BỘ CÔNG THƯƠNG
VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI CẤP BỘ NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SINH TỔNG HỢP ENZYM
GLUCOSE OXIDAZA (GOD) VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG
NGHIỆP CHẾ BIẾN MỘT SỐ SẢN PHẨM TỪ QUẢ NHẰM
ĐẢM BẢO ỔN ĐỊNH CHẤT LƯỢNG CHỐNG BIẾN MÀU,
HẠN CHẾ MẤT MÙI SẢN PHẨM

Chủ nhiệm đề tài: THS. TRẦN THỊ CHÂU


[65];[66];[70]. Trong y học GOD được sử dụng để xác định hàm lượng glucoza trong
dịch của cơ thể (xác định hàm lượng glucoza trong máu hoặc nước tiểu của các bệnh
nhân tiểu đường). Ngoài ra enzym GOD còn được dùng để đánh dấu các kháng thể
và
để phát hiện các kháng thể đánh dấu của khối u và các kháng thể của virut. Trong phân
tích, enzym GOD được sử dụng rộng rãi để sản xuất các KIT thử sinh học nhằm xác
định hàm lượng glucoza có trong mẫu [9]; [88];[90].
GOD có thể được tổng hợp bằng phương pháp lên men chìm từ nguồn cacbon
là glucoza, saccaroza, tinh bột và một số chất dinh dưỡng với sự có mặt của oxy bởi
các chủng nấm mốc hoặc nấm men [1]; [11];[13].
Ở Việt nam, cho đến nay ch
ưa có công trình nghiên cứu về GOD nào được
công bố. Do vậy, việc nghiên cứu sinh tổng hợp enzym GOD ứng dụng trong bảo quản
các sản phẩm thực phẩm sẽ rất có ý nghĩa, nó mở ra một triển vọng mới trong việc
thay thế các chất bảo quản có nguồn gốc hóa học, góp phần nâng cao chất lượng thực
phẩm, đảm bảo vệ sinh an toàn cho người tiêu dùng.

Mục đích của nghiên cứu.
Quá trình sinh t
ổng hợp GOD bằng chủng A. niger sẽ được nghiên cứu ở ba mức độ
khác nhau: Nuôi lắc trong bình tam giác, trong bình lên men 5 lít và qui mô pilot.
Nghiên cứu tập trung vào những nhiệm vụ sau:

2
1. Lựa chọn chủng giống
- Lựa chọn chủng giống A. niger.
- Nghiên cứu đặc điểm hình thái.
- Kiểm tra độ an toàn của chủng giống (dựa trên kết quả kiểm tra độc tố
aflatoxin B1,B2,G1,G2).
- Định tên chủng giống chọn lựa

Enzym GOD (GOD) là một enzym chống oxi hóa được sinh tổng hợp từ những
năm 1950. Năm 1904, Maximow đã phát hiện ra một hệ thống enzym tiêu thụ oxy
trong dịch chiết nấm mốc. Năm 1926, D.Mueller đã xác định lại hệ thống này và ông
ta đặt tên cho enzym này là glonga oxidaza. GOD được chiết tách lần đầu tiên từ hệ
sợi nấm mốc Aspergillus niger và Penicillium glaucum do nhà khoa h
ọc Muller (năm
1928). Kể từ sau lần đầu được phát hiện và tách chiết nhiều nhà khoa học đã tập trung
nghiên cứu enzym GOD. Năm 1946, Keilin và Haitree chứng minh rằng GOD là một
flavinprotein với một nhóm ngoại (prosthetic) FAD và có đặc tính kháng khuẩn
“antibiotic" (do tạo thành hydro peroxit H
2
O
2
) [9].
Tiếp theo là báo cáo của Keston năm 1956 về cặp phản ứng giữa GOD,
peroxidaza và một chất tạo mầu. Trên nguyên tắc này “que nhúng” định lượng glucoza
đã xuất hiện để xác định hàm lượng glucoza trong nước tiểu. Cũng trong năm 1956,
dựa trên bài báo của Teller, Worthington lần đầu tiên đã đưa ra hệ thống enzym định
lượng để xác định hàm lượng glucoza bằng phương pháp so mầu.
Các chủng nấm mốc Aspergillus niger, Penicillium glaucum và nấm men
Saccharomyces cerevisiae
là nguồn vi sinh vật có khả năng sản xuất ra GOD tốt nhất.
Enzym GOD thu được dưới dạng enzym nội bào (Aspergillus niger, Saccharomyces
cerevisiae) hay ngoại bào (Penicillium glaucum) được làm sạch với các mức độ khác
nhau, tùy theo mục đích sử dụng. Enzym GOD tinh sạch đã loại bỏ các polysaccharit
tạp này đã được giới thiệu cho mục đích bảo quản thực phẩm, y học chuẩn đoán và
phân tích.

