i
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn, em luôn
nhận được sự quan tâm giúp đỡ rất tận tình của thầy cô hướng dẫn, nhân dịp
này, em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:
TS. Tạ Thị Minh Ngọc , người đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình giúp
đỡ em trong suốt quá trình em nghiên cứu, hoàn thành đề tài, đồng cảm ơn
ThS. Trần Hải Đăng, người đã phụ hướng dẫn em rất nhiệt tình và tâm huyết.
Em xin chân thành cảm ơn các anh chị cán bộ phòng thí nghiệm đã tạo
điều kiện giúp đỡ em rất tận tình về máy móc, thiết bị trong suốt quá trình làm
luận án.
Qua đây, em cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới
Ban Giám
đốc Viện CHSH & MT, các thầy giáo, cô giáo bộ môn đã chỉ dẫn, giảng dạy
em trong suốt 4 năm học qua và đã tạo những điều kiện thuận lợi để em hoàn
thành luận văn này.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè, những người
luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình em thực hiện đề tài.
Nha Trang, tháng 6 năm 2012 An Thị Tươi
ii
`MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
2.2.2. Các hóa chất 32
2.2.3. Các chất chuẩn 36
2.2.4. Dụng cụ 36
2.3. Phương pháp nghiên cứu 36
2.3.1.Tách chiết carotenoids từ các nguồn khác nhau 36
2.3.1.1. Tách chiết carotenoids từ cà rốt và gấc 36
2.3.2. Chuyển hóa carotenoids thành chất thơm 40
2.3.2.1 Tạo hợp chất thơm nhờ quá trình tự oxy hóa của carotenoids 40
2.3.2.2. Tạo hợp chất thơm nhờ quá trình bổ sung Enzyme để oxy hóa
carotenoids 41
2.4. Phương pháp phân tích 42
2.4.1. Phương pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS 42
2.4.2. Phương pháp sắc kí bản mỏng TLC 44
2.4.3. Phân tích các thành phần chất thơm bằng sắc kí khí (GC) 46
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47
3.1. Kết quả tách chiết carotenoids từ các nguồn khác nhau. 47
3.2. Kết quả sắc kí bản mỏng TLC 49
3.3. Sự phân rã của carotenoids/β-carotene trong quá trình tự oxy hóa. 52
iv
3.3.1. Khảo sát sự phân rã β-carotene từ các carotenoids có nguồn gốc khác nhau.
52
3.3.2. Nghiên cứu khảo sát sự tạo thành các chất thơm trong phản ứng tự oxy hóa
carotenoids từ dầu gấc 54
3.4. Nghiên cứu khảo sát sự tạo thành các chất thơm từ carotenoids dầu gấc trong
phản ứng đồng oxy hóa sử dụng enzyme xanthine oxydase 55
3.5. Khảo sát sự phân rã β-carotene tách chiết từ sinh khối nấm sợi B.trispora và tạo
thành chất thơm trong phản ứng đồng oxy hóa sử dụng enzyme xanthine oxidase 57
3.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzyme và cơ chất đến sự phân rã β-
carotene tách chiết từ sinh khối nấm sợi B. trispora và hình thành chất thơm trong quá
Hình 1.1. Cấu trúc tinh thể enzyme Xanthine oxidase tách chiết từ bò 28
Hình 1.14. Một số apocarotenoid tạo thành khi phân cắt beta-caroten 30
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình tách chiết carotenoids từ cà rốt và Gấc. 39
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình tách chiết carotenoids từ nấm sợi 39
Hình 2.3. Phổ hấp thụ của Lycopene trong mẫu chuẩn và mẫu dầu Gấc 43
Hình 2.4. Phổ hấp thụ của beta-carotene trong mẫu chuẩn và mẫu dầu Gấc 43
Hình 3.2. Kết quả phân tích TLC carotenoids/β-carotene từ dầu Gấc và từ Beta-
carotene tinh khiết 50
Hình 3.3. Phổ hấp thụ thu được từ bản sắc kí, giống với phổ của 51
beta-carotene 51
Hình 3.4. Phổ hấp thụ thu được từ bản sắc kí, giống với phổ của Lycopene 51
Hình 3.5: Sự thay đổi hàm lượng β-carotene từ các nguồn khác nhau theo thời gian 53
Hình 3.6. Sự phân rã β-carotene tách chiết từ sinh khối nấm sợi B.trispora trong quá
