Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
1
ĐA
̣
I HO
̣
C QUÔ
́
C GIA HA
̀
NÔ
̣
I
TRƯƠ
̀
NG ĐA
̣
I HO
̣
C KHOA HO
̣
C TƯ
̣
NHIÊN
TRẦN THỊ DUNG
1.1.1. Lịch sử ra đời 2
1.1.2. Phân loại 2
1.1.3. Đánh giá tác dụng 2
1.2. Kháng sinh β – Lactam 3
1.2.1. Định nghĩa 3
1.2.2. Cấu trúc và phân loại 3
1.2.3. Tính chất vật lý và hóa học 7
1.2.4. Tác dụng 7
1.2.5. Điều chế 8
1.2.6. Tình hình sử dụng thuốc kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện
nay 9
1.3. Các phương pháp định lượng β – Lactam 11
1.3.1. Các phương pháp quang học 11
1.3.2. Các phương pháp điện hóa 12
1.3.3. Các phương pháp điện di mao quản 12
1.3.4. Sắc kí bản mỏng 13
1.3.5. Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) 14
Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 17
2.1. Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu 17
2.1.1. Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu 17
2.1.2. Nội dung nghiên cứu 17
2.2. Phương pháp nghiên cứu – Phương pháp RP- HPLC 18
2.2.1. Nguyên tắc chung và trang bị của phương pháp HPLC 18
Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
4
2.2.2. Sắc ký hấp phụ pha ngược RP-HPLC 20
2.2.3. Detector huỳnh quang 22
2.2.4. Một số đại lượng đặc trưng của HPLC 23
2.2.5. Phân tích định lượng bằng HPLC 25

3.6.2. Phân tích mẫu sinh học 63
3.7. Kết quả một số phương pháp khác xác định kháng sinh cùng loại 68
3.8. Hướng phát triển của đề tài 70
KẾT LUẬN 71
TÀI LIỆU THAM KHẢO 73
PHỤ LỤC 79 Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
6
DANH MỤC BẢNG

8
Bảng 3.5. Sự phụ thuộc của thời gian lưu vào tỉ lệ giữa dung môi
hữu cơ và đệm
41
9
Bảng 3.6. Sự phụ thuộc của thời gian lưu vào tỉ lệ giữa ACN và
MeOH
43
10
Bảng 3.7. Sự phụ thuộc của k’ vào tỉ lệ giữa ACN và MeOH
43
11
Bảng 3.8. Thời gian lưu của chất phụ thuộc vào nồng độ đệm
44
12
Bảng 3.9. Diện tích píc chất phân tích tại nồng độ đệm khác nhau
45
13
Bảng 3.10. Thời gian lưu của các chất phân tích phụ thuộc vào tốc
độ pha động
47
14
Bảng 3.11. Diện tích pic của các chất phân tích phụ thuộc vào tốc
độ pha động
47
15
Bảng 3.12. Sự phụ thuộc của S
pic
vào nồng độ chất phân tích
51

21
Bảng 3.18. Khảo sát độ lặp lại của phép đo theo diện tích pic
58
22
Bảng 3.19. Thông tin mẫu thuốc phân tích
59
23
Bảng 3.20. Kết quả độ thu hồi xác định β-Lactam theo phương pháp
thêm chuẩn trong mẫu thuốc
61
24
Bảng 3.21. Kết quả tính nồng độ C
x
và sự sai khác hàm lượng so
với kết quả in trên nhãn thuốc
63
25
Bảng 3.22. Hiệu suất thu hồi của mẫu nước tiểu
64
26
Bảng 3.23. Hiệu suất thu hồi của mẫu máu
66
ng dư kha
́
ng sinh trong nư ớc tiểu
nhiều, còn gây ra các bệnh về thn . Đồng thời, lươ
̣
ng dư na
̀
y tha
̉
i ra môi trươ
̀
ng se
̃

gây lên như
̃
ng hâ
̣
u qua
̉
vô cu
̀
ng nghiêm tro
̣
ng . Vì vy, kiểm soát và phân tích thuốc
kháng sinh đối với người bệnh là biện pháp cần thiết để nâng cao hiệu quả sử dụng
chúng.
Có rất nhiều phương pháp tách khác nhau. Trong đó, phương pháp tách sắc
ký là phương pháp tách chọn lọc có độ nhạy cao, lượng mẫu bơm ít, thời gian phân
tích ngắn.