I. 2. Cấu tạo của enzym GOD
Cũng gi

Enzym GOD được sinh tổng hợp từ A. niger có cấu tạo bởi 583 axit amin.
Enzym GOD có tính đặc hiệu rất cao. M
ột thay đổi nhỏ trong cấu trúc đã có tác động
lớn tới hoạt lực oxy hoá của enzym. Gốc glucoza trong phân tử của enzym ở dạng β-
D- glucoza có hoạt tính oxy hoá mạnh hơn α- D- glucoza 157 lần [39].

Hình 1.1. Cấu trúc không
gian ba chiều của GOD
Hình 1.2. Cấu trúc tiểu đơn
vị của GOD (mầu đỏ là
FAD)


¾ Các chất ức chế
- Ức chế bởi: D- arabinoza và 2- deoxy-D-glucoza.
- Ức chế hoàn toàn bởi: ρ- cloromercuribenzoat.
- Ức chế một phần bởi: 8- hydroxycholin, semicarbazit
- Bị mất hoạt lực bởi: H
2
O
2

- CO, HCN, NaF không ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym.
¾ Các chất kìm hãm
Các ion kim loại Ag
+
, Hg
2+
, Cu
2+
có ảnh hưởng kìm hãm đến hoạt tính enzym
GOD. Sự gắn kết của FAD bị kìm hãm bởi một vài nucleotit.

6
¾ Điều kiện bảo quản
Enzym GOD dạng khô là ổn định trong nhiều năm khi bảo quản ở chỗ mát. Các
dạng dung dịch tính ổn định phụ thuộc nhiều vào các điều kiện bảo quản.

I.4. Cơ chế hoạt động cña enzym GOD [77]
Enzym GOD (còn gọi là β-D-glucose:oxygen 1-oxidoreductase, EC 1.1.3.4) là
một enzym oxi hóa khử β-D glucoza bị oxi hóa thành axit gluconic và oxi bị tiêu thụ.
GOD
Phản ứng tổng quát: C

) sẽ bị phân hủy thành nước và oxy.
Phương trình phản ứng như sau:
GOD
C
6
H
12
O
6
+ FAD C
6
H
10
O
6
+ FAD~H
2

gluconolacton +O
2
+H
2
O

C
6
H
12
O
7

- Loại I khoảng 210 U/mg
- Loại II khoảng 70 U/mg
- Loại III khoảng 20 U/mg
- Loại IV khoảng 1.5 U/mg
¾ Mức độ tinh sạch
- Loại I: amylaza, sacaroza – mỗi loại < 0.01%, catalaza <10U/mg
- Loại II: amylaza, sacaroza – mỗi loại < 0.1%, catalaza < 250 U/mg
- Loại III: amylaza, sacaroza – mỗi loại < 0.1%, catalaza < 260 U/mg
¾ Dạng chế phẩm GOD có sẵn
- Loại I và II dạng dung dịch.
- Lo
ại III và IV dạng bột khô.
¾ Độ bền
GOD được bảo quản ở 4
0
C, không bị giảm hoạt tính trong vòng 12 tháng.

II. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT GOD TRONG NƯỚC VÀ
TRÊN THẾ GIỚI
GOD được tìm thấy trong các mô động vật, thận, gan trong canh trường nuôi
cấy nấm mốc, nhất là các loài Aspergillus niger, P. amagasakiens, P. chrysogenum, P.
vitale. P. notatum, P. glaucum, P. purpurogennum và P. variabile [1]; [12]; [30].
GOD sinh tổng hợp từ các vi sinh vật nói trên đã được nghiên cứu kỹ ở các
nước như: Liên Xô, Tiệp Khắc, Mỹ và Nhật. Trên thị trường đã có một số chế phẩm
enzym GOD được lư
u hành với những tên thương phẩm như Oxidoredutaza 1.1.3.4
(Liên Xô). Gluzyme
TM
BG của hãng Ecozym (Hungary), Glucose oxidase của hãng
Calzyme (Mỹ) hay Novarom của hãng Novozyme (Đan Mạch) [9]; [70] .

GOD trên môi trường tinh bột sử dụng chủng Aspergillus niger [36]. Rhinas và cộng
sự (2001) đã nghiên cứu ảnh hưởng của sự thông khí đến hình thái sợ
i nấm, sự tạo
thành viên và sự sản xuất enzym GOD của chủng tái tổ hợp Aspergillus niger. Theo
tác giả này, trong nuôi cấy chìm khi tốc độ thông khí tăng từ 200 – 800 v/p, hình thái
sinh trưởng của A. niger thay đổi từ hạt kích thước lớn (đường kính trung bình 1500
µm) đến hạt kích thước nhỏ. Có một sự tương quan giữa cường độ thông khí với hình
thái sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym GOD. Khả năng tổng hợp enzym tăng lên khi
thay đổi hình thái sinh trưởng t
ừ dạng viên đến dạng sợi mảnh. Tuy nhiên, dạng sợi
mảnh có sức căng bề mặt lớn hơn, cần thông khí mạnh hơn và lượng sinh khối thu
được ít hơn [63];[69].
Cho đến nay, ở Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào về GOD được
công bố. 9
II.1. Chủng vi sinh vật trong sản xuất enzym GOD
Chủng giống là điều kiện tiên quyết quan trọng nhất trong sản xuất enzym công
nghiệp bằng kỹ thuật lên men. Việc lựa chọn chủng giống đang ngày càng đóng vai trò
quan trọng trong sản xuất enzym. Một chủng giống tốt không chỉ giúp tăng sản lượng
của sản xuất enzym, tăng tốc độ sử dụng nguyên liệu thô mà còn liên quan đến tính đa
dạng của các enzym, rút ngắn quá trình sản xuất, cải thiện quá trình lên men và tách
chiết.
Nấm sợi là vi sinh vật hoại sinh điển hình, chúng tiết ra một loạt các enzym tham
gia vào việc phân hủy các polyme sinh học của các mô động vật và thực vật. Đại bộ
phận các enzym này là enzym thủy phân và đóng vai trò quan trọng trong dinh dưỡng
của nấm mốc, giải phóng cacbon và nitơ liên kết trong các đại phân tử để cung cấp
dinh dưỡng cho nấm mốc. Điều này làm cho n
ấm sợi như là vật chủ để sản xuất các

gấp nhiều lần so với trong tự nhiên. Chúng không có khuynh hướng tích lũy một số
lượng lớn protein nội bào dưới dạng cấu trúc cơ thể như vi khuẩn và nấm men.
• Aspergillus là một hệ thống sản xuất hữu ích các protein dị hình nhận được từ
các nấm sợi khác.
• Tính ổn định của các biến đổi di truyền là khá cao vì vậy, mối đe dọa của s
ự lại
giống hầu như không được nhắc tới.

