BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN THÚ Y

ĐÀO THỊ HẢO

PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC
CỦA MYCOPLASMA GALLISEPTICUM VÀ CHẾ KHÁNG
NGUYÊN, KHÁNG HUYẾT THANH CHẨN ĐOÁN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP


PGS-TS. CÙ HỮU PHÚ
TS. NGUYỄN NGỌC NHIÊN
HÀ NỘI - 2008

LỜI CẢM ƠN Hoàn thành công trình nghiên cứu khoa học này, cùng với sự nỗ lực
cố gắng của bản thân, tôi xin được đặc biệt bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới hai
thầy PGS-TS Cù Hữu Phú và TS Nguyễn Ngọc Nhiên, những người thầy đã
trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành Luận Án.
Tôi xin cảm ơn Ban Giám đốc Viện Thú y, cùng các Phòng, Bộ môn, Cơ
sở Đào tạo sau đại học, đặc biệt là Bộ môn Vi trùng, đã tạ
o điều kiện cho tôi
thực hiện các đề tài khoa học và tiến hành các thí nghiệm liên quan đến Luận
Án.
Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn tới PGS-TS Trương Văn Dung Giám
đốc dự án Jica, GS Kanameda, M., Mr. Kishima, M., Chuyên gia Dự án cũng
như Mrs. Imada,I., Viện Thú y Nhật Bản, đã tạo điều kiện cho tôi đến thực
tập và triển khai nghiên cứu, chẩn đoán về Mycoplasma là nội dung chính của
Luận Án.
Tôi xin được chân thành cảm ơn tới GS-TS Phan Thanh Ph
ượng, người
thầy đã cho tôi những định hướng nghiên cứu đầu tiên của Luận Án.

CFU Colony Forming Unit
CRD Chronic Respiratory Disease
cs Cộng sự
GI Growth Inhibition
HA Haemagglutination
HI
HT
Haemagglutination inhibition
Huyết thanh
IFA Indirect Fluorescent Antibody
IP Immunoperoxydase
IS Infectious Sinusitis hay IS
KHT Kháng huyết thanh
KN Kháng nguyên
MA Mycoplasma Agar
MB Mycoplasma Broth
MG Mycoplasma gallisepticum
MI Mycoplasma ioawe
MIT Metabolism Inhibiton Test
MM Mycoplasma meleagridis
MS Mycoplasma synoviae
NDY Nitten Dry Yeast
OIE Office International des Epizooties
PBS Photsphat Buffered Saline

PCR Polymerase Chain Reaction
PPLO Pleuro - Pneumo Like - Organism
RFLP
RA
Restriction Flagment Length Polymorphism

1.1.5 Đặc tính sinh hoá của MG 12
1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do Mycoplasma ở gia cầm 14
1.2.1 Tình hình bệnh do Mycoplasma ở gia cầm trên thế giới 14
1.2.2 Tình hình bệnh do Mycoplasma ở Việt Nam 16
1.3 Bệnh do Mycoplasma ở gà 18
1.3.1 Nguyên nhân gây bệnh 18
1.3.2 Cách truyền lây và chất chứa mầm bệnh 22
1.3.3 Loài mắc bệnh và nhân tố ảnh hưởng tới dịch tễ 22
1.3.4 Triệu chứng của bệnh 23
1.3.5 Bệnh tích 26
1.3.6 Chẩn đoán 29
1.3.7 Điều trị 34
1.3.8 Biện pháp khống chế bệnh 35
1.4 Đặc tính miễn dịch của cơ thể gà trong bệnh do Mycoplasma 39
1.4.1 Đặc đ
iểm về sự di truyền của các globulin miễn dịch từ mẹ
sang con
39
1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự đáp ứng miễn dịch 41
Chương 2. Nội dung, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
43
2.1 Nội dung nghiên cứu
2.1.1 Phân lập, xác định hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc tính
sinh vật hoá học của MG
2.1.2 Chế tạo và sử dụng kháng nguyên tự chế để xác định tỷ lệ
nhiễm b
ệnh Chronic Respiratory Disease (CRD) ở một số cơ sở
chăn nuôi gà công nghiệp
2.1.3 Chế kháng huyết thanh chẩn đoán và ứng dụng xác định vi
khuẩn Mycoplasma gallisepticum (MG), Mycoplasma synoviae