3
N
H
O
CO
R
COOM
2
3
4
1
56
7

Hình 1.1. Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin
Tên gọi chung công thức của các penicillin khi chưa có gốc R là: (2S,5R,6R
3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid
Khi thay thế R bằng các gốc khác nhau, những cacbon bất đối có cấu hình 2S,
5R, 6R ta có các penicilin có độ bền, dược động học và phổ kháng khuẩn khác
nhau. Với M là gốc cation thường là: K, Na, H.
Nhóm kháng sinh penicillin được chia thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác
nhau [1].

Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
10
Bảng 1.1. Phân loại và cấu trúc một số penicillin
Tên kháng sinh
R
Hoạt tính

Lactam được.
Cloxacillin
(CLO)
Cl
N
O
C-
CH
3

6-{[3-(2-chlorophenyl )-5-methyl-
oxazole-4-carbonyl]amino}
Nhóm penicillin phổ rộng
Ampicillin
(AMP)
CH-
NH2NH2

6-([(2R)-2-amino-2-
phenylacetyl]amino)
Phổ rộng, tác dụng cả
khuẩn gram (+) và (-).
Không kháng β-
lactamase và
penicilliiase
Amoxicill
(AMO)
CH-
NH2NH2
HO


Hình 1.2. Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin
Tên gọi chung của các cephalosporin khi chưa có gốc R là: (6R,7R) 8-oxo-5-
thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid
Khi thay đổi các gốc R, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R được các
cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn và dược động học khác nhau.
Dựa vào khổ kháng khuẩn, chia các cephalosporin thành 4 thế hệ. Các
cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn gram dương mạnh hơn, nhưng
trên gram âm yếu hơn thế hệ sau [1].
Bảng 1.2. Phân loại và cấu trúc của các cephalosporin

Kháng sinh
R1
R2
R3
I: tác dụng
mạnh nhất
trên vi khuẩn
gram (+), yếu
nhất trên
gram (-).
Không bền và
dễ bị β-
lactamase phá
hủy
Cephalexin
(CEP)
CH-
NH
2

Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
12
II: tác dụng
yếu hơn trên
vi khuẩn
gram (+),
mạnh hơn trên
gram (-) so
với thế hệ I.
Bền với β-
lactamase.
Cefaclor
(CEF)
CH-
NH
2

H
Cl
Cefprozil
CH-
NH
2
OH

H
-CH=CH-CH
3
III: tác dụng

)
2
O

H
N
+
-CH
2

IV: hoạt phổ
tác dụng như
thế hệ III
nhưng tốt hơn
và kháng
nhiều β-
lactamase hơn
Cefepim
S
N
N
NH
2
CH
3
O

H
N
+

pK
a1
Tên kháng sinh
pK
a1
Tên kháng
sinh
pK
a1

AMP
2,7
CEP
2,6
CEF
2,75

1.1.4. Tác dụng
Cơ chế:
Các penicillin có khả năng acyl hóa các D- alanin tranpeptidase, làm cho quá
trình tổng hợp peptidoglycan không được thực hiện. Sinh tổng hợp vách tế bào bị
ngừng lại và ít tác dụng trên vi khuẩn gram (-). Mặc khác, các penicillin còn hoạt
hóa enzim tự phân giải murein hydroxylase làm tăng phân hủy vách tế bào, kết quả
là vi khuẩn bị tiêu diệt.
Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của màng tế bào vi khuẩn nên chủ yếu
kìm hãm sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn. Các kháng sinh β-lactam có hoạt phổ
rộng [13].