II. 2. Định tên chủng nấm mốc
Aspergillus niger là một trong những loài nấm mốc được nghiên cứu nhiều nhất.
Tuy nhiên, các cơ sở để phân loại chúng là chưa thật chắc chắn. Thông thường tên A.
niger có thể được sử dụng cho bất kỳ thành viên nào thuộc nhóm này bởi vì chúng rất
khó phân biệt. Các đặc điểm về hình thái của chúng là rất giố
ng nhau và rất khó phân
biệt các loài trong cùng một nhóm A. niger [16]. Theo Al-Musallam (1981) và Samson
(2004) thuộc nhóm A. niger gồm có 8 loài: A. niger, A. tubingensis, A. foedidus, A.
piperis, A. brasiliensis, A. vadensis, A. costaricensis và A. lacticoffeatus.
Cho đến năm 1991 bằng kỹ thuật gen dựa trên kết quả đọc trình tự các đoạn gen ITS,
β-tubilin, calmodulin, IGS và cox1 đã cho phép phân biệt chính xác hơn các loài trong
nhóm A. niger [46].
Theo Varga và cộng sự, 1993; 1994; Accensi và cộng sự, 1999; 2001, nếu chỉ
dựa trên phương pháp phân loại nấm mốc cổ điển, không thể phân biệt được đã phân
biệt được
A. tubingensis và A. niger. Hai loài này có độ tương đồng về hình thái rất
cao và A. tubingensis được xem như là loài phụ của A. niger. Việc sử dụng các phương
pháp phân tử cho phép phân biệt chính xác hơn các loài trong nhóm A. niger và đã
phân loại được A. niger và A. tubingensis là hai loài riêng biệt [16]; [83]; [84]. Sự phân
biệt chính xác A. niger và A. tubingensis là rất có ý nghĩa bởi vì A. niger được công bố

11

A flacipes aflatoxin (k)
10
A. giganteus patulin (k)
11
A. glaucus axit koji
12
A. mangnini aflatoxin (k)
13
A. nidulans sterigmatocystin (k), axit koji, nitulin, nitulotoxin
14
A. niger aflatoxin (k)
15
A. niveus citrinin
16
A. ochraceus ochratoxin A, B, C, aflatoxxin (k)
17
A. oryzae oryzacillin, axit koji
19
A. parasitieus aflatoxin (k)
20
A. ruber aflatoxin (k), parietin
21
A. sydowii x
22
A. terreus patulin (k), citrin, axit terreic
23
A. ustus axit ustinic
24
A. varsicolor sterogmatocystin (k), aversin, versicolorin A, B, C
25

thay đổi theo các phạm vi sau đây:

Bảng 1. 2. Nhu cầu của vi sinh vật về các loại muối khoáng [2]
Nồng độ cần thiết (g/l)
Muối khoáng
Vi khuẩn Nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn
K
2
HPO
4
0.2 – 0.5 1 - 2
KH
2
PO
4
0.2 – 0.5 1 - 2
MgSO
4
.7H
2
O 0.1 – 0.2 0.2 - 0.5
MnSO
4
.4H
2
O 0.005 – 0.01 0.02 – 0.1
FeSO
4
.7H
2

Lưu huỳnh cũng là một nguyên tố khoáng quan trọng trong tế bào vi sinh vật.
Lưu huỳnh có mặt trong thành phần một số axit amin (systin, systein và một tripeptide
là glutathion). Ngoài ra, lưu huỳnh còn có vai trò quan trọng trong các quá trình oxi
hóa khử. Việc chuy
ển nhóm sulphidrin thành nhóm disulphit có vai trò rất lớn trong
quá trình chuyển điện tử từ nguyên liệu hô hấp đến oxi phân tử. Các hợp chất hữu cơ
có chứa lưu huỳnh ở dạng oxy hóa thường có tác dụng độc đối với tế bào vi sinh vật,
trong khi các muối sulphat vô cơ lại được vi sinh vật đồng hóa rất tốt [2].
Sắt là nguyên tố rất cần thiết để giúp vi sinh vật có thể tổng hợp một số enzym
chứa sắt như: xitocrom, xitocrommoxidaza, peroxidaza, catalaza v.v. Trong sinh tổng
hợp enzym GOD và peroxidaza từ A. niger nguồn Fe thích hợp nhất là FeSO
4
.7H
2
O
[2],[35],[48].
Magiê là nguyên tố được vi sinh vật đòi hỏi với hàm lượng khá cao (10
-3
– 10
-
4
M). Magiê đóng vai trò một cofacto, chúng tham gia vào nhiều phản ứng enzym có
liên quan đến các quá trình photphoril hóa (chuyển H
3
PO
4
từ

