MỤC LỤC
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iii
DANH MỤC BẢNG iv
DANH MỤC HÌNH ẢNH, BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ v
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
CB Cân bằng
PPO Polyphenol Oxidase
P.P Phenolphtalein
M.R Metyl đỏ
M.O Metyl da cam
1
DANH MỤC BẢNG
2
DANH MỤC HÌNH ẢNH, BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ
3
Đồ án tốt nghiệp đại học – Khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT
LỜI MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Chỉ thị là chất đóng vai trò rất quan trọng trong Hóa học phân tích, cũng như
Hóa học thực phẩm hiện nay. Trong Hóa học phân tích, chất chỉ thị giúp ta tiến
hành phân tích mẫu, chuẩn độ, pha chế, phát hiện nhanh pH môi trường… một cách
dễ dàng và chính xác. Cũng như trong Hóa học thực phẩm, chất chỉ thị giúp ta thuận
lợi hơn trong việc xác định đặc tính môi trường của sản phẩm, từ đó có thể tiến
hành kiểm tra, bảo quản sản phẩm một cách phù hợp hoặc có thể phát hiện nhanh sự
có mặt của một số chất cấm trong thực phẩm như hàn the trong nem, chả… đặc biệt
trong nền giáo dục hiện nay, chất chỉ thị là chất không thể thiếu trong các phòng thí
nghiệm hóa học của các cấp mà nhiều nhất là bậc Trung học. Hiện nay, trên thị
trường có một số chất chỉ thị như: Phenolptalein, Metyl đỏ, Metyl da cam… Nhưng
phần lớn những chất trên đều là chất chỉ thị tổng hợp được nhập khẩu với giá thành
cao, kém an toàn cho người sử dụng. Vì vậy, cần có chất chỉ thị an toàn, chính xác,
giá thành rẻ, dễ sử dụng là yêu cầu cấp thiết được đặt ra.

Sabdariffa - ứng dụng để sản xuất giấy chỉ thị phát hiện nhanh hàn the trong thực
phẩm, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Đại học Nông nghiệp Hà Nội. Kết quả
nghiên cứu sản xuất được giấy chỉ thị phát hiện nhanh hàn the trong thực phẩm có
ngưỡng tối thiểu tốt hơn và độ nhạy tương tự như giấy nghệ.
3. Mục đích nghiên cứu
Đề tài được thực hiện với mục đích khảo sát và chứng minh khả năng chỉ thị
của Anthocyanin được chiết từ bắp cải tím, từ đó đưa ra đề xuất dùng Anthocyanin
làm chất chỉ chị axit – bazơ theo tiêu chuẩn Việt Nam.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
Ngành công nghệ kỹ thuật Hóa học 5 Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm
Đồ án tốt nghiệp đại học – Khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT
Với mục tiêu tìm ra chất chỉ thị an toàn, chính xác, giá thành rẻ, dễ sử dụng
từ bắp cải tím nhằm thay thế một số chất chỉ thị hiện có. Nội dung nghiên cứu của
đề tài bao gồm:
− Nghiên cứu cấu tạo, tính chất và ứng dụng từ đó đưa ra giải thích về sự đổi màu của
Anthocyanin theo từng khoảng pH khác nhau
− Xây dựng quy trình trích ly và bảo quản Anthocyanin từ bắp cải tím
− Khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến màu và độ bền màu của Anthocyanin
− Khảo sát khả năng làm chất chỉ thị và ứng dụng làm giấy pH phát hiện nhanh pH
môi trường của Anthocyanin
− Đánh giá kết quả, kết luận về sự đổi màu và độ bền màu theo pH từ đó đưa ra đề
xuất dùng Anthocyanin làm chất chỉ thị an toàn cho tương lai
5. Phương pháp nghiên cứu
− Phương pháp thu thập thông tin và số liệu
+ Thu thập thông tin từ sách, báo và các đề tài nghiên cứu khoa học đã có
+ Thu thập, tìm kiếm dữ liệu từ Internet
+ Tham khảo ý kiến của các chuyên gia
− Phương pháp phân tích
Tiến hành trích ly Anthocyanin từ bắp cải tím, sau đó xác định hàm lượng
Anthocyanin từ dịch chiết bằng phương pháp pH vi sai và xác định độ bền màu