tổng hợp. Ví dụ khi sản xuất penicillin G, tiền chất thêm vào là acid phenylacetic.
Tuy nhiên không phải tiền chất nào cũng định hướng được quá trình lên men. Trong
môi trường nuôi cấy có tạo ra các acid amin → peptid → polypeptide. Penicillin tạo
thành từ một tripeptid, sau đó acyl hoá bởi men. Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
15
Bán tổng hợp:
Các penicillin bán tổng hợp bằng cách chế tạo acid 6-amino penicillanic
(A6AP).
Nuôi cấy nấm penicillium không thêm tiền chất, khi đó môi trường dồi dào
A6AP, chiết lấy trực tiếp.
Tách phần phenylacetyl (C
6
H
5
-CH
2
-CO-) khỏi phân tử penicillin G bằng
acylase thích hợp rồi chiết lấy A6AP. Acyl hoá A6AP với clorid acid trong môi
trường acetone, có mặt triethylamin để hấp thu HCl giải phóng ra trong phản ứng
được penicillin khác.
Tổng hợp hoá học:
Chưa được ứng dụng rộng rãi.
1.1.6. Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay
Ta biết rằng, có nhiều loại kháng sinh khác nhau, tác động bằng các cơ chế
khác nhau đối với các vi trùng khác nhau. Kháng sinh chỉ có tác dụng với các bệnh
do vi trùng (bacteria), không có tác dụng với các bệnh do siêu vi (virus). Để điều trị

Mai cho thấy, hơn 70% bệnh nhân dị ứng do dùng kháng sinh, trong đó có không ít
trẻ em. Sốc phản vệ do dùng kháng sinh là tai biến nghiêm trọng nhất, dễ gây tử
vong. Nhiều trường hợp dị ứng thuốc gây giảm hồng cầu, bạch cầu, thiếu máu huyết
tán, xuất huyết giảm tiểu cầu, tổn thương tế bào gan Phó giám đốc Bệnh viện Nhi
Trung ương Nguyễn Văn Lộc thừa nhn, tiền mua kháng sinh đang chiếm tới 60%
tổng kinh phí mua thuốc của bệnh viện. Nhiều loại kháng sinh gần như đã bị kháng
hoàn toàn. Đối với vi khuẩn E.coli (gây bệnh tiêu chảy, viêm phổi, nhiễm trùng
huyết), tỉ lệ kháng thuốc ở Ampiciline là 88%, Amoxiciline là 38,9%. Đối với vi
khuẩn Klebsiella (gây bệnh nhiễm trùng huyết và viêm phổi), tỉ lệ kháng thuốc của
Ampiciline gần 97% và Amoxiciline là 42%.
Các nhà chuyên môn đã báo động về hu quả nguy hiểm của sự lạm dụng
kháng sinh từ nhiều chục năm nay. Năm 1981, sau hội nghị ở Santa Domingo, các
nhà chuyên môn đã thành lp “Liên Hiệp vì sự Sử Dụng Kháng Sinh Hợp Lý”
(Alliance for the Prudent use of Antibiotics) có thành viên thuộc 93 quốc gia nhằm
chống lại sự lan tràn của các bệnh do vi trùng kháng thuốc tại các nước đang phát
triển.
Năm 2001, Tổ chức Y Tế Thế Giới đã đề ra “Kế Hoạch Toàn Cầu để Kiểm
Soát Sự Đề Kháng Kháng Sinh”. Kế hoạch đề cp đến mọi hoạt động y tế của tất cả
Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
17
các quốc gia đã phát triển cũng như đang phát triển: Phòng thí nghiệm phải tăng
cường khả năng chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng, giúp chẩn đoán nhanh chóng và
chính xác, đo lường độ nhạy của kháng sinh, đo nồng độ kháng sinh trong máu.
Ngành dược cần cung cấp đầy đủ thuốc thiết yếu, ngăn ngừa sự lưu hành của các
thuốc giả, 5% lượng thuốc lưu hành tại các nước đang phát triển là thuốc giả mạo,
không đúng phẩm chất, hàm lượng hoặc không có hoạt chất.
Nếu ngăn ngừa được sự phát triển của các vi trùng kháng thuốc chúng ta sẽ
bảo vệ được môi trường sống, duy trì được sự hữu hiệu của kháng sinh, hạn chế
được chi phí về y tế và cứu đươc nhiều sinh mạng.

