Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
ĐẠI HỌC THÁI NGUN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM
VŨ THỊ HẢI
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG ĐỊA LAN
TRẦN MỘNG XN (CYMBIDIUM LOWIANUM)
BẰNG PHƢƠNG PHÁP NI CẤY IN VITRO. LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP
THÁI NGUN - 2013
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan, số liệu và kết quả nghiên cứu trong Luận văn này là hồn
tồn trung thực, có thực tiễn; chƣa đƣợc bảo vệ ở bất kỳ một hội đồng khoa
học hay học vị nào.
Tơi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn dều đã
đƣợc cảm ơn và các thơng tin trích dẫn trong Luận văn này đều đƣợc chỉ rõ
nguồn gốc.
Tác giả luận văn
Vũ Thị Hải
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
ii
LỜI CẢM ƠN
Với mong muốn góp phần cơng sức cho sự phát triển giống lan Trần
MỤC LỤC
1
CHƢƠNG I TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 4
1.1 Khái niệm về nhân giống in vitro 4
1.2 Giới thiệu về họ lan 4
n 8
1.4 Thành tựu đạt đƣợc trong ni cấy mơ hoa lan 9
1.4.1 Nghiên cứu trên thế giới 9
1.4.2 Nghiên cứu ở Việt Nam 10
1.5 Cơ sở khoa học của ni cấy mơ in vitro 12
1.5.1 Dựa trên tính tồn năng của tế bào 12
1.5.2 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào 12
1.6 Quy trình nhân giống in vitro 13
1.6.1 Giai đoạn 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ 13
1.6.2 Giai đoạn 2: Ni cấy khởi động 14
1.6.3 Giai đoạn 3: Nhân nhanh 14
1.6.4 Giai đoạn 4: Tạo cây in vitro hồn chỉnh 14
1.6.5 Giai đoạn 5: Thích ứng cây in vitro ngồi điều kiện tự nhiên 15
1.7 Các phƣơng thức nhân giống vơ tính in vitro 15
1.7.1 Hoạt hóa chồi nách 15
1.7.2 Tạo chồi bất định 15
1.7.3 Tạo phơi vơ tính 16
1.8 Một số trƣờng hợp thƣờng gặp trong q trình ni cấy in vitro . 16
1.8.1 Tính bất định về mặt di truyền 16
1.8.2 Sự nhiễm mẫu 16
1.8.3 Sự hóa nâu 17
1.8.4 Hiện tượng thủy tinh hóa 17
1.9 Các yếu tố ảnh hƣởng đến nhân giống in vitro 18
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
v
2.2.2.6 Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến
tỷ lệ sống và chiều cao cây con ở vườn ươm 32
2.2.3. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu 33
2.2.3.1 Phương pháp thu thập số liệu 33
2.2.3.2 Phương pháp xử lý số liệu 34
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 36
3.1 Nghiên cứu ảnh hƣởng của biện pháp khử trùng vật liệu đến khả
năng tái sinh của mẫu cấy 36
3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của mơi trƣờng và nồng độ chất điều hồ
sinh trƣởng BA đến khả năng tái sinh của mẫu cấy 40
3.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của mơi trƣờng ni cấy và nồng độ chất
ĐHST Ki và BA đến khả năng nhân protocom 43
3.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ các chất ĐHST đến khả năng
nhân nhanh chồi 46
3.5. Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất ĐHST NAA đến tỷ lệ ra rễ, số rễ
trung bình/ cây, chiều dài rễ 49
3.6. Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và
chiều cao cây con ở vƣờn ƣơm 53
KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ 59
4.1. Kết luận 59
4.2. Tồn tại 59
4.3. Kiến nghị 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO 61
PHỤ LỤC 63
Phụ lục 1: Mơi trƣờng Murashige- Skoog (MS, 1962) 63
Phụ lục 2: Mơi trƣờng MS cải tiến (MS*) 64
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
vii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Cơng thức khử trùng cho từng loại mẫu 28