− Chương III. Kết quả thực nghiệm và thảo luận
Ngành công nghệ kỹ thuật Hóa học 7 Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm
Đồ án tốt nghiệp đại học – Khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT
CHƯƠNG I
TỔNG QUAN LÝ THUYẾT
.1. Chất chỉ thị màu [2], [3]
1.1.1. Khái niệm
Chất chỉ thị màu là những axit hữu cơ yếu hay bazơ hữu cơ yếu, điện li thuận
nghịch (kí hiệu HA), và đặc biệt anion A
-
và phân tử HA có màu khác nhau. Khi
cho chất chỉ thị màu vào nước thì cân bằng được thiết lập:2 3
HA H O H O A
+ −
+ +
ƒ
(1)
− Nếu cân bằng (CB) dịch chuyển về phía phải (→) dung dịch có màu của A
–

− Nếu cân bằng (CB) dịch chuyển về phía trái (←) dung dịch có màu của HA
− Nếu một trong một hệ có hai chất có màu khác nhau thì việc quan sát bằng mắt
thường chỉ cho phép ta nhận được màu của một chất khi nồng độ của nó ít nhất gấp
10 lần nồng độ chất kia. Như vậy:
+ Khi
][
][

≤ 0,1, dung dịch có màu của A
–
, ta có:
pH ≥ pK – lg0,1
pH ≥ pK + 1
Vậy, khoảng pH từ (pK – 1) đến (pK + 1) là khoảng đổi màu của chất chỉ thị.
1.1.2. Một số chất chỉ thị màu và cấu tạo
Ngành công nghệ kỹ thuật Hóa học 8 Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm
Hay
Hay
Đồ án tốt nghiệp đại học – Khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT
a. Metyl da cam (heliantin)
Metyl da cam là chất hữu cơ có tính chất lưỡng tính với hằng số axit
N N N
CH
3
CH
3
NaO
3
S
K
A
= 4.10
-4
Hình 1.1. Cấu trúc cơ bản của Metyl da cam
N N SO
3
N
H

C
H
3
C
Màu vàng da cam
Ngành công nghệ kỹ thuật Hóa học 9 Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm
Đồ án tốt nghiệp đại học – Khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT
N NH
SO
3
H
N
H
3
C
H
3
C
N
H
N SO
3
HN
H
3
C
H
3
C


Quỳ tím là hỗn hợp nhiều chất có nguồn gốc từ cây địa y (từ 10 đến 15 chất
bao gồm: Erythrolein, Azolitmin, Spaniolitmin, Leucoorcein và Leucazolitmin …).
Giấy quỳ tím hoá đỏ trong môi trường axit và hoá xanh trong môi trường bazơ.
Hình 1.7. Cân bằng chuyển dịch của quỳ tím trong môi trường axit – bazơ
Bảng 1.1. Một số chất chỉ thị thường dùng trong các phòng thí nghiệm Hóa học
Chất chỉ thị
Màu ở
môi trường axit
Khoảng
biến đổi màu
Màu ở
môi trường bazơ
Metyl da cam
Quỳ
Phenolptalein
Đỏ da cam
Đỏ
Không màu
3,1 ÷ 4,4
5 ÷ 8
8 ÷ 10
Vàng
Xanh
Đỏ (hồng)