giới hạn phát hiện của AMO là 0,73 mg/l, AMP 0,76 mg/l.
Wei Liu và cộng sự [49], sử dụng phản ứng quang hóa của β-lactam với hệ
luminol- K
3
Fe(CN)
6
kết hợp phương pháp chiết pha rắn mắc trực tiếp đã phân tích
một số β-lactam (penicillin, cefradine, cefadroxil, CEP) trong sữa đa
̣
t giơ
́
i ha
̣
n pha
́
t
hiê
̣
n thấp: PEN là 0,5 mg/l, cefradine 0,04 mg/l, cefadroxil là 0,08 mg/l; 0,1 mg/l
CEP. Kết quả được kiểm chứng lại bằng phương pháp HPLC, detector UV-VIS,
nồng độ CEP trong mẫu là 0,1 mg/l.
Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp,
các phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng
sinh và trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất phân
tích, việc xác định sẽ kém chính xác. Ngoài ra, trong nhiều trường hợp chất phân
tích cần thủy phân mới phát hiện được cũng là sự hạn chế của phương pháp này.
1.2.2. Phương pháp điện hóa
Một số phương pháp điện hóa đã được ứng dụng để phân tích các β-lactam
nhưng không phổ biến nhiều. Theo [26], Daniela P. Santos và cộng sự sử dụng
sensor điện thế phân tích AMO, đạt giới hạn phát hiện 0,92 μM (0,39 mg/l) trong

hạn phát hiện tương ứng 1,62 và 0,89 mg/l; khoảng tuyến tính 5 – 200 mg/l. Mục
đích của phương pháp được ứng dụng để nghiên cứu độ bền của kháng sinh họ
Cephalosporins trong nước tại nhiệt độ khác nhau (+25, +4 và -18
0
C). Kết quả cho
thấy các kháng sinh giảm nồng độ không lớn hơn 20% tại nhiệt độ phòng sau khi
pha loãng.
M.I.Bailon-Perez và cộng sự [38] sử dụng phương pháp CZE và detector UV
– DAD, pha động dùng hệ đệm tris 175 mM pH =8 và 20% (v/v) ethanol, dùng kĩ
thut chiết pha rắn làm sạch và làm giàu mẫu ứng dụng phân tích đồng thời AMP,
AMO, dicloxacillin, CLO, OXA, PEN, nafcillin trong nền mẫu nước (nước sông,
nước thải…). Giới hạn phát hiện tương ứng 0,8; 0,8; 0,25; 0,30; 0,30; 0,9; 0,08 μg/l
cùng độ thu hồi đạt 94 – 99 % với độ lệch chuẩn tương đối thấp hơn 10%.
1.2.4. Sắc ký bản mỏng ( TLC)
Phương pháp này đơn giản và không yêu cầu thiết bị đặc biệt dùng để kiểm
tra đánh giá sơ bộ các chất phân tích có tính ưu việt, tiến hành nhiều mẫu cùng một
lúc song song rất tiện lợi. Khi TLC được trang bị phần phát hiện là một máy đo
Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
20
quang có thể phân tích định tính và định lượng. Tuy nhiên phương pháp này chỉ
dùng để định tính.
1.2.5. Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC)
Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng
quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất
là lĩnh vực hoá dược, sinh hoá, hoá thực phẩm, nông hoá, hoá dầu, hoá học hợp chất
thiên nhiên, phân tích môi trường,… đặc biệt là tách và phân tích lượng vết các
chất.
Một số các kết quả nghiên cứu về kháng sinh