Bảng 2.2. Ảnh hƣởng của mơi trƣờng hóa học và nồng độ chất ĐHST đến khả
năng tái sinh của hạt lan. 29
Bảng 2.3 Ảnh hƣởng của mơi trƣờng và nồng độ chất ĐHST Ki, BA đến khả năng
tạo protocom. 30
Bảng 2.5 Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ các chất ĐHST đến khả năng nhân
nhanh thể chồi. 31
Bảng 2.5 Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất ĐHST NAA đến sự ra rễ 32
Bảng 3.1a: Tổng hợp kết quả khử trùng mẫu quả lan bằng HgCl2 36
Bảng 3.1b: Tổng hợp kết quả khử trùng mẫu quả lan bằng cồn 37
Bảng 3.2: Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của 2 loại mơi trƣờng và nồng độ chất
điều hòa sinh trƣởng BA đến khả năng tái sinh của mẫu cấy 40
Bảng 3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của mơi trƣờng ni cấy và nồng độ
chất ĐHST Ki và BA đến khả năng nhân protocom. 43
Bảng 3.4: Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ các chất ĐHST đến khả
năng nhân nhanh chồi. 47
Bảng 3.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của chất ĐHST NAA đến tỷ lệ ra rễ, số
rễ trung bình/ cây, chiều dài rễ. 50
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao của
cây con tại vƣờn ƣơm. 54
Biểu đồ 3.3a: Ảnh hƣởng của chất ĐHST NAA đến tỷ lệ ra rễ
50
6
Biểu đồ 3.3b: Ảnh hƣởng của chất ĐHST NAA đến số rễ trung
bình/ cây
51
7
Biểu đồ 3.3c: Ảnh hƣởng của chất ĐHST NAA đến chiều dài
trung bình của rễ
51
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
ix
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1: Địa lan Trần Mộng Xn (Cymbidium lowianum) 9
Hình 3.1a: Mẫu quả lan khử trùng. 39
Hình 3.1b: Mẫu quả lan đã khử trùng 39
BA : Benzyladenine.
IBA : 3 - Indol butyric acid.
GA3 : Gibberelin acid 3.
BAP : 6-Benzyla amino purin.
Ki : Kinetin.
HgCl2 : Clorua thủy ngân.
NaOCl : Hypoclorit natri.
Ca(OCl)2 : Hypoclorit canxi.
HSNTC : Hệ số nhân thể chồi.
HSNC : Hệ số nhân chồi.
ĐHST : Điều hòa sinh trƣởng.
CTTN : Cơng thức thí nghiệm.
MS : Mơi trƣờng Murashige- Skoog, 1962.
MS* : Mơi trƣờng Murashige- Skoog cải tiến.
VW : Mơi trƣờng Vacin &Went.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
1
Việt Nam thuộc vùng khí hậu nhiệt đới nóng ẩm mƣa nhiều, diện tích
rừng núi đƣợc phân bổ khá rộng tạo thành hệ thống lan
Ngày nay cùng sự phát triển của khoa học- cơng nghệ, kỹ thuật nhân
giống in vitro đƣợc áp dụng phổ biến và thành cơng ở nhiều đối tƣợng thì việc
nhân nhanh các lồi hoa lan đã trở nên thuận lợi. Bằng phƣơng pháp này, cây
con đƣợc tạo ra với số lƣợng lớn đồng nhất về kiểu hình, chất lƣợng đảm bảo,
sạch bệnh, giá thành phù hợp và khơng phụ thuộc vào yếu tố thời tiết. Nhờ đó
đáp ứng nhu cầu khơng ngừng tăng lên của thị trƣờng.
Địa lan Trần Mộng Xn Cymbidium lowianum
chùm hoa dài, thƣờng dài hơn lá với 12- 25
hoa. Hoa lớn màu vàng lục, cánh mơi chia ba thuỳ màu vàng, đỉnh mơi màu
đỏ hồng. Hiện nay, đây là một trong số ít giống lan Sapa có hoa đẹp nở đúng
dịp tết nên nó đã thực sự thu hút ngƣời tiêu dùng trong và ngồi nƣớc. Nhƣng
khả
.
Xuất phát từ u cầu thực tế trên, chúng tơi triển khai nghiên cứu đề
tài:“ Nghiên n (Cymbidium lowianum)
in vitro”.
* Mục tiêu nghiên cứu
- Tìm ra các tác nhân khử trùng và nồng độ khử trùng thích hợp
- Xác định mơi trƣờng phù hợp để nhân giống lan Trần Mộng Xn bằng
phƣơng pháp ni cấy mơ in vitro.
- Tìm hiểu ảnh hƣởng của một số yếu tố của mơi trƣờng ni cấy lên sự
tạo protocom và sự sinh trƣởng, phát triển của lan Trần Mộng Xn.