2.3.9 Các phương pháp xử lý số liệu 61
Chương 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận
62
3.1 Kết quả phân lập, xác định hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc tính
sinh vật hoá học của vi khuẩn MG, MS
62
3.1.1 Xác định vi khuẩn MG, MS trên các mẫu bệnh phẩm 62
3.1.2 Giám định vi khuẩn MG, MS phân lập được 72
3.1.3 Gây nhiễm bằng MG trên gà để chọn chủng chế kháng nguyên 84
3.2 Chế kháng nguyên MG và đánh giá chất lượng kháng nguyên MG 89
3.2.1 Kết quả chế kháng nguyên 89
3.2.2 Xác
định độ đặc hiệu của kháng nguyên 92
3.2.3 So sánh độ nhạy của kháng nguyên tự chế với kháng nguyên
của hãng Intervet- Hà Lan
93
3.2.4 Đánh giá chất lượng của kháng nguyên MG tự chế, so sánh
với kháng nguyên của hãng Intervet- Hà Lan
94
3.2.5 Xác định tỷ lệ nhiễm MG ở một số giống gà bằng kháng
nguyên tự chế
101
3.3 Chế kháng huyết thanh chẩn đoán và ứng dụng xác định vi khuẩn
MG, MS phân lập được
106
3.3.1 Chế kháng huyết thanh chẩn đoán 106
3.3.2 Ứng dụng kháng huyết thanh tự chế để xác định vi khuẩn
MG, MS phân lập được
110
Kế

67
3.3 Phân lập vi khuẩn MG, MS từ mẫu phổi 70
3.4 Kiểm tra một số đặc tính sinh hoá và khả năng lên
men đường của các chủng MG, MS phân lập được
76
3.5 Giám định
các chủng MG, MS phân lập bằng phương
pháp phát hiện kháng thể

77
3.6 Giám định
các chủng MG, MS phân lập bằng phương
pháp xác định kháng nguyên
78
3.7 Giám định vi khuẩn phân lập được bằng phản ứng PCR 81
3.8 Kết quả giám định serotype của các chủng MG phân lập 83
3.9 Ứng dụng các phương pháp chẩn đoán khác nhau sau
gây nhiễm MG
85
3.10 Đánh giá kết quả của các phương pháp sau 35 ngày
gây nhiễm
86
3.11 Kết quả giám định vi khuẩn 88
3.12 Xác định độ thuần khiết, vô trùng của canh khuẩn chế
kháng nguyên
91
3.13 Kết quả xác định khả năng ngưng kết ở các lô KN
trước và sau khi bảo quản trong tủ lạnh
92
3.14 Xác định độ đặc hiệu của kháng nguyên 93

107
3.25 Xác định hiệu giá ngưng kết của kháng huyết thanh 108
3.26 Xác định kháng huyết thanh bằng phản ứng kết tủa
khuếch tán trên thạch
109
3.27 Ứng dụng KHT MG, KHT MS tự chế để xác định
các chủng Mycoplasma phân lập được
110

DANH MỤC ẢNH

SỐ TÊN ẢNH TRANG
3.1 Phản ứng Multiplex PCR xác định MG, MS trong bệnh
phẩm
64
3.2 Khuẩn lạc MS 75
3.3 Khuẩn lạc MG 75
3.4 Giám định MG, MS phân lập bằng phương pháp PCR 82
3.5 Khuẩn lạc MG, MS nhuộm Immunoperoxidaza 133
3.6 Phản ứng lên men đường 134
3.7 Phản ứng khuếch tán trên thạch 134
3.8 Lấy mẫu máu 135
3.9 Huyết thanh làm phản ứng ngưng kết nhanh 135
3.10 Phản ứng ngưng kết và ức chế ngưng kết hồng cầu 135
3.11 Nhân truyền giống qua trứng 136
3.12 Giế
t thỏ thu hoạch kháng huyết thanh 136
3.13 Chuẩn bị cấy chuyển giống chế kháng nguyên 136
3.14 Kiểm tra giống trên môi trường MA 137
3.15 Kết quả phản ứng ngưng kết khi pha loãng kháng nguyên 137