một hợp chất hữu cơ này
sang một hợp chất hữu cơ khác). Mg

+
ở mặt ngoài của màng tế bào. Một lượng
đáng kể ion K
+
tồn tại ở trạng thái liên kết hóa lý không bền với protein và các thành
phần khác của nguyên sinh chất. Kali làm tăng độ ngậm nước của các hệ thống keo do
đó ảnh hưởng đến các quá trình trao đổi chất, nhất là các quá trình tổng hợp. Nguồn
kali thường dùng dưới dạng muối KH
2
PO
4
, K
2
HPO
4
hoặc K
2
SO
4
[36].
Trong tế bào vi sinh vật, các ion kim loại có sự tương tác với nhau, một enzym
có thể bị hoạt hóa bởi nhiều ion kim loại khác nhau, cũng có trường hợp một ion kim
loại này lại có tác dụng đối kháng đối với một ion kim loại khác [2]. Bình thường
trong nuôi cấy vi sinh vật, người ta không cần bổ sung các nguyên tố vi lượng, các
nguyên tố này thường có sẵn trong nước máy hoặc trong các hóa chất dùng làm môi
trường. Tuy nhiên, trong một số trường hợp cụ thể phải b
ổ sung một số nguyên tó vi
lượng vào môi trường nuôi cấy như bổ sung Zn vào môi trường nuôi cấy nấm mốc, bổ
sung Co vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn sinh tổng hợp B12, bổ sung B và Mo vào
môi trường nuôi cấy các vi sinh vật cố định đạm v.v [2]. Sự tồn tại dư thừa các ion kim

enzym GOD [51],[59],[66]. Ngoài ra, enzym GOD cũng có thể được tổng hợ
p từ
chủng A. niger trên môi trường có nguồn cacbon là glycerol, đường riboza, arabinoza,
xyloza, rhamnoza, mannoza, galactoza và hỗn hợp của xyloza/xilan [69].
9 Nguồn dinh dưỡng nitơ
Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên quá trình sinh tổng hợp GOD từ A. niger bằng
phương pháp lên men chìm đã được nghiên cứu sâu. Nguồn nitơ dùng cho sinh tổng
hợp GOD từ chủng A. niger bao gồm các nguồn nitơ vô cơ khác nhau như muối nitrat
của canxi, natri, amoni, kali và nguồn nitơ hữu cơ như d
ịch chiết nấm men, nước chiết
malt, peptone, dịch chiết ngô, nước chiết đậu tương [47]. Natri nitrat và cao nấm men
là nguồn nitơ phổ biến nhất được dùng để sinh tổng hợp GOD. Tuy nhiên, theo Kona.
R.P và cộng sự (2000) để sản xuất GOD từ A. niger, trong số các nguồn nitơ như canxi
nitrat, natri nitrat, amoni nitrat, kali nitrat, dịch chiết nấm men và pepton thì natri nitrat
cho hoạt lực enzym GOD cao nhất (đạt 595 ± 30 Unit/ml) trong khi sử dụng dịch chiết

16
ngô như nguồn nitơ duy nhất với hàm lượng 20ml/l hoạt lực enzym cao hơn hẳn (đạt
640 ± 36 Unit/ml) [47].
9 Nguồn dinh dưỡng photpho
Photpho luôn luôn chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các nguyên tố khoáng của tế bào
vi sinh vật. Photpho có mặt trong cấu tạo của nhiều thành phần quan trọng của tế bào
(như axit nucleic, photphoprotein, photpholipit, trong nhiều coenzym quan trọng như
ATP, ADP, UDP, UTP, XDP, XTP, NAD, NADP, flavin v.v.), trong một số vi tamin
như thiamin, biotin v.v. Để đảm bảo nguồn dinh dưỡng photpho người ta thườ
ng sử
dụng các loại photphat vô cơ. Việc bổ sung photphat vào môi trường dinh dưỡng ngoài
việc cung cấp photpho còn có tác dụng tạo ra tính đệm của môi trường. Với các tỷ lệ
thích hợp, hỗn hợp muối KH
2