- Xây dựng hƣớng dẫn nhân giống cho lan Trần Mộng Xn bằng
phƣơng pháp ni cấy mơ in vitro.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
3
- Ứng dụng kết quả nghiên cứu để triển khai nhân giống đại trà, cung cấp
cây giống cho cơng tác bảo tồn.
CHƢƠNG I
TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1 Khái niệm về nhân giống in vitro
Nhân giống in vitro hay ni cấy mơ đều là thuật ngữ miêu tả các phƣơng
thức ni cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa mơi trƣờng xác
định ở điều kiện vơ trùng. Mơi trƣờng có các chất dinh dƣỡng thích hợp nhƣ
muối khống, vitamin, các hoocmon tăng trƣởng và đƣờng.
Phƣơng pháp ni cấy mơ cho phép tái sinh chồi hoặc các cơ quan từ các
mơ nhƣ: thân, lá, rễ ,hoa, quả, bao phấn, nỗn chƣa thụ tinh…
1.2 Giới thiệu về họ lan
Từ đời vua Thần Nơng (2800) trƣớc cơng ngun, cây lan đã đƣợc biết
đến đầu tiên ở phƣơng Đơng và đƣợc sử dụng làm thuốc chữa bệnh. Sau đó,
Robut Bron (1773 – 1858) là ngƣời đầu tiên đã phân biệt rõ ràng giữa họ lan
và các họ khác [5]. Đặt nền tảng hiện đại cho mơn học về lan là Joanlind
(1979 – 1985). Năm 1836, ơng cơng bố sắp xếp các tơng họ lan (A tabuler
view of the Tribes of orchidalr) tên của họ lan do ơng đƣa ra đựơc dùng cho
đến ngày nay [5]. Theo các tài liệu tham khảo của một số tác giả cây hoa lan
Orchidaceae thuộc họ lan Orchidaceae, bộ lan Orchidales, lớp một lá mầm
Monocotyledoneae [1], [5], [3]. Họ lan có mặt ở hầu hết các vùng trên trái đất,
nhƣng có khoảng 4/5 tập trung ở những vùng nhiệt đới, nó đứng thứ hai sau
họ cúc, khoảng 15000-35000 lồi, phân bố từ 68
o
cho đến 56
o
vĩ nam. Tuy
nhiên, phân bố chính của họ này là ở trên các vĩ độ nhiệt đới, đặc biệt là châu
Mỹ và Đơng Nam Á (Mau – RFL 1983). Cây lan biết đến đầu tiên ở Trung
Hoa là kiến lan, đó là Cymbidium ensifonymum là một lồi bán địa lan. Ở
châu Âu bắt đầu để ý đến phong lan từ thế kỷ 18 sau Trung Quốc đến hàng
chục thế kỷ và cũng nhờ các thuỷ thủ thời bấy giờ mà phong lan đã đi khắp
lá. Theo M.E.Pfizer (1882) phong lan có 2 loại thân, mà đa số thuộc loại sinh
trƣởng hợp trụ (nhóm khơng thân) [5]. Thân này gồm hệ thống của nhiều
nhánh lâu năm, với bộ phận nằm ngang, bò dải trên giá thể hay ẩn sâu trong
lòng đất. Ngƣợc lại, rất ít khi gặp các lồi phong lan sinh trƣởng đơn trục
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
6
(nhóm có thân), cơ thể khó có khả năng duy trì đƣợc tƣ thế thẳng đứng, nó
phải nhờ đến các rễ chống đỡ để vƣơn cao, ở các lồi phong lan sống phụ, có
nhiều đoạn phình lớn, tạo thành củ giả. Đó là bộ phận dự trữ nƣớc và chất dinh
dƣỡng để ni cây trong hồn cảnh khơ hạn khi sống bán trên cao. Đa số củ giả
đều có màu xanh bóng, nên cùng với lá nó cũng làm nhiệm vụ quang hợp.