của đàn gà thịt. Trong đàn mái đẻ, bệnh ở dạng ẩn tính làm giảm tỷ lệ trứng,
tăng tỷ lệ chết phôi trong quá trình ấp nở hoặc gà con nở ra không khoẻ
mạnh.
Đối với gà con, bệnh gây chết tỷ lệ không cao, chủ yếu là giảm khả năng sinh
trưởng làm cho gà kém phát triển và tiêu tốn nhiều thức ăn trong chăn nuôi,

2
tạo cơ hội cho các bệnh khác phát triển.
Với các trại gà lớn, việc chẩn đoán chủ yếu dựa vào triệu chứng và
bệnh tích mà triệu chứng của bệnh chủ yếu ở dạng ẩn tính, biểu hiện không rõ
ràng nên gây nhiều khó khăn cho người làm công tác thú y.
Ở một số trại gà giống, việc chẩn đoán bằng phản ứng ngưng kết nhanh
đã được thực hiệ
n, nhưng kháng nguyên Mycoplasma dùng để chẩn đoán vẫn
phải nhập từ nước ngoài với giá thành cao nên ảnh hưởng đến lợi ích kinh tế
cho người chăn nuôi.
Bên cạnh đó, các loại kháng huyết thanh dùng để định týp vi khuẩn
trong phòng thí nghiệm cũng phải nhập ngoại nên không được sử dụng rộng
rãi trong các phòng thí nghiệm.
Trong công tác chẩn đoán, việc phân lập ra vi khuẩn, xác định các đặc
tính gây bệnh của mầm bệnh, nhằ
m mục đích phát hiện sớm và tìm ra hướng
phòng và trị bệnh có hiệu quả luôn là những việc làm cấp thiết. Xuất phát từ
thực tiễn nghiên cứu và yêu cầu của sản xuất, chúng tôi tiến hành nghiên cứu
đề tài:
"Phân lập, xác định một số đặc tính sinh học của Mycoplasma
gallisepticum và chế kháng nguyên, kháng huyết thanh chẩn đoán”
B. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1. Kết quả nghiên cứu của đề tài có những ý nghĩa khoa học sau đây:
- Bổ sung những tư liệu về bệnh do Mycoplasma ở gà trong điều kiện
4
PHẦN NỘI DUNG
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Những nghiên cứu về mầm bệnh Mycoplasma gallisepticum (MG)
1.1.1 Một số điểm khái quát về Mycoplasma
Trong phân loại học, Mycoplasma thuộc lớp Mollicutes (Mollis có
nghĩa là mềm, cutes có nghĩa là vỏ bọc, da). Lớp vi khuẩn này có khoảng 176
loài, chúng phân bố rộng trong tự nhiên gây bệnh ở động vật có vú, chim, bò
sát, chân đốt, thực vật và cá (Dybvig và Voelker, 1996)[48].
Hệ thống phân loại của Mycoplasma trong lớp Mollicutes được xác
định như sau ( Razin và cs, 1998)[123] (xem sơ đồ trang bên).
Theo phân loạ
i, Mycoplasma là vi sinh vật có vị trí xếp giữa vi khuẩn
và virus. Mycoplasma là vi thể sống có thành tế bào không ổn định, chúng
được bao bọc bởi màng Plasma gồm các thành phần protein, glycoprotein,
glycolipit và phospholipit, hình dạng lúc là hình cầu, hình xoắn, lúc là hình
sợi hoặc vòng, kích thước tối thiểu có đường kính 0,3 μm nhưng do hình
dạng luôn thay đổi nên có thể qua lọc màng lọc 0,22 μm, Mycoplasma là vi
trùng có khả năng tự nhân đôi với kích thước nhỏ nhất (Yoder và Hofstad,
1964)[154], (Razin, 1992)[122].
Mycoplasma không giống với virus ở
Entomoplasma tacea
Entomoplasma
(5 loài)
Mesoplasma
(12 loài)
Spiroplasma
(33 loài)
Acholeplasma
(13 loài)