hoặc
(NH
4
)
2
HPO
4,
NH
4
H
2
PO
4
, trong đó KH
2
PO
4
và K
2
HPO
4
là thích hợp hơn cả [36]; [40],
[41].
9 Ảnh hưởng của các chất có hoạt tính bề mặt [2]; [37]; [40]
Khi sinh trưởng trong môi trường dịch thể vi sinh vật chịu ảnh hưởng của sức
căng bề mặt của môi trường. Đa số các môi trường dịch thể dùng trong phòng thí
nghiệm có sức căng bề mặt khoảng 0,57 – 0,63mN/cm. Những thay đổi mạnh mẽ sức
căng bề mặt có thể làm ngừ
ng sinh trưởng và làm tế bào chết. Khi sức căng bề mặt
thấp, các thành phần của tế bào chất bị tách khỏi tế bào. Điều này chứng tỏ màng tế

ưu cho quá trình sinh tổng hợp enzym.
9 pH
Hoạt động chuyển hóa của nấm mốc rất nhậy cảm với pH của môi trườ
ng. Hầu
hết nấm mốc phát triển tốt trong môi trường hơi axit, giá trị pH từ 3 đến 6, nhưng một
số loài có thể sinh trưởng ở giá trị pH dưới 2, có tác dụng rất tốt để ức chế sự phát triển
của vi khuẩn. Tác dụng của pH có ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình trao đổi chất của
tế bào. pH cần cho hoạt động của nhiều enzym. Nồng độ ion H
+
còn ảnh hưởng trực
tiếp đến độ hoà tan của một số khoáng K, Na, Mg pH môi trường còn ảnh hưởng
đến khả năng hấp thụ các nguồn hydrat cacbon, nitơ của sinh vật [2]. Để sản xuất
enzym GOD từ A. niger khoảng pH ban đầu của môi trường trong khoảng từ 5-7
[ 42];[47];[73].
9 Nhiệt độ [42]
Nhiệt độ lên men thích hợp cần phải được duy trì mặc dầu vi sinh vật trong quá
trình hoạt động trao đổi ch
ất cũng sinh nhiệt. Nhiệt độ có vai trò quan trọng trong sự
sinh trưởng của sợi nấm, việc sản sinh bào tử và sự nảy mầm của chúng. Khi nuôi cấy
ở nhiệt độ dưới nhiệt độ tối thích, sự sinh trưởng và sản xuất các chất chuyển hóa bị

18
chậm lại. Khi nuôi cấy nấm mốc ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối thích, kết quả là làm
ức chế và biến tính enzym và sự sinh trưởng bị dừng lại. Mặc dầu hầu hết nấm sợi là
có nhiệt độ tối thích giữa 25
0
C và 35
0
C, một số loài có thể phát triển mạnh ở 50
0

II.5. Thu hồi và tinh sạch enzym
Sản xuất enzym GOD (GOD) bằng chủng A. niger được biết đến từ lâu. Tuy
nhiên, các nghiên cứu sự phân bố enzym trong các chủng nấm mốc còn ít được quan
tâm. Clarke và cộng sự đã nghiên cứu định lượng enzym GOD ngoại bào, trong màng

19
tế bào, tế bào chất và trong các thành phần khác của nấm mốc A. niger NRRL-3 nuôi
cấy trên môi trường thạch nước chiết malt (MEA). Các tác giả đã tách được các thành
phần riêng rẽ và xác định được hoạt tính enzym GOD, trong đó GOD ngoại bào chiếm
38% hoạt động tổng thể, 60% còn lại ở trạng thái liên kết trong sợi khuẩn ty bao gồm:
màng tế bào, tế bào chất và chất dịch khác chiếm tỷ lệ tương ứng 34, 12 và 16% [59].
Witteveen và cộng sự đ
ã nghiên cứu định vị hoạt động của GOD và catalaza
của A. niger N 400 (CBS 120.49) theo phương pháp hoá học miễn dịch và cũng xác
định GOD tập trung ở màng tế bào [59]. Đối với trường hợp enzym tiết ra môi trường,
để thu dịch enzym người ta thường tách sinh khối và các chất cặn bã ra khỏi canh
trường bằng ly tâm hoặc lọc ép với việc sử dụng thêm các chất trợ lọc hoặc các chất
tạo kết tủa.
Đối vớ
i enzym còn nằm trong tế bào thì việc phá vỡ tế bào là rất cần thiết.

