BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
TRẦN THỊ LÝ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ ENZYME ðỂ
SẢN XUẤT ðƯỜNG CHỨC NĂNG XYLOSE TỪ LÕI NGÔ
DÙNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP
Chuyên ngành:
Công nghệ Sau thu hoạch
Mã số:
60.54.10
Người hướng dẫn khoa học:
1.
PGS.TS. Nguyễn Duy Lâm
Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… ii
LỜI CẢM ƠN
ðể hoàn thành ñề tài tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng của bản thân tôi ñã
nhận ñược rất nhiều sự quan tâm giúp ñỡ nhiệt tình của thầy cô, bạn bè và
người thân.
Trước tiên, tôi xin ñược bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn
Duy Lâm - Giám ñốc Trung tâm Nghiên cứu và Kiểm tra chất lượng nông sản
thực phẩm - Viện Cơ ñiện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch ñã tận
tình hướng dẫn, giúp ñỡ tôi trong quá trình thực hiện ñề tài và hoàn thành
bản luận văn này.
ðồng thời, tôi xin ñược cảm ơn Th.S. Nguyễn Tất Thắng - Viện Cơ ñiện
nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch ñã nhiệt tình giúp ñỡ và tạo mọi
1.2.2. Yêu cầu của đề tài
3
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
4
2.1. Giới thiệu chung về đường xylose
4
2.1.1. Đặc điểm của đường xylose
4
2.1.2. Các phương pháp sản xuất đường xylose …………………………
6
2.1.3. Ứng dụng của ñường xylose ……………………………………
10
2.2. Enzyme xylanase
12
2.2.1. Cấu tạo và cơ chế xúc tác của enzyme xylanase …………………
12
2.2.2. Nguồn enzyme xylanase ……………………………………………
14
3.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất …………………………………
26
3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu …………………………………
27
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iv
3.3. Nội dung nghiên cứu …………………………….………………
27
3.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm………………………………………
28
3.4.1. Sơ đồ qui trình xuất đường xylose từ lõi ngô…………………
28
3.4.2. Bố trí các thí nghiệm xác định các thông số công nghệ trong xử lý
nguyên liệu lõi ngô……………………………………………………… 30
37
4.1. Xác định các thông số công nghệ trong xử lý nguyên liệu lõi ngô …
37
4.1.1. Lựa chọn dung môi xử lý …………………………………………
37
4.1.2. Xác định tỷ lệ nguyên liệu/dung môi thích hợp trong xử lý lõi ngô
38
4.1.3. Xác định nhiệt độ thủy phân axit thích hợp trong xử lý lõi ngô……
40
4.1.4. Xác định thời gian thủy phân axit thích hợp trong xử lý lõi ngô…
42
4.2. Xác định các thông số của quá trình thủy phân dịch xylan thành
đường xylose bằng enzyme xylanase …………………………………… 43
4.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme xylanase đến hiệu quả thủy phân
xylan ………………………………………………………………………
43
4.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hiệu quả thủy phân xylan … 45
4.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình sấy khô đường … 56
4.4. Đánh giá chất lượng của đường xylose thành phẩm và đưa ra quy
trình sản xuất xylose từ lõi ngô …………………………………………
57
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ …………………………………
60
5.1. Kết luận ………………………….………………………………… 60
5.2. Đề nghị ………………………….…………………………………… 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO ………………………….………………… 61
PHỤ LỤC ………………………….…………………………………
66
Bảng 4.3. Ảnh hư
ởng của nhiệt độ thủy phân axit tới hiệu quả xử lý
lõi ngô 41
Bảng 4.4. Ảnh hưởng thời gian thủy phân axit tới hiệu quả xử lý lõi ngô.