trình đồng oxy hóa sử dụng enzyme XO ở các nồng độ khác nhau 60
Hình 3.7. Biểu đồ hiệu suất chuyển hoá β-cyclocitral với các nồng độ enzyme và cơ
chất khác nhau 61
Hình 3.8. Biểu đồ hiệu suất chuyển hoá β-ionone với các nồng độ enzyme và cơ chất
khác nhau 62
Hình 3.9. Biểu đồ hiệu suất chuyển hoá DHA với các nồng độ enzyme 62
và cơ chất khác nhau 63
vi DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ
Bảng 1.1. Quang phổ hấp thụ của một số carotenoids điển hình 6
Bảng 1.2. Ảnh hưởng của phương thức chế biến đến hàm lượng beta-carotene 9
Bảng 1.3: Bảng thành phần của beta-carotene trong 1 số loài thực vật phổ biến tại Việt
Nam……………………………………………………………………………………17
Bảng 1.4. Hàm lượng một số carotenoids trong các mẫu thực vật…………………….18
Bảng 1.5. Lượng beta-carotene có trong 100g thực phẩm Error! Bookmark not
HPLC
High-performmance liquid chromatography
LOX
Lipoxygenases
OD
Optical Density
TLC
Thin layer chromatography
UV/VIS
Ultraviolet-visible spectrophotometry
XO
Xanthine oxidase
HSCH
Hiệu suất chuyển hóa 1
MỞ ĐẦU
Từ thời xa xưa, khi mà công nghệ sản xuất chất thơm chưa được biết đến
con người đã biết dùng hoa, lá của các loại thực vật (như hoa hồng) để nấu nước
tắm, gội đầu cho thơm. Ngày nay, khi đời sống ngày càng phát triển, xã hội càng
văn minh thì các chất thơm được sản xuất và sử dụng ngày càng đa dạng và
phong phú cả về số lượng lẫn chất lượng. Chất thơm có thể lấy từ nguồn thiên
1. Thu nhận nguồn carotenoids từ các nguồn thực vật khác nhau.
2. Chuyển hóa carotenoids thành chất thơm.
3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về carotenoid
1.1.1. Các hợp chất carotenoid
Carotenoid là một dạng sắc tố hữu cơ có tự nhiên trong thực vật và các
loài sinh vật quang hợp khác như là tảo, một vài loài nấm và một vài loài vi
khuẩn. Hiện nay người ta đã tìm được 600 loại carotenoid, sắp xếp theo hai
nhóm, xanthophylls và carotene (Rao và Rao, 2007). Carotenoid thuộc nhóm
tetraterpenoids (phân tử chứa 40 nguyên tử C) được tạo nên bởi 8 đơn vị
isoprenne:
CH2 = C – CH = CH2
|
CH3
Carotenoid là nhóm chất màu hòa tan trong chất béo, không tan trong
nước, có màu từ vàng nhạt tới đỏ sậm tùy cấu trúc phân tử. Khác với cây cỏ, con
người không thể tự tổng hợp ra carotenoid mà sử dụng carotenoid từ việc ăn thực
vật nhằm bảo vệ bản thân mình. Carotenoid giúp chống lại các tác nhân oxy hóa
từ bên ngoài.Thiên nhiên có đến khoảng 600 loại carotenoid khác nhau, trong đó
có 50 loại carotenoid hiện diện trong thực phẩm. Thế nhưng trong máu của người
có khoảng 15 loại được tìm thấy và chúng đang được chứng minh là đóng vai trò
quan trọng đối với đời sống con người.
Carotenoid không phải là tên riêng của một chất nào mà là tên của một
nhóm các hợp chất có công thức cấu tạo tương tự nhau và tác dụng bảo vệ cơ thể
cũng tương tự nhau. Carotenoid khá quen thuộc với chúng ta là β-caroten hay
còn gọi là tiền chất của vitamin A. Trong những năm gần đây người ta còn nói
nhiều đến các carotenoid khác như lycopen, lutein và zeaxanthin
petroleum ether…, ít tan trong các dung môi phân cực như methanol, ethanol và
không tan trong nước. 5
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của β-caroten
(Nguồn: internet)
c. Lycopen:
Đây là dạng đồng phân mở vòng hai đầu của β- carotene. Lycopene có
màu đỏ nhạt (do nhiều liên kết đôi của cacbon kết hợp với nhau) có nhiều trong
các loại quả có màu đỏ ví dụ như cà chua. Lycopene không tan trong nước và
không có khả năng chuyển hoá thành vitamin A.