II.5.1. Cơ chế của việc giải phóng enzym nội bào [27]; [52]
Việc giải phóng các enzym nội bào ra khỏi tế bào thực chất là quá trình làm tổn
thương tế bào. Có hai cách để có thể làm thay đổi màng tế bào dẫn đến việc giải phóng
enzym là làm cạn kiệt năng lượng hoặc làm tổn thương màng tế bào.

II. 5.1.1 Cơ chế làm cạn kiệt năng lượng
Sự ức chế quá trình chuyển hóa năng lượng là làm cạn kiệt năng lượng ATP
dẫn đến sự giải phóng liên tục các các ion Na
+

một vòi đặc biệt. Sự phá vỡ tế bào đượ
c gắn với ba cơ chế: Sự đẩy lên van, sự xé chất
lỏng rất mạnh ở trong van và sự giảm áp suất đột ngột ở đầu ra, cuối cùng gây ra sự nổ
vỡ tế bào. Phương pháp này được ứng dụng chủ yếu để giải phóng các phần tử bên
trong tế bào. Theo Hetherington và cộng sự, đây là phương pháp phá vỡ tế bào (hay tỷ
lệ protein được giải phóng) tốt nhất.

Phương pháp nghiền bi (Ball Mills)
Sử dụng các bi gốm hoặc bi thủy tinh và được khuấy ở tốc độ cao. Các tế bào
trong dịch huyền phù bị vỡ do các lực cắt, nghiền, va đập và cọ sát giữa các hạt và giải
phóng các phân tử sinh học. Ở mức công nghệ đơn giản nhất, các bi thủy tinh được bổ
sung vào dịch huyền phù và mẫu được trộn bằng máy trộn vortex của phòng thí
nghiệm. Bằng cách này, các tế bào
được phá vỡ dễ dàng, không đắt và có thể thực hiện
với nhiều mẫu khác nhau. Khi phá vỡ một lượng mẫu lớn bằng phương pháp này, cần
trang bị bộ phận làm mát (thường dùng CO
2
lỏng) bởi vì khi khuấy mạnh, một lượng
lớn nhiệt được tỏa ra.
 Phá vỡ bằng siêu âm (Ultrasonic disruption)
Một phương pháp được ứng dụng khá rộng rãi là phá vỡ tế bằng sóng siêu âm
tần số cao (thường là 20-50 kHz). Về nguyên tắc, tần số cao do dòng điện sinh ra và
năng lượng cơ học được chuyển đến mẫu qua một đầu kim loại giao động với tần số
r
ất cao. Đầu kim loại được đặt trong ống đựng tế bào (mẫu) và sự rung tần số cao gây
ra áp suất cao ở tại vùng đó và kết quả là tác động mạnh và tạo ra lỗ hổng và kết cục là
phá vỡ hoàn toàn tế bào.

21
Nhược điểm của phương pháp phá vỡ tễ bào bằng tác nhân cơ học.

vùng có khả năng thấm của lớp thành bên ngoài tế bào tăng lên.
 Cải thiện tính thấm bằng gây sốc thẩm thấu
Trong khi các tế bào chịu được sự thay đổi từ từ của áp suất thẩm thấu bên
ngoài môi trường do có sự thích ứng với những thay đổi, thì những tế bào ch
ịu sự thay
đổi áp suất thẩm thấu nhanh đột ngột, có thể bị tổn thương về mặt cơ học. Quá trình
này diễn ra đặc trưng khi môi trường có nồng độ đường sacaroza cao. Người ta cho
rằng, các enzym được giải phóng bằng phương pháp này là các enzym định vị ở gần bề