Trên đây là những chất chỉ thị màu điển hình, phổ biến, được sử dụng rộng
rãi nhất hiện nay. Nhưng phần lớn đây là những chất chỉ thị màu tổng hợp kém an
toàn, giá thành cao nên cũng có rất nhiều hạn chế trong việc sử dụng, đặc biệt là
trong y học, giáo dục và thực phẩm.
Ngày nay, không những trong hoá học mà trong các ngành khác như y học,

.
1.1.3. Tính chất của Anthocyanin
Ngành công nghệ kỹ thuật Hóa học 13 Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm
Hình 1.8. Cấu trúc cơ bản của aglucon của Anthocyanin
Đồ án tốt nghiệp đại học – Khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT
Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hay vô định hình là hợp chất khá
phân cực nên tan tốt trong dung môi phân cực. Màu sắc của Anthocyanin luôn luôn
thay đổi phụ thuộc vào pH và nhiệt độ, các chất có mặt và nhiều yếu tố khác khi
tăng số lượng nhóm OH trong vòng benzen thì màu càng xanh đậm (trong vòng
benzen có thể có 1, 2 hoặc 3 nhóm OH).
Mức độ methyl hóa nhóm OH trong vòng benzen càng cao thì màu càng đỏ.
Nếu nhóm OH ở vị trí thứ ba kết hợp với gốc đường thì màu sắc cũng sẽ thay đổi
theo số lượng gốc đường được đính vào nhiều hay ít. Tuy nhiên màu Anthocyanin
thay đổi mạnh nhất phụ thuộc vào pH của môi trường.
− Khi pH > 7 các Anthocyanin có màu xanh
− Khi pH < 7 các Anthocyanin có màu đỏ
− Ở pH = 1 các Anthocyanin thường ở dạng muối oxonium màu cam đến đỏ
− Ở pH = 4 ÷ 5 chúng có thể chuyển về dạng bazơ cacbinol hay bazơ
chalcon không màu
− Ở pH = 7 ÷ 8 lại về dạng bazơ quinoidal anhydro màu xanh
Màu sắc của Anthocyanin còn có thể thay đổi do hấp thụ ở trên
polysaccharide. Khi đun nóng lâu dài các Anthocyanin có thể bị phá hủy và mất
màu.
Anthocyanin có bước sóng hấp thụ trong miền nhìn thấy, khả năng hấp thụ
cực đại tại bước sóng 510 ÷ 540 nm. Độ hấp thụ là yếu tố liên quan mật thiết đến
màu sắc của các Anthocyanin chúng phụ thuộc vào pH của dung dịch, nồng độ
Anthocyanin: thường pH thuộc vùng axit mạnh có độ hấp thụ lớn, nồng độ
Anthocyanin càng lớn độ hấp thụ càng mạnh.
Tóm lại, trong môi trường axit các Anthocyanin là những bazơ mạnh và có
thể tạo muối bền vững với axit. Anthocyanin cũng có khả năng cho muối với bazơ.

=OH) hoặc màu vàng (R
3
=H). Khi pH tăng, sự mất proton xảy ra nhanh thành
Ngành công nghệ kỹ thuật Hóa học 15 Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm
Hình 1.9. Cấu trúc chuyển hoá của Anthocyanin trong nước
Đồ án tốt nghiệp đại học – Khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT
dạng quinononidal màu xanh dương hoặc màu đỏ. Dạng quinonoidal thường tồn tại
như một hỗn hợp vì pK
A
của nhóm OH ở vị trí 7 và 5 là tương tự.
− Khi để yên, sự chuyển hóa xảy ra: có sự tách nước của cation flavylium cho ra dạng
pseudobase (hemiacetal), dạng này cân bằng với dạng chalcone vòng mở không
màu.
− Hai dạng Cis (C
E
) và trans–chalcone–(C
Z
) được tạo thành từ carbinol pseudobase
bởi phản ứng mở vòng nhanh và isomer hóa chậm. Cả 2 chalcone này khác nhau so
với chalcone bình thường là bởi chúng có nhóm chức carbonyl ở cạnh vòng B,
trong đó chalcone bình thường có nhóm carbonyl ở kế cận vòng A.
Cấu trúc hóa học:
− Độ bền màu và cường độ màu của các Anthocyanin phụ thuộc vào vị trí và số lượng
của các nhóm hydroxyl, methoxyl, đường và các đường được acyl hóa. Khi số
nhóm hydroxyl trong vòng B tăng, cực đại hấp thụ ở vùng thấy được dịch chuyển
về phía có bước sóng dài hơn và màu thay đổi từ cam đến xanh dương.
Ví dụ: Bước sóng hấp thu cực đại trong dung dịch HCl 0,01%.
+Pelgonidin: λ
max
= 520 nm (cam)