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của Lycopene
( Nguồn : Internet)
1.1.2.2 Nhóm xanthophyll
Xanthophyll - C40H56On (n : 1- 6) là dẫn xuất dạng oxi hoá của caroten,
có chứa từ 1 đến 6 phân tử oxy, ví dụ như: Cripthoxanthin (C40H56O ), Lutein
(C40H56O2), Violaxanthin (C40H56O4)… Các nguyên tử oxi liên kết trong các
nhóm hidroxy, cacboxy, axetoxy, metoxy, epoxy…Bước sóng hấp thụ của cực
đại của xanthophyll ở 451 - 481 nm.
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của lutein và zeaxanthin
6
( nguồn: Internet)
1.1.3 Tính chất vật lý và tính chất quang phổ
Trong thực vật, động vật, carotenoid có thể ở dạng tinh thể chất rắn vô
461
491
448
474
505
Chlorofor
m
433
457
484
435
461
485
446
475
509
Hexane,
Petroleum
ether
422
445
473
425
450
477
437
462
494
444
470
502
7
thành vitamin A). -carotene có màu cam, thường thấy trong các loại trái cây và
rau quả có màu cam như cà rốt, bí ngô, đào, khoai lang đỏ…nhiều nghiên cứu đã
chứng tỏ vai trò và ích lợi của beta-carotene trên hệ miễn dịch, ngăn ngừa nhiều
loại ung thư và giảm tác hại của ánh nắng mặt trời.
1.1.5.1.1. Cấu trúc hóa học
Βeta-carotene có công thức hóa học gần giống như lycopene nhưng khác
nhau về cấu trúc. Phân tử có 9 liên kết đôi và kết thúc bộ khung cacbon là 2 vòng
β-ionone. Cấu trúc đặc biệt xác định các thuộc tính đặc biệt của β- carotene.
9 Hình 1.5: cấu trúc hóa học của β- carotene
(nguồn: Internet)
1.1.5.1.2. Tính chất hóa lý
a. Tính chất vật lý
Là một trong các carotenoids , β-carotene sở hữu tất cả các tính
chất đại diện của hợp chất này. Nó hòa tan trong hầu hết các dung môi hữu cơ và
bị hấp thụ bởi ánh sáng. Sự hấp thụ lớn nhất của β-carotene trong ete dầu mỏ là
tại 3 bước sóng 425, 451 và 478 nm (Gross, 1991). β-carotene bền hơn ở nhiệt độ
ổn định. Tỉ lệ phần trăm của β-carotene không được duy trì ở các điều kiện chế
biến khác nhau, điều này được tóm tắt trong bảng 1.2. Mặc dù vậy all-trans β-
carotene chiếm ưu thế hơn, khoảng 20 đồng phân cis được tìm thấy trong cà rốt,
tiêu và củ sắn. Kéo dài thời gian nấu nướng sẽ làm tăng thêm quá trình đồng
phân hóa.
21
99
89.1
Chế biến ướt/ khô
21/15
99/200
68.8
b. Tính chất hóa học
Công thức hóa học của β-caroten là C40H56 với khối lượng phân tử là
536,88 (đvc).
β-caroten là một dẫn xuất isopen chưa bão hòa. β-caroten có dạng tinh thể
hình kim, màu nâu đỏ. β-caroten bền trong môi trường kiềm và không bền môi
trường axit. β-caroten tan trong dầu và các dung môi hữu cơ như axetone, etyl-
ete, methanol… đặc biệt tan tốt trong dầu, ete, hexane, β-caroten không tan trong
nước.Nhờ có hệ thống nối đôi liên hợp dài mà β-caroten có ái lực mạnh với oxy
đơn bội nên dễ bị oxy hóa, đồng phân hóa khi tiếp xúc với không khí, ánh sáng
hay nhiệt độ.