22
mặt tế bào [30]. Theo Fiedurek, J (1992) để giải phóng enzym GOD khỏi chất bao, sợi
nấm A. niger 72 giờ tuổi được hòa vào dung dịch NaCl có nồng độ từ 0,4- 2.8 M/l [31].
 Thủy phân (Lysis)
Phương pháp phá vỡ tế bào bằng thủy phân thường được sử dụng cho những tế
bào dễ bị phá vỡ. Thông thường, nồng độ các chất ion hóa trong môi trường bị giảm
xuống làm cho các tế bào bị phồng lên và vỡ ra. Trong một số trường h
ợp, một số chất
hoạt động bề mặt có thể được bổ sung vào và kết hợp với khuấy nhẹ hoặc siêu âm để
tách rời hoàn toàn các thành phần của tế bào.
Sự phá vỡ tế bào bằng phương pháp thủy phân có nhược điểm là không kiểm
soát được mức độ phá vỡ tế bào, kết quả là giải phóng tất cả các sản phẩm nội bào (các
protein, các axit nucleic, các mảnh vỡ của t
ế bào) cũng như làm biến tính các sản
phẩm.
 Cải thiện tính thấm bằng enzym (Enzymatic Permeabiization)
Các enzym cũng có thể được dùng để cải thiện tính thấm của tế bào, nhưng
phương pháp này thường bị giới hạn trong việc dùng để giải phóng các chất bao hoặc
các enzym bề mặt. Các enzym dùng trong cải thiện tính thấm là những enzym thương
phẩm có sẵn trên thị trường: β (1-6) và β (1-3) glycanaza, proteaza và mannaza.
Trở ngại chính của vi

trình hoạt động, có thể
lập lại với một số lượng
lớn
Chậm bởi vì cần phải đi
qua nhiều lần, không có
biện pháp giữ lại các sản
phẩm phụ, không có bộ
phận làm mát,không có
hệ thống CIP & SIP, chỉ
dùng cho các chất lỏng,
không dễ sử dụng và vệ
sinh nnhư nhiều thiết bị
khác.

Sốc nhiệt Đơn giản, rẻ tiền Sản phẩm bị biến tính
Các loại enzym / các loại
hóa chất
Đặc hiệu Khó khăn khi nâng công
suất
Các loại siêu âm Thiết bị gọn nhẹ Sinh nhiệt, chậm
Làm đứt gẫy bằng cơ học Có thể lập lại Khó làm vệ sinh, chậm II.5.2. Tinh sạch enzym [8], [27], [39],[52],[68].
Tùy theo yêu cầu sử dụng enzym mà ta cần enzym tinh sạch hay không tinh
sạch. Rất ít khi enzym thu được sau khi phá vỡ tế bào được sử dụng ngay, trong hầu
hết các trường hợp đòi hỏi phải qua bước tinh sạch enzym. Để tách và tinh chế enzym
người ta thường dựa vào tính chất cơ bản của enzym để đưa ra các phương pháp thích
hợp.
- Các phương pháp dựa vào sự thay đổi tính hoà tan bao gồm: thay đổi pH (kết

được thẩm tích ngược bằng cùng dung dịch đệm.
Dung dịch đã thẩm tích được dùng để chạy qua cột DEAE-cellulose (kích thước
50 x 4 cm) với dung dịch đệm là natri photphat 0.1M (pH 6.0). Cột trao đổi ion được
rửa bằng 5 lít dung dịch đệm là natri photphat 0.1M (pH 6.0). Protein mầu nâu với
hoạt tính catalaza cao được tách rửa. Cuối cùng, DEAE-cellulose được rửa với đệm
photphat 0.2M (pH 6.0), theo cách tách rửa này, thu được protein mầu vàng với hoạt
tính GOD. Dịch mầu vàng được thêm vào một lượng amon sulphat đến độ bão hòa
90%. Tủ
a tạo thành được ly tâm và hòa tan trở lại trong nước, cuối cùng thẩm tách
ngược bằng nước.