42
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme xylanase đến hiệu quả thủy
phân dịch xylan lõi ngô
44
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hiệu quả thủy phân dịch
xylan lõi ngô 46
Bảng 4.7. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu quả thủy phân
dịch xylan lõi ngô 48
Bảng 4.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả thủy phân xylan …… 50
viii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1. Công thức cấu tạo của đường xylose
4
Hình 2.2. Công thức cấu tạo của Xylan
5
Hình 2.3. Công thức cấu tạo hóa học của một số loại xylan
6
Hình 2.4. Ứng dụng chính của đường Xylose
11
Hình 2.5. Tác ñộng của các loại enzyme xylanase lên mạch xylan ……
14
DANH MỤC CÁC SƠ ðỒ
Sơ đồ 3.1. Quy trình dự kiến sản xuất đường xylose bằng enzyme
xylanase ………………………………………………………………….29
Sơ đồ 4.14. Quy trình công nghệ sản xuất đường xylose từ lõi ngô……
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 1
PHẦN I. MỞ ðẦU
1.1. ðặt vấn ñề
Thực phẩm chức năng là loại thực phẩm được chế biến từ các nguyên
liệu tự nhiên như các nguồn thực vật và động vật giàu hoạt chất sinh học.
Thực phẩm chức năng giúp cho con người duy trì và tăng cường sức khỏe,
kéo dài tuổi thọ, phòng và chữa được nhiều bệnh hiểm nghèo. Trong các
nhóm thực phẩm chức năng thì đường chức năng là một bộ phận quan trọng,
được tập trung nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây do có các đặc tính
sinh học có lợi cho sức khỏe như phòng chống bệnh tiểu đường, không gây
béo phì, có khả năng kích thích hoạt động của hệ tiêu hóa… Các loại đường
chức năng phổ biến hiện có là đường xylooligosaccharide, panatinose,
maltitol, fructooligosaccharide, xylose, lactitol, galactooligosaccharide. Trong
số đó, đường xylose đang có xu hướng gia tăng ở nhiều quốc gia trên thế giới
với các ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm như
làm chất phụ gia thực phẩm, bổ sung vào các loại đồ uống dinh dưỡng, làm
nguyên liệu đầu của thuốc tổng hợp điều trị bệnh ung thư, phòng chống một
số bệnh (tiểu đường, mất ngủ, đường ruột,…).
Xylose là một đường năm cacbon có công thức phân tử C
5
H
10
0
5
còn
được chủng Aspergillus niger DL1 cho hiệu suất chuyển hóa xylan thành
đường xylose đạt 70,38% [4]. Từ năm 2011, nhóm tác giả của Viện đang có
những nghiên cứu sâu rộng trong khuôn khổ thực hiện đề tài cấp Nhà nước
với mục tiêu xây dựng được qui trình công nghệ sản xuất đường xylose từ lõi
ngô bằng phương pháp của công nghệ sinh học.
Được sự đồng ý của Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu
hoạch cho tham gia thực hiện một phần đề tài nêu trên, chúng tôi đã tiến hành
nghiên cứu với chủ đề “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme ñể sản
xuất ñường chức năng xylose từ lõi ngô dùng trong công nghiệp thực
phẩm”
1.2. Mục ñích và yêu cầu của nghiên cứu
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 3
1.2.1. Mục ñích của nghiên cứu
Xác định được các thông số cơ bản của các công đoạn chính trong quy
trình sản xuất đường xylose từ lõi ngô bằng phương pháp thủy phân enzyme
dùng trong công nghiệp thực phẩm.
1.2.2. Yêu cầu của nghiên cứu
- Xác định các điều kiện xử lý nguyên liệu tạo dịch xylan;
- Xác định các điều kiện thủy phân dịch xylan bằng enzyme xylanase;
- Xác định một số thông số công nghệ của quá trình thu hồi và làm sạch
đường xylose quy mô phòng thí nghiệm;
- Đánh giá chất lượng của đường xylose thành phẩm và đưa ra quy
trình sản xuất xylose từ lõi ngô.
Xylose là thành phần chủ yếu thuộc đường pentose, cùng với glucose là
hai nhóm đường chính thu được khi thủy phân hemicellulose trong nguyên liệu
gỗ và chất thải nông nghiệp. Khi thủy phân hemicellulose bằng axit có thể giải
phóng ra nhiều loại đường khác nhau ngoài đường xylose như D - galactose, D -
glucose, D - mannose và L - arabinose. Kèm theo đó còn là các sản phẩm thủy
phân khác như fucfural, 5 - hydroxymethyl fucfural, axit acetic, axit syringic
[32].