Acholeplasma taceae

Anaeroplasma tales

Anaeroplasm aceae
Anaeroplasma
(4 loài)
Asteroleplasma
(1 loài)

Acholeplasma tales


môi trường thạch.
Ảnh minh hoạ: Khuẩn lạc Mycoplasma
Không có bất cứ một loại môi trường nào có thể phù hợp với tất cả các
Mycoplasma, nhưng hầ
u hết các môi trường nuôi cấy Mycoplasma đều được
chuẩn bị từ các thành phần chính là nước chiết tim bê, péptôn, chất chiết nấm
men, huyết thanh và các thành phần khác. Nhu cầu cholesterol trong thành
phần môi trường nuôi cấy là một đặc điểm để phân loại Mycoplasma. (Bảng
1.1)
Khuẩn lạc phát triển trong
thạch
Vùng trung tâm
Vùng ngoại vi
Bề mặt thạch

7
Bảng 1.1:
Các đặc điểm phân biệt của giống Mycoplasma (Mollicutes)
(Razin và cs, 1998)[123]

Giống Cần Cholesterol Nơi cư trú Các đặc điểm khác

nh cho thực vật và côn trùng, ngoài ra
chúng còn được tìm thấy ở ngoài tự nhiên như trong phân, nước cống.
Cùng với khả năng gây bệnh trên người và động vật, Mycoplasma còn
có trong các chế phẩm sinh học như vacxin, môi trường nuôi cấy tế bào và
gây ra những khó khăn rất lớn trong nghiên cứu cũng như trong công nghệ
sinh học sử dụng tế bào nuôi.
Các đại diện Mycoplasma gây bệnh ở một số động vật được trình bày ở
bảng 1.2

8
Bảng 1.2
: Các đại diện Mycoplasma gây bệnh ở một số động vật có vú
(Theo Razin và cs, 1998)
[123]
Vật chủ Bệnh Căn nguyên Trâu, bò
Viêm phổi
M.mycoides,M.bovis, M.dispa. Ureaplasmas
Viêm khớp
M.bovis, M.bovigenitalium
Viêm vú
M.bovis, M.canifornicum
Sảy thai
M.bovis
Viêm âm đạo
Ureaplasmas, M.bovigenitalium
Chưa xác định rõ
M.bovirhinis M.alkalescens, M.arginini,

A.equifetable, Ahippikon, A.laidlawii
Chuột
Viêm phổi
M.pulmonis
Viêm khớp
M.arthitidis
R
ối loạn thần kinh
M.neurolyticum
Chuột
lang
Chưa rõ
M.caviae
Chó
Viêm phổi
M.cynos
Chưa rõ
M.spumans, M.maculosum, M.edwardii,
M.molare, M.canis, M.opalescens.
Mèo
Viêm phổi
M.felis, M.feliminutum, M.gateae.