Lá lan
Có thể phân lá lan thành 3 loại: lá đứng – lá nửa đứng, lá cong rũ. Hầu hết
các loại địa lan đều là cây tự dƣỡng, là “ xƣơng” chế tạo chất dinh dƣỡng
bằng quang hợp, do đó nó phát triển rất đầy đủ hệ thống lá. Lá mọc đơn độc,
hoặc xếp dày đặc ở gốc, hay xếp cách đề đặn trên thân, trên củ giả. Hình dáng
lá thay đổi từ loại lá mọng nƣớc, nạc, dài hình kim, hình trụ dài, tiết diện tròn
hay có rãnh, đến loại lá hình phiến mỏng, dài, những lá dƣới sát gốc thƣờng
tiêu giảm đi chỉ còn những bẹ khơng có phiến lá hay giảm hẳn thành các vảy.
Các lồi địa lan có số lá trên nhánh biến động rất lớn: lá trên nhánh ít phải kể
đến Đơng lan (2,6 lá/ nhánh); trong khi đó Bạc lan (Cerythrostylum) có số lá/
nhánh rất lớn (9,1 lá/ nhánh). Độ dày và độ rộng của lá cũng rất khác nhau, lá
dài phải kể đến Bích ngọc (Cymbidium dayamum): 1cm; Thanh ngọc
(Cymbidiumensifolium) 40- 80 cm…
Về màu sắc, phiến lá thƣờng có màu xanh bóng nhƣ các chi Lan kiếm
(Cymbidium. SW), chi lan Bầu rƣợu (Calanthe R.Br), có lồi có màu xanh
đậm nhƣ Hạc Đính Vàng (P. Flavum).
Hoa lan
bởi một nắp màu trắng ngà rễ mở dời chứa khối phấn của trục hợp nhuỵ cách
với muỗm nhuỵ bởi một cái gờ nổi lên. Cấu trúc này trong tự nhiên hoa địa
lan chỉ thụ phấn đƣợc nhờ cơn trùng. Sau khi hoa thụ phấn, hoa xoay dần về
vị trí cũ, bầu nỗn phình to lên tạo thành quả.
Quả lan
Quả của cây địa lan thuộc loại quả nang, nở ra theo 3-6 đƣờng nứt dọc, có
dạng từ quả dài (Vanilla) đến dạng hình trụ ngắn phình ở giữa. Khi chín quả
nở ra và mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phần đỉnh và phía gốc. Ở một số
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
8
lồi quả chín nở theo 1-2 khía dọc, thậm chí khơng nứt ra mà hạt chỉ ra khỏi
vỏ quả khi vỏ này bị mục nát.
Hạt lan
Hạt lan rất nhiều nhỏ li ti kích thƣớc hạt vơ cùng nhỏ với khối lƣợng tồn
bộ hạt trong một quả =1/10-1/1000mg trong đó khơng khí chiếm 76-96% thể
tích của quả. Do đó hạt lan hầu nhƣ khơng có khối lƣợng. Hạt chỉ cấu tạo từ
một khối chƣa phân hố, trên một mạng lƣới nhỏ xốp chứa đầy khơng khí.
Phải trải qua 2-18 tháng hạt mới chín. Phần lớn hạt thƣờng chết vì khó gặp
nấm cộng sinh cần thiết để nảy mần. Do đó hạt nhiều có thể theo gió bay rất
xa, nhƣng hạt nảy mần thành cây lại hiếm. Chỉ ở trong những khu rừng già
ẩm ƣớt, vùng nhiệt đới mới đủ điều kiện cho hạt lan nảy mầm.
1.3 n
Địa lan Trần Mộng Xn có tên khoa học Cymbidium lowianum thuộc họ
Phong lan. Lan đất, củ giả tròn. Lá hình dải hẹp dài từ 60 – 80cm, số lá trung
bình trên một nhánh là 5,1. Chùm hoa dài từ 70 – 100cm, thƣờng dài hơn lá
với 15- 30 hoa. Hoa lớn dài 12cm màu vàng lục, cánh mơi chia ba thuỳ màu
vàng, đỉnh mơi màu đỏ hồng. Hiện nay, đây là một trong số ít giống lan Sapa
có hoa đẹp nở đúng dịp tết.
Morel (1960) đã nhận thấy Meristem của một lồi địa lan có rất ít hoặc khơng
có virus. Đồng thời ơng cũng thành cơng trong kỹ thuật tạo protocorm, khi
ni cấy Meristem, các protocorm đƣợc cắt và ni cấy tiếp tục sẽ thu đƣợc
các protocorm mới. Nếu trong điều kiện nhất định, nó sẽ hình thành các cây
địa lan con mới và là những cây sạch virus.