β-carotene nhạy cảm với oxy , sự đồng phân hóa xảy ra dưới sự ảnh
hưởng bởi ánh sáng, nhiệt độ, và oxy. Vì vậy phải giữ ở điều kiện tránh ánh sáng,
bảo quản trong bao bì kín với nitro hoặc argon trong thời gian sử dụng dài.
1.1.5.1.3. Tính chất sinh học
12
hiện nay chủ yếu tập trung vào sản xuất β-caroten theo con đường sinh tổng hợp
tự nhiên.
Đối với β-caroten khi ở dạng tiền vitamin A, nó bảo vệ nhiễm sắc tố da
chống lại hiệu ứng có hại của các tia tử ngoại. Người ta khuyên nên dùng bổ sung
β-caroten trước khi làm việc lâu dài dưới ánh nắng mặt trời. Nó có thể giúp da
phòng chống bệnh ung thư da trong một thời gian dài.
Dựa trên các nghiên cứu, người ta đã kết luận rằng β-carote cùng với
vitamin C, E, đồng, mangan thì vitamin A, β-carotene có vai trò quyết định đến
sự ngăn ngừa, chống lại các gốc tự do (các chất tự do kém bền và hoạt động
mạnh. Nó có khả năng kết hợp với các phân tử khác, đặc biệt là lipid và gây nên
một phản ứng dây chuyền cực kỳ nguy hiểm đối với tế bào và là nguồn gốc của
các căn bệnh như tim mạch, quá trình lão hóa, giảm trí nhớ, ung thư…) (Young
và cộng sự 2003).
Đối với động vật có vú, β-caroten giữ chức năng sinh học quan trọng
trong quá trình phát triển các thể như: phát triển thị giác, vị giác, tăng đáp ứng
miễn dịch, tăng sự sinh sản và tạo tinh trùng. Tác động chủ yếu của β-caroten
không chỉ là chống oxy hóa mà còn trao đổi thông tin từ tế bào này đến tế bào
khác, tác động tới cấu trúc và chức năng của màng tế bào, tăng cường sự đáp ứng
miễn dịch của cơ thể. Chính vì vậy mà nó được xác định là chất điều hòa dinh
dưỡng.
Đặc biệt, β-caroten không độc đối với cơ thể khi sử dụng ở liều lượng cao
và kéo dài, trong khi nếu ta sử dụng vitamin A kéo dài và với liều cao thì sẽ gây
rối loạn thị giác, rố loạn chức năng gan. Nguyên nhân chính là do cơ thể chuyển
hóa β-caroten thành vitamin A khi có nhu cầu. Chỉ 1/6 lượng β-caroten chuyển
thành vitamin A (Goodwin, 1980).
β-caroten có hai đồng phân trans- và cis-β-caroten, trong đó, trans-β-
caroten có thể chuyển thành dạng cis-β-caroten. Dạng đồng phân trans β-caroten
con người có thể hấp thụ và sử dụng được. Hiện tại thì các nghiên cứu chỉ ra rằng
14
Về màu thực phẩm: màu đỏ cam của Lycopene và β- carotene có nguồn
gốc tự nhiên đã được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm và nước giả khát, chúng
được cho là an toàn hơn các màu nhân tạo khác. Những sắc tố này có thể được
tổng hợp hoặc chiết xuất từ những nguồn tự nhiên. Chúng được tăng cường và
sửa chữa hoặc đóng góp từ màu thực phẩm như cam, kẹo , bơ, pho mát và nước
mắm. Và xa hơn nữa , chúng có thể được sử dụng như là chất chống oxy hóa để
kéo dài tuổi thọ của sản phẩm.
Về vấn đề bổ sung dinh dưỡng : β- carotene được coi như là chất có hoạt
tính như provitamin A. nó được bổ sung vào thực phẩm để làm tăng giá trị dinh
dưỡng trong các sản phẩm đặc biệt như sữa, nước uống tăng lực và nước trái cây.
β- carotene có thể được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để làm tăng chất lượng
của trứng và sữa.