− Anthocyanin có chứa 2 hay nhiều nhóm acyl (như Ternatin, Platyconin, Cinerarrin,
Tiodenphin và Zebrrinin) là bền trong môi trường trung tính hoặc axit yếu do liên
kết hydro giữa các nhóm hydroxyl của các nhân phenolic trong Anthocyanin và axit
vòng thơm. Brouillard (1981-1982) và Goto cùng với cộng viên (1982-1983), khảo
sát rằng các Anthocyanin diacylate hóa được bền hóa bởi sự liên kết chặt kiểu
sandwich nhờ sự tương tác giữa vòng Anthocyanin và 2 nhóm acyl vòng thơm.
b. pH
Trong môi trường nước, pH có ảnh hưởng đáng kể lên màu sắc của
Anthocyanin (Brouillard 1984, Mzza và Brouillard 1987). Cấu trúc, độ bền màu,
màu sắc của Anthocyanin thay đổi theo sự thay đổi của pH. Sự thay đổi cấu trúc
của Anthocyanin khi pH thay đổi đã được đề cập trong phần cấu trúc chuyển hóa.
Năm 1956 Lukton nghiên cứu thấy rằng: Ở pH = 2,0 ÷ 4,5 thì vận tốc phân
hủy pelargonidin 3- glucoside trong dịch ép của quả dâu không xác định được khi
không có O
2
. Khi có mặt O
2
pH tăng nhanh, sự biến tính tăng lên mãnh liệt.
Đến năm 1972, Adams nghiên cứu thấy rằng ở pH = 2,0 ÷ 4,0 ít ảnh hưởng
đến sự phân hủy của Anthocyanin trong suốt quá trình gia nhiệt khi không có O
2
.
Khi có mặt O
2
thì Anthocyanin bị biến tính mạnh ở pH trên cấu trúc của chúng
cùng với độ bền màu thay đổi với sự thay đổi pH.
Ngành công nghệ kỹ thuật Hóa học 17 Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm
Đồ án tốt nghiệp đại học – Khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT
c. Nhiệt độ
Trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm, Anthocyanin dễ dàng bị

