuôi cấy sẽ tạo tiền đề cho
khả năng chọn lọc thành công các dòng tế bào chịu lạnh ở các đối tượng cây trồng
khác nhau, trong đó có cây lúa.
1.3.2. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro để nâng cao khả năng chống chịu ở
cây trồng
Để nâng cao khả năng chống chịu ở cây trồng, các tác giả đã ứng dụng kỹ
thuật nuôi cấy in vitro để chọn các dòng có khả năng chống chịu tốt và duy trì dòng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
13
chống chịu đó để làm giống, cải thiện những giống gốc không có khả năng chống
chịu với điều kiện ngoại cảnh bất lợi như chịu nhiệt độ thấp [8], [38], chịu nóng
[26], chịu mặn [16], [32], [39], [41], chịu hạn [11], [13], [19], [23], [24]…
Một hướng nghiên cứu mới cũng được quan tâm nghiên cứu và thu được nhiều
thành công đáng kể là chuyển gen liên quan đến tính chống chịu vào cây trồng, sau đó
ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro để nâng cao khả năng chống chịu cho cây.
Khả năng chống chịu với nhiệt độ cũng như khả năng chống chịu với các tác
động bất lợi của ngoại cảnh khác liên quan đến sự có mặt của các chất có khả năng điều
chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào như prolin, protein tan, glicinebetain, đường tan…
Một số công trình nghiên cứu chuyển gen mã hóa cho các enzyme tham gia vào chuyển
hóa các chất để có khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào. Alia và cs (1998)
đã chuyển gen CodA mã hóa enzyme cholin oxidase vào arabidopsis, sau đó tiến hành
nuôi cấy in vitro thu được cây chuyển gen có sự tích lũy hàm lượng cao glycinebetain
trong hạt, nâng cao đáng kể khả năng chịu nóng trong suốt giai đoạn hút nước và nảy
mầm của hạt cũng như trong giai đoạn sinh trưởng của cây non [36]. Sakamoto và cs
(1999) bằng cách ứng dụng kỹ thuật chuyển gen và nuôi cấy in vitro đã thu được cây lúa
bản sao của một trình tự xác định.
Với độ nhạy rất cao, thao tác đơn giản, PCR được ứng dụng trên nhiều lĩnh
vực quan trọng trong nghiên cứu phân tích genome ở sinh vật với nhiều mục đích
khác nhau: Sản xuất mẫu dò dùng trong lai phân tử, ứng dụng kỹ thuật PCR xác
định trình tự axit nucleic, bằng phương pháp này cho phép xác định trực tiếp trình
tự ADN không qua tạo dòng, đánh giá cây chuyển gen, phân tích biến dị di truyền ở
cấp độ phân tử trong phạm vi quần thể và giữa các cá thể [10], [12], [42].
Hạn chế lớn nhất của kỹ thuật PCR là phải có một trình tự ADN nhất định để
từ đó tổng hợp các đoạn mồi. Tuy nhiên, hiện nay các nhà sinh học phân tử đã cải
tiến kỹ thuật PCR sử dụng đoạn mồi ngẫu nhiên mà không cần biết trước trình tự
ADN [53]. Đó là kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA).
1.4.2. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA)
Năm 1990, Welsh, Mc Clelland và Williams đồng thời xác định hiện tượng
đa hình ADN bằng các đoạn mồi có trình tự ADN tuỳ ý dựa trên phản ứng chuỗi
PCR. Kỹ thuật này khuyếch đại các đoạn ADN với việc sử dụng các đoạn mồi ngẫu
nhiên dài từ 8 - 12 nucleotit (kỹ thuật RAPD) [53], [54], không cần biết về trình tự
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
15
nucleotit của đoạn ADN có thể nhân bản. Sự khác nhau về vị trí và số lượng các
đoạn ADN có thể ghép cặp bổ sung với primer chính là cơ sở của sự đa hình ADN
được nhân bản [53].
Kỹ thuật RAPD khác với PCR thông thường là primer có thể bám vào bất kỳ
vị trí nào có trình tự nucleotit bổ sung trên phân tử ADN genome. Với phần lớn
thực vật, mỗi đoạn mồi ngẫu nhiên tạo ra từ 2 - 10 sản phẩm nhân bản. Sau khi điện
di sản phẩm RAPD sẽ phát hiện sự khác nhau về phân đoạn ADN được nhân bản,
gọi là tính đa hình. Sản phẩm nhân bản được phân tích bằng điện di trên gel agarose
hoặc polyacrylamide và có thể quan sát được sau khi gel được nhuộm bằng hoá
chất chuyên dụng. Tính đa hình được nhận ra do sự có mặt hay vắng mặt của
cao và ổn định sản lượng lúa trong điều kiện nhiệt độ thấp là một đòi hỏi thực tiễn
trong sản suất nông nghiệp. Hướng nghiên cứu tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho
chọn dòng chống chịu bằng kỹ thuật nuôi cây mô - tế bào thực vật mới được quan
tâm nghiên cứu trong vài năm gần đây nhưng đã đạt được những kết quả nhất định.
Hiện nay, trong chọn giống người ta không chỉ quan tâm đến những tính
trạng hình thái, năng suất và chất lượng, mà còn quan tâm đến bản chất sinh học
phân tử của sự thay đổi các tính trạng. Một số kỹ thuật sinh học phân tử đã
được sử dụng để phân tích hệ gen, trong đó có kỹ thuật PCR và RAPD.
Copyright: Tài liệu đại học ©