Khi một chuỗi các nhóm xylose liên kết với nhau qua liên kết β - (1 - 4)
glycoside và phân nhánh bởi các chuỗi carbonhydrate ngắn như axit D -
glucuronic hoặc đồng phân của nó 4 - O - methylether, α - arabinose hoặc các
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 5
Oligosaccharide tạo thành từ D - xylose, L - arabinose, D - hay L - galactose
và D - glucose sẽ tạo thành xylan.
Cấu tạo của xylan được thể hiện qua hình 2.2.
Hình 2.2. Công thức cấu tạo của xylan
Thành tế bào thực vật là một vật liệu phức tạp trong đó cellulose chiếm
35-50%, hemicellulose chiếm 20-30%. Xylan là thành phần chính cấu tạo nên
hemicellulose. Xylan được tìm thấy chủ yếu trong cấu trúc thứ cấp của thành
tế bào thực vật và tạo thành pha giữa giữa lignin và các hợp chất
polysaccharide khác [28].
Xylan gồm nhiều loại khác nhau, có thể được chia thành homoxylan và
heteroxylan bao gồm: glucuronoxylan, (arabino) glucuronoxylan, (glucurono)
arabinoxylan, arabinoxylan và tổ hợp heteroxylan. Homoxylan có cấu tạo bao
gồm các xylopyranose được liên kết với nhau bởi liên kết β - (1 - 3) glycoside
hoặc hỗn hợp β - (1 - 3, 1 - 4) glycoside. Cấu tạo kiểu homoxylan được tìm
thấy trong tảo biển Palmariales và Nemaliales. Heteroxylan có cấu tạo là các
chuyển thành xylose. Sau phản ứng dịch hydro hóa được kết tinh để thu hồi
đường xylose. Phương pháp này có ưu điểm là hiệu suất thuỷ phân cao, ít yêu
cầu về công nghệ nhưng có nhược điểm là gây hao mòn thiết bị, tạo sản phẩm
có độ tinh khiết thấp và không an toàn cho người sử dụng nếu chưa xử lý hết
lượng acid dùng để thuỷ phân, gây ô nhiễm môi trường bởi lượng acid thải ra.
Các nghiên cứu trước đây đưa ra quy trình sản xuất đường xylose từ
nguyên liệu lignocellulose có chứa hemicellulose, quy trình bao gồm các
bước như sau:
- Thủy phân lignocellulose với nước để tạo ra phần hoà tan và phần
không hoà tan. Phần hoà tan có chứa đường xylose, phần không hoà tan có
chứa lignin và cellulose.
- Tách phần không tan từ dịch thuỷ phân.
- Xử lý phần hoà tan có chứa đường xylose để dịch chuyển các chất
hữu cơ và các ion ra ngoài.
- Tập trung phần có chứa đường xylose thành dạng sirô có chứa 20% -
40% nước.
- Trộn sirô với ethanol để tạo thành dạng ethanolic hòa tan và kết tinh
đường xylose từ dạng ethanolic hòa tan.
Trong sản xuất xylose từ nguyên liệu lignocellulose quy mô thương
mại, vấn đề quan trọng là phải giảm thiểu tối đa lượng xylose bị mất đi khi
tách xylose ra khỏi sản phẩm sau thủy phân. Quy trình sản xuất đường xylose
từ nguyên liệu lignocellulose quy mô thương mại gồm các bước như sau:
Bước 1: Thủy phân nguyên liệu bằng dung dịch axit để tạo ra hai phần.
Phần hoà tan chứa xylose và phần không hòa tan chứa lignin và cellulose.
Dung dịch axit nên được sử dụng ở nồng độ 0,5 - 5%. Có thể sử dụng axit vô
cơ (như axit H
2
SO
4
, HCl hoặc H
được giữ trong thời gian 10 - 18 giờ, thỉnh thoảng lắc để xylose kết tinh.