Các Mycoplasma có xu hướng khá đặc trưng cho từng loài vật chủ, phân
bố của bệnh trên toàn thế giới, có nhiều loài phân lập được từ chim và động

9
vật mà tình trạng bệnh hiện tại chưa xác định được.
Mycoplasma thường bám
chắc vào các màng nhầy của vật chủ và một số khác cố định vào các tế bào
10
Trong các loài Mycoplasma đã được phân lập, MG là loài gây bệnh chủ
yếu cho gà và bệnh do MG ở gia cầm được xếp vào danh sách B của các bệnh
truyền nhiễm nguy hiểm ở gia cầm do Tổ chức Dịch tễ Thế giới OIE (2000)

[112]
đánh giá. Theo Yoder năm 1990[157], MG thuộc týp huyết thanh A.
1.1.2 Đặc điểm cấu trúc và huyết thanh học của MG
- Hình thái:
Mycoplasma là loại vi sinh vật đa hình thái, có hình sợi, hình nhẫn, kích
thước xấp xỉ 0,1 µm ÷ 0,8 µm. Vi khu
ẩn MG có kích thước nhỏ 0,25 µm ÷
0,5 µm, thành tế bào không ổn định, bắt mầu tốt với thuốc nhuộm Giemsa.
Hai hình dạng thường thấy nhất là hình quả lê và hình chai với cấu trúc đầu
chóp trên có các cơ quan bám dính giúp MG có khả năng bám vào thành tế
bào vật chủ (Razin, 1992)[122], (Razin và cs, 1998)[123].
- Cấu tạo:
Trong cấu tạo của MG người ta thấy các chất đặc trưng đối với các tế
bào vi khuẩn (các mucotit). Lớp vỏ ngoài cùng của MG chỉ là màng nguyên
sinh chất dài 75A
0
÷ 100A
0
. Trong tế bào MG có thể tìm thấy hạt Riboxom có
đường kính 0,2 µm và các sợi nhân. Đây là vi sinh vật có khả năng tự nhân
đôi có kích thước nhỏ nhất.
Hai đặc điểm của MG khác biệt với các vi khuẩn khác là kích thước
genome và thành phần các bazơ nitơ của ADN, MG có cả ADN và ARN, nó

thuần, đặc trưng, sau đó nuôi cấy trong môi trường nước thịt để làm các phản
ứng tiếp theo.
Môi trường nước thịt thường được sử dụng nuôi cấy MG để sản xuất
kháng nguyên (Capenter và cs, 1981)[38].
MG làm tan hồng cầu ngựa hoàn toàn trong môi trườ
ng đặc và gây
ngưng kết hồng cầu gà, gà tây. MG cũng có thể nuôi cấy trên phôi gà (Zain và
Bradbury, 1996)[159].
1.1.4 Đặc tính gây bệnh của MG
Mầm bệnh MG có thành tế bào không ổn định nên hình dạng của nó rất

12
dễ bị biến đổi, nó có thể có dạng hình cầu đến hình sợi mảnh, có cơ quan bám
dính ở một đầu, cơ quan này có hình cầu, nhô ra và được gọi là “bleds”. Khi
mầm bệnh xâm nhập vào vật chủ, nó chui vào giữa các nhung mao niêm mạc
đường hô hấp hoặc đường sinh dục. Phần bleds của vi khuẩn bám vào phần
đuôi sialic của thụ quan sialoglycoprotein hoặc sialoglycolipit của tế bào vật
chủ. Sự bám dính này đủ chắc để nó không bị đào th
ải ra ngoài bởi nhu động
và quá trình tiết dịch của niêm mạc. MG có thành tế bào không ổn định nên
cũng có hiện tượng hoà nhập giữa màng tế bào vật chủ và màng nguyên sinh
của vi khuẩn, các enzym thuỷ phân, neuraminidase, peroxidaza heamolysin và
các loại độc tố khác được đưa vào tế bào vật chủ. Những tác động đó có thể
dẫn tới tế bào bị tổn thương, thoái hoá và cơ thể có thể có những đáp ứng
miễn dịch và số
t. Hơn nữa, do có sự xâm nhập của tế bào đơn nhân tới phần
mô bào của lớp dưới niêm mạc, do một số lượng lớn tế bào lympho và đại
thực bào thẩm xuất dẫn tới sự dày lên của phần tổ chức bị tấn công. Mầm
bệnh gây tổn thương các cơ quan hô hấp, tuần hoàn ở phổi làm rối loạn toàn
bộ cơ thể gà bệnh. Mầm bệnh có th