Từ đó đến nay nhân giống in vitro đã thành cơng đối với nhiều chi khác
thuộc họ lan, nhƣ: Hồ Điệp (Phalaenopsis), Cát lan (Cattleya), Hồng Thảo
(Dendrobium), Kim Tuyến (Anoectochilus) và các giống lai của chúng. Đó
cũng là cơ sở cho những thành cơng của nhiều cơng trình ni cấy mơ tế bào
về sau.
1.4.2 Nghiên cứu ở Việt Nam
Ở nƣớc ta hiện nay đã có một số cơng trình nghiên cứu khá thành cơng về
nhân giống lan.
Năm 2002, tác giả Phạm Thị Liên đã nghiên cứu nhân giống Invitro
thành cơng cho một số lồi địa lan ở khu vực phía Bắc Việt Nam và đƣa ra
quy trình nhân giống cho lồi Địa lan Hạc đính nâu nhƣ sau: Khử trùng mẫu
bằng dd HgCl
2
0,1% trong 15 phút. Đƣa mẫu đã khử trùng vào mơi trƣờng F
+ 3% đƣờng saccaro + 0,8% Agar + BAP 1,0 mg/l + Kinetin 0,7% mg/l +
IBA 0,5mg/l. Mơi trƣờng F + 3% đƣờng saccaro + 0,8% Agar + 10% nƣớc
dừa + 0,5 mg/l NAA để tạo cây hồn chỉnh.
Năm 2003, trƣờng Đại học Nơng nghiệp I - Hà Nội đã tiến hành nghiên
cứu xây dựng quy trình nhân giống và ni trồng Lan Hồ Điệp
(Phalaenopsis) của Nguyễn Quang Thạch và cộng sự cho thấy: Mơi trƣờng
thích hợp tạo vật liệu khởi đầu từ cơ quan sinh dƣỡng là VW + 100 ml/l ND +
2 mg/l BA + 0,3 mg/l Kinetin + 10g/l đƣờng, mơi trƣờng thích hợp tạo nguồn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
3
. Mơi trƣờng ra rễ R2: Knudson cải tiến + 30g/l
đƣờng +100g/l khoai tây + 100ml/l nƣớc dừa + 7 g/l agar + 0,1 mg/l NAA.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
12
1.5 Cơ sở khoa học của ni cấy mơ in vitro
1.5.1 Dựa trên tính tồn năng của tế bào
Tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng mang tồn bộ lƣợng thơng tin
di truyền cần thiết và đủ của sinh vật đó, khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế
bào đều có thể phát triển thành một cá thể hồn chỉnh. Tuy từng tế bào, từng
loại mơ, từng thời kỳ sinh trƣởng, phát triển mà gen phù hợp hoạt động; các
gen khơng cùng hoạt động nhƣ nhau trong các giai đoạn phát triển của cơ thể
(do cơ thể điều hòa hoạt động của gen)
1.5.2 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
+ Sự phân hóa tế bào: là sự chuyển các tế bào phơi sinh ban đầu hình
thành các tế bào mơ chun hóa đảm nhận các chức năng khác nhau
Cơ thể thực vật trƣởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều
cơ quan chức năng khác nhau, đƣợc hình thành từ nhiều loại tế bào khác
nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên
(tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành
nhiều tế bào phơi sinh chƣa mang chức năng riêng biệt (chun hóa). Sau đó
từ các tế bào phơi sinh này chúng tiếp tục đƣợc biến đổi thành các tế bào
chun hóa đặc hiệu cho các mơ, cơ quan có chức năng khác nhau.
Tế bào phơi sinh Tế bào dãn Tế bào phân hóa (có chức năng
riêng biệt)
Sơ đồ các giai đoạn phân hóa của tế bào
+ Sự phản phân hóa tế bào: khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có
chức năng chun hóa chúng vẫn khơng hồn tồn mất khả năng biến đổi của
Auxin và Xytokinin. Tỷ lệ của hai nhóm chất này trong mơi trƣờng sẽ tạo ra
sự phát sinh hình thái khác nhau
1.6 Quy trình nhân giống in vitro
1.6.1 Giai đoạn 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Trƣớc khi nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ. Những
cây này phải khỏe mạnh, sạch bệnh đặc biệt là sạch bệnh virut và đang ở giai
đoạn sinh trƣởng mạnh.
Copyright: Tài liệu đại học ©