Phản ứng thủy phân ở bước 1 có thể được tiến hành ở dạng liên tục
hoặc gián đoạn. Sự có mặt của những oligosaccharide có thể ảnh hưởng đến
quá trình kết tinh của xylose. Chính vì vậy, dịch thuỷ phân cần phải loại bỏ
hoặc khử bớt lượng oligosaccharide có trong dịch bằng cách gia nhiệt dịch
xylose đến nhiệt độ 50 - 150
o
C duy trì trong khoảng 2 phút đến 2 giờ có bổ
dung axit ở nồng độ 0,5 - 5%. Tinh thể xylose được sản xuất ra từ bước 5
được rửa sạch bằng dung dịch ethanol có nồng độ 90% để nâng cao độ tinh
sạch và đáp ứng tiêu chuẩn chế biến tốt hơn.
2.1.2.2. Sản xuất ñường xylose bằng phương pháp lên men nhờ vi sinh vật
a) Sản xuất xylose bằng phương pháp lên men nhờ vi sinh
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 9
Với phương pháp sản xuất xylose bằng phương pháp lên men nhờ vi sinh
vật xylose được sản xuất từ các nguyên liệu giàu xylan. Nguyên liệu trước hết
được thủy phân để tạo thành dung dịch chứa xylan. Sau đó các vi sinh vật sử
dụng xylan làm nguồn cacbon để lên men dịch thủy phân [32]. Đường xylose
được thu hồi bằng phương pháp cô quay chân không và sấy phun. Sản xuất
xylose theo phương pháp lên men xylan nhờ vi sinh vật có nhiều ưu điểm hơn
so với phương pháp hóa học như tạo ra sản phẩm an toàn hơn, không gây ô
nhiễm môi trường hay làm hao mòn thiết bị. Phương pháp này có nhược điểm
là công nghệ yêu cầu cao hơn, hiệu suất thuỷ phân thấp hơn so với phương
pháp hoá học. Việc thu nhận và tinh sạch đường xylose gặp nhiều khó khăn
do dịch lên men ngoài đường xylose còn lẫn rất nhiều tạp chất như đạm, muối
vô cơ, acid amin. Đường xylose lại dễ tạo phản ứng Maillard với axit amin
tạo sản phẩm có màu sẫm.
chủng mấm mốc để sản xuất đường xylose [28].
Năm 1986 Allenza và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất xylose bằng
enzyme xylanase sinh ra từ chủng Aureobasidium plll/ulam Y-2JII·1 trên hai
dạng enzyme xylanase cố định và tự do ở nhiệt độ 40
o
C, pH =4,5 - 4,75 [30].
Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng thủy phân xylan thành xylose ở cả hai
dạng là gần như nhau (0,16% khối lượng đối với xylanase ở dạng tự do và
0,21% khối lượng đối với xylanase ở dạng cố định). Hoạt tính enzyme ở dạng
tự do sau 16 giờ còn 54% trong khi hoạt tính của xylanase dạng cố định chỉ
còn 47% sau 16 giờ.
Năm 2009 Goldman nghiên cứu quá trình thủy phân xylan thành đường
xylose bằng enzyme xylanase [29]. Kết quả nghiên cứu cho thấy enzyme
xylanase từ các chủng nấm mốc khác nhau ảnh hưởng khác nhau đến khả
năng thuỷ phân xylan. Enzyme xylanase sinh ra bởi chủng Aspergillus niger
AN-1.15, sau 5 giờ có 70% saccharide chuyển thành xylan. Enzyme xylanase
sinh ra bởi chủng Thermobifida fusca sau 30 phút ở 70
o
C chuyển hóa được
10% xylan. Enzyme xylanase sinh ra bởi chủng Trichoderma sp. K930 chỉ có
1,4% saccharide chuyển thành xylan [29].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 11
2.1.3. Ứng dụng của ñường xylose
Xylose là một loại đường tự nhiên có nhiều ứng dụng trong thực tế.
Hiện nay, xylose đã và đang được sử dụng rộng rãi trong nhiều loại sản phẩm
khác nhau ở nhiều quốc gia trên thế giới. Phạm vi ứng dụng của xylose chủ
yếu thuộc về hai lĩnh vực chính là công nghiệp thực phẩm và dược phẩm [13].
12
chế biến thịt quay, bánh mì…. Vì xylose là một nguồn saccharide lý tưởng
cho các phản ứng Maillard để sản xuất các chất tăng cường hương vị với thời
gian phản ứng ngắn hơn so với các đường 6 cacbon khác [11].