C) sau đó là sự biến
đổi aglycone thành chalcone. Sự biến tính hơn nữa dẫn đến hình thành dạng sản
phẩm màu nâu đặc biệt là với sự có mặt của oxy.
Khi đun nóng lâu dài các Anthocyanin có thể bị phân huỷ và mất màu,
đặc biệt là các Anthocyanin của dâu tây, anh đào, củ cải. Ngược lại các
Anthocyanin của phúc bồn tử đen cũng trong điều kiện đó lại không bị thay đổi.
Nhìn chung khi gia nhiệt, các chất màu đỏ dễ dàng bị phân huỷ, còn các chất
màu vàng thì khó hơn.
d. Oxy
Oxy và nhiệt độ được xem là những tác nhân đặc trưng xúc tiến sự phân
hủy của Anthocyanin, do đó mà sinh ra những dạng sản phẩm không màu hoặc
màu nâu. Chính sự oxy hóa trực tiếp dạng carbinol pseudobase đã gây ra sự kết tủa
và đóng váng trong nước trái cây.
Trong quá trình đun nóng các Anthocyanin bị oxy hóa mãnh liệt. Oxy và
nhiệt độ là những tác nhân xúc tiến đặc biệt nhất trong nước ép của: blueberry,
cherry (anh đào), currant, raspberry,….
Ngành công nghệ kỹ thuật Hóa học 19 Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm
Đồ án tốt nghiệp đại học – Khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT
Lượng Anthocyanin còn lại của dâu sẽ lớn hơn khi đóng chai dưới điều
kiện chân không hoặc nitrogen (Baravingas và Cain, 1965). Độ bền của các
Pigment của nho còn được sử dụng như là chất màu ở nước giải khát được tăng
lên khi đóng hộp với nitrogen.
e. Enzyme
Nhiều enzyme nội sinh trong tế bào của cây có khả năng làm mất màu
Anthocyanin. Những enzyme này được gọi chung là Anthocyanase. Dựa vào đặc
tính của các enzyme mà người ta phân làm 2 nhóm: Glycosidase và Polyphenol
oxidase (PPO). Các enzyme này thu được từ nấm (fugal).
− Glycosidase: là enzyme thủy phân liên kết glycoside của Anthocyanin tạo ra đường
tự do và aglycone này kém bền hơn rất nhiều và mất màu rất nhanh khi có mặt của
catecol (Huang 1955).

5
là bền hơn các Anthocyanin monoglycoyl hóa tại vị trí C
3
đồng thời chúng
bền hơn so với các aglycone tương ứng.
g. Đường và các sản phẩm biến tính của chúng
Ở nồng độ 100 ppm, đường và các sản phẩm phân hủy của chúng có tác
dụng thúc đẩy sự phân hủy các Anthocyanin, trong đó fructose, arabinose, lactose
và sorbose có khả năng phân hủy Anthocyanin mạnh hơn glucose, sucrose, và
maltose. Tốc độ phân hủy của Anthocyanin liên quan đến tốc độ phân hủy của
đường. Các sản phẩm phân hủy của đường gồm có: furfura l,5–hydroxymethyl
furfural và acctaldehyde thu được từ phản ứng Mailard hoặc từ sự oxy hóa của axit
ascorbic, polyuronic hoặc ở bản thân các Anthocyanin. Những sản phẩm phân hủy
này dễ dàng ngưng tụ với các Anthocyanin hình thành những hợp chất phức tạp có
màu nâu sẫm. Sự phân hủy Anthocyanin với sự có mặt của furfural và HMF trực
tiếp phụ thuộc vào nhiệt độ và được thấy rõ nhất là trong nước trái cây sự có mặt
Ngành công nghệ kỹ thuật Hóa học 21 Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm
Đồ án tốt nghiệp đại học – Khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT
của nó làm tăng thêm hiệu quả phân hủy của tất cả các loại đuờng và các dẫn xuất
của chúng.
Hình 1.13. Phản ứng ngưng tụ của:
a) Cyanidin và furfural
b) Cyanidin ketobase và furfural
h. Các ion kim loại
Một số ion kim loại đa hóa trị có thể tương tác với các Anthocyanin có nhóm
OH ở vị trí ortho gây ra hiệu ứng sâu màu (bathocromic). Hiện tượng này xảy ra khi
kim loại tiếp xúc với Anthocyanin trong quá trình chế biến rau quả hoặc sự cho
thêm các muối kim loại vào trong thực phầm.
Sistrunk và Cash đã chứng minh rằng có thể bền hóa màu của dịch trích dâu
bằng cách thêm vào đó muối thiếc. Francis (1977) công bố rằng, các ion Ca, Fe, Al