Về thành phần dược phẩm : lycopene và β- carotene tinh khiết được sử
rộng rãi trong các sản phẩm dược phẩm như các vitamin dạng viên được bổ sung
dần dần hoặc cho các bệnh nhân thiếu hụt vitamin. Nó còn là thành trong thuốc
kết hợp chống lại bệnh ung thư. Mặc dù mới chỉ gần đây , lycopene mới được sử
dụng trong ngành công nghiệp dược phẩm , nhưng rất nhiều sản phẩm có nguồn
gốc lycopene được tìm thấy trong các lĩnh vực thương mại như chất hỗ trợ chống
oxy hóa, sức khỏe tim mạch và da. Không chỉ là những chất màu trong thực
phẩm , lycopene và β-carotene còn có rất nhiều ứng dụng quan trọng trong việc
điều chế thuốc chống ung thư và hỗ trợ điều trị bệnh ung thư, nó có nhu cầu cao
trong việc điều trị cho hơn 10 triệu bệnh nhân mắc bệnh ung thư mỗi năm.
(Frankish, 2003).
1.1.5.2. Lycopene
Việc tiêu thụ nhiều rau và trái cây trong chế độ dinh dường hàng ngày được xem
là một yếu tố quan trong để đảm bảo sức khỏe. Các bà nội trợ hiện nay thường
bố về sự nghiên cứu liên quan đến lycopene trong việc ngăn ngừa sự suy thóai
16
tim mạch, ung thư tiền tuyến liệt và bao tử đến đường ruột đều liên quan đến hoạt
tính sinh học của Lycopene.
Rất nhiều các khoa học gia cho rằng càng tiêu thụ nhiều cà chua thì đồng
thời làm giảm đi nhiều dạng ung thư (cancer types) trong cơ thể, vì cà chua có
chất chống oxy hóa, và lycopene được coi là những yếu tố quan trọng trong việc
bảo vệ sức khỏe. Các thí nghiệm và kết luận về lycopene trong việc ngăn ngừa
ung thư được các nhóm nghiên cứu cho rằng chính lycopene là nhân tố chủ yếu
trong việc ngăn ngừa và ức chế các lọai bướu (lành hay dữ) có hiệu quả cao nhất.
1.1.6. Các nguồn carotenoids trong tự nhiên
Carotenoids là sắc tố tự nhiên tạo ra màu vàng, da cam, đỏ trong rất nhiều
các loại hoa quả( gấc , chanh, đào, mơ, cam, nho, ); rau ( cà rốt, cà chua,…);
nấm và hoa; chúng còn có mặt trong hầu hết các loài động vật cũng như các sản
phẩm từ động vật như : trứng, tôm, cá,…
Theo kết quả điều tra của các nghiên cứu trước đây, trong giới thực vật,
nguồn carotenoids phổ biến nhất có mặt trong quả Gấc, và một số loài thực vật
quen thuộc như cà rốt, cà chua, đu đủ, rau ngót, … trong giới vi sinh vật, người
ta đã nghiên cứu và thu nguồn carotenoids từ sinh khối nấm sợi.
Sau đây là bảng thành phần của beta-carotene trong 1 số loài thực vật
phổ biến tại Việt Nam (điều tra hợp chất carotenoids trong một số loài thực vật
ở VN, nguồn tạp chí khoa học DDHQGHN, Khoa học tự nhiên và công nghệ 23
(2007) 130-134). 17
Bảng 1.3: Bảng thành phần của beta-carotene trong 1 số loài thực vật
18
các điều đó là phụ thuộc vào hàm lượng lycopene, β-carotene và lutein có trong
mỗi loài thực vật.
Sau đây là bảng hàm lượng các carotenoids quan trọng có trong các mẫu
thực vật.
Bảng 1.4. Hàm lượng một số carotenoids trong các mẫu thực vật
1.1.6.1. Nguồn carotenoids từ Gấc
1.1.6.1.1. Gấc
Gấc có tên khoa học là Momordica cochinchinesis (Lour) Spreng, họ Bí
(Cucurbitaaceae) bộ Violales. Gấc còn có tên khác là Muricia cochinchinensis
Lour., Momordica macrophylla Gage, Momordica mixta Roxburgh.Ở một số
nước Gấc còn được gọi là: Mộc Miết (Trung Quốc), Spiny bittercucumber,
Chinese cucumber (Anh), Makkao (Khơ Me),…
Copyright: Tài liệu đại học ©