2.1.3.2. Trong lĩnh vực y dược
Không giống như đường glucose và fructose, đường xylose là nguồn
năng lượng lý tưởng để sản xuất nước uống giàu năng lượng không gây cao
đường huyết. Xylose bị hấp thu rất ít ở ruột non, đến ruột già xylose bị hấp
thu vào tế bào của vi sinh vật đường ruột. Tại ruột già xảy ra phản ứng lên
men lên sinh ra axit hữu cơ khiến pH hạ thấp ức chế nhóm vi khuẩn có hại,
kích thích vi khuẩn có lợi Bifidobacteria phát triển giúp cải thiện hệ tiêu hoá
của con người, giảm huyết áp, lipid và cholesterol trong máu [11].
2.2. Enzyme xylanase
2.2.1. Cấu tạo và cơ chế xúc tác của enzyme xylanase
2.2.1.1. Cấu tạo của enzyme xylanase
Các xylanase có cấu tạo gồm nhiều chuỗi polypeptide xoắn lại với nhau
tạo cấu trúc bậc 2 và tiếp tục cuộn xoắn trong không gian để tạo thành cấu
trúc bậc 3. Các chuỗi có cấu trúc bậc 3 kết hợp với nhau tạo cấu trúc bậc 4
[31]. Ở mức phân tử protein, xylanase gồm vùng chức năng, vùng không chức
năng và vùng nối. Vùng nối thường có nhiều amino axit, hydroxyl được
glycosyl hóa ở vị trí O. Sự glycosyl hóa này giúp chúng không bị enzyme
protease phân cắt. Vùng chức năng được chia thành vùng xúc tác và vùng
bám cơ chất, hai vùng này có thể tách biệt nhau về cấu trúc hoặc không. Tính
chất của xylanase có mối tương quan rất lớn đến các gốc hydro liên kết với
các xylanase. Nếu xylanase có tính bazơ thì amino axit là asparagines,
xylanase có tính axit thì amino axit là aspartic [28].
2.2.1.2. Cơ chế xúc tác của enzyme xylanase
Cơ chế hoạt động của xylanase bao gồm các bước sau [6, 29]:
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
2.2.1.3. Enzyme xylanase và sự thuỷ phân xylan
Thủy phân xylan bằng enzyme là quá trình để phá vỡ chuỗi xylan thu
được từ quá trình tiền xử lý lõi ngô thành các phân tử đường xylose bằng tác
dụng của các enzyme thủy phân. Quá trình này còn được gọi là quá trình
đường hóa. Xylan có cấu tạo phức tạp và nguồn xylan phong phú nên các
enzyme xylanase có cấu tạo cũng rất phức tạp. Mỗi loại vi sinh vật khác nhau
sẽ thu được sẽ khác nhau. Hầu hết enzyme xylanase từ các chủng vi sinh vật
đều chứa trên một hoạt tính. Để phân giải xylan thành xylose cần tác dụng
đồng thời của 2 loại enzyme chính bao gồm: endoxylanase (còn được gọi là β-
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 14
1,4-xylanase, β-D-xylanase hay Endo-1,4-β-D-xylanase) và β-xylosidase.
Endo-xylanase thường cắt mạch chính của xylan ở những điểm bất kỳ tại giữa
mạch và giải phóng olygoxylose. Sau đó, β-xylosidase cắt các đoạn
olygoxylose để giải phóng đường đơn xylose. Ngoài ra còn cần thêm các loại
enzyme để phân cắt đường chuỗi bên như α-L-arabinofuranosidase, α-
glucuronidase…[28]. Nguyên tắc các enzyme thuỷ phân mạch xylan được mô
tả trong hình 2.5.
Hình 2.5. Tác ñộng của các loại enzyme xylanase lên mạch xylan
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 15
2.2.2. Nguồn enzyme xylanase
Trong thời gian gần đây việc nghiên cứu sản xuất enzyme xylanase đã
thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học, trong đó các công trình
nghiên cứu sản xuất enzyme xylanase chủ yếu từ vi sinh vật như nấm và vi
khả năng sinh ra nhiều enzyme xylanase trên các cơ chất tự nhiên, phế phụ
Copyright: Tài liệu đại học ©