và Anthocyanin trong đó, dạng có màu flavylium phản ứng với ion
bisulphate tạo thành chromene-2-(hoặc 4)- sulphonic axit.
Hình 1.14. Sơ đồ Jurd đối với phản ứng thuận nghịch
giữa SO
2
và Anthocyanin
SO
2
ở nồng độ rất thấp (khoảng 30 ppm) có thể ức chế sự biến tính do
enzyme của Anthocyanin trong quả anh đào nhưng không làm mất màu chúng
(Goodman và Markakis, 1965 ). Sự tẩy màu bất thuận nghịch xảy ra trong quá trình
tẩy quả với lượng lớn SO
2
(0,8 – 1,5%) và soda (0,4 – 1,0%) được dùng trong quá
trình tẩy quả. Phản ứng bất thuận nghịch này chưa được biết hoàn toàn.
j. Axit ascorbic
Nhiều nhà khảo sát (Beatic và cộng sự 1943; Pederson và cộng sự 1947;
Kertesz 1952; Meschter 1953; Markakis và cộng sự 1957; Starr và Francis 1968)
quan sát sự biến mất đồng thời của axit ascorbic và Anthocyanin trong nước trái
Ngành công nghệ kỹ thuật Hóa học 23 Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm
Đồ án tốt nghiệp đại học – Khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT
cây tồn trữ và đề nghị một tương tác có thể có giữa 2 hợp chất này. Axit ascorbic
hiện diện trong hầu hết các sản phẩm trái cây, vitamin này bị oxy hóa tạo thành
H
2
O
2
và chính H
2
O

Đồ án tốt nghiệp đại học – Khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT
cây diễn ra tốt hơn
Anthocyanin là chất màu thiên nhiên được sử dụng khá phổ biến và an toàn
trong thực phẩm, tạo ra nhiều màu
sắc
hấp dẫn cho mỗi sản
phẩm như: trong công
nghiệp bánh kẹo, sản xuất đồ uống nhẹ, sản xuất đồ uống có cồn, sản xuất kem
Những đặc tính quí báu của Anthocyanin mà các chất màu hóa học, các chất
màu khác hình thành trong quá trình gia công kỹ thuật không có được, đã mở ra
một hướng nghiên cứu mới, ứng dụng hợp chất màu Anthocyanin lấy từ thiên
nhiên và trong đời sống hằng ngày, đặc biệt trong công nghệ hóa học phân tích và
chế biến thực phẩm. Điều đó hoàn toàn phù hợp với xu hướng hiện nay của các
nước và trên thế giới là nghiên cứu, khai thác chất màu từ thiên nhiên sử dụng
trong hóa học và thực phẩm, bởi vì chúng có tính an toàn cao cho người sử dụng.
1.1.1.2.6.
Sự phân bố và một số loại rau quả có chứa Anthocyanin
Anthocyanin tập trung ở những cây hạt kín và những loài ra hoa, phần lớn
nằm ở hoa và quả, ngoài ra cũng có ở lá và rễ. Trong những loại thưc vật này,
Anthocyanin được tìm thấy chủ yếu ở các lớp tế bào nằm bên ngoài như biểu bì.
Các hợp chất Anthocyanin xuất hiện rộng rãi trong khoảng ít nhất 27 họ, 73
loài và trong vô số giống thực vật sử dụng làm thực vật (Bridle và Timberlake,
1996). Các họ thực vật như vitaceae (nho), rosaceae (dâu tây), solanceae (cà tím),
saxifragaceae (quả lý đỏ và đen), ericaceae (quả việt quốc) và brassicaceae (bắp cải
tím). Các loại Anthocyanin phổ biến nhất là các glucoside của cyanidin, kế đến là
pelargonidin, peonidin và delphinidin, sau đó petuidin và maldivin. Số lượng các 3–
glucoside nhiều gấp 2,5 lần các 3,5–glucoside. Loại Anthocyanin hay gặp nhất
chính là Cyaidin-3-glucoside.
Chất màu Anthocyanin thường có trong những loại rau quả có màu đỏ, xanh
và tím như: dâu tây, bắp cải tím, vỏ nho, hoa hồng