nm – 422 nm) đạt giới hạn phát hiện lần lượt 0,5 μg/kg và 0,3 μg/kg. Tuy vy, do
các β-lactam ít tạo phức phát huỳnh quang và cơ chế phát quang dựa trên phản ứng
Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
21
quang hóa [17, 25] nên chỉ áp dụng với số ít chất hoặc phân tích riêng từng chất chứ
không áp dụng phân tích đồng thời nhiều kháng sinh cùng lúc được.
Trong [33, 34], Boison J.O. và cộng sự sử dụng cột Spherisorb ODS2
(250mm*4,6mm, 5μm); pha động : ACN –Na
2
S
2
O
3
15,7mM trong đệm photphat
0,1M pH 6,5; tốc độ pha động 1ml/phút, detector UV 325nm, phân tích đồng thời
AMO, AMP, PEN, CLO trong sữa và thịt bò đạt giới hạn phát hiện 2-5

g/kg.
Ngoài ra, còn dùng các detector khác như detector điện hóa, detector độ
dẫn… để phân tích các β-lactam.
Trong [24], D.Hurtaud và cộng sự sử dụng etylaxetat để chiết tách CLO,
OXA, dicloxacillin từ thịt bò đạt hiệu suất thu hồi tương ứng 88%, 94%, 91%. Còn
trong [46], WJ Blanchflower và cộng sự dung diclometan và hexan để tách
penicillin V, PEN, oxacillin, CLO, dicloxacillin trong thn, thịt và sữa, hiệu suất đạt
89-117%.
Khi tách và làm giàu các β - Lactam trong mẫu phân tích bằng kỹ thut SPE
thì thường dùng theo hai phương pháp chiết pha đảo (thường là C
18
) và trao đổi ion

Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
23
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu
2.1.1. Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu
Hiện nay, các chỉ tiêu về chất lượng, dư lượng các chất độc hại là một vấn đề
cấp thiết đang được quan tâm. Trong đó, chỉ tiêu về dư lượng kháng sinh trong mẫu
thuốc và mẫu sinh học là một mảng đề tài rất thực tế và quan trọng. Như chúng tôi
đã đề cp trong bản lun văn này, vấn đề lạm dụng không đúng hàm lượng kháng
sinh đem lại rất nhiều tác hại và ảnh hưởng đến sức khoẻ con người.
Trong đề tài này, chất phân tích mà chúng tôi chọn để nghiên cứu là
ampicillin (AMP), cephalexin (CEP), cefaclor (CEF) là các kháng sinh β - Lactam
được sử dụng phổ biến hiện nay.

phân bố lại giữa hai pha, trong khi pha động chảy liên tục qua cột tách với một tốc
độ và thành phần pha động nhất định, hay gradient. Nghĩa là đối với một phân tử
chất tan, thì trong quá trình sắc ký, nó luôn chuyển từ pha này sang pha kia nhiều
lần từ đầu cột đến cuối cột sắc ký. Mặt khác cũng vì cấu trúc và tính chất của mỗi
phân tử chất tan là khác nhau nên tốc độ di chuyển trung bình của mỗi chất tan là
khác nhau. Quá trình sắc ký có thể xảy theo 3 cơ chế sau:
- Tương tác hấp phụ
- Tương tác trao đổi ion
- Tương tác theo cơ chế rây phân tử
Tương tác với 3 cơ chế trên có 3 phương pháp tiến hành tách khác nhau:
- Sắc ký hấp phụ (chất hấp phụ pha thường NP-HPLC) và hấp phụ pha ngược
RP-HPLC).
- Sắc ký trao đổi ion (EX-HPLC)
- Sắc ký rây phân tử (Gel-HPLC)
Sơ đồ tổng quát của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao được tóm tắt như sau:
Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
25 Hình 2.1. Sơ đồ chức năng của thiết bị HPLC
1. Bộ phn cấp dung môi (pha động)
2. Bơm cao áp
3. Van bơm mẫu
4. Cột tách (pha tĩnh)
5. Detector
6. Máy ghi tín hiệu
7. Bơm mẫu tự động
8. Phần điều khiển, xử lý kết quả
2.2.2. Sắc ký hấp phụ pha ngƣợc RP-HPLC

X
i
+ M ↔ MX
i
+ S
r
(Quá trình giải hấp)
Trong đó: S
r
là pha tĩnh
Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
26
X
i
là chất phân tích
S
r
X
i
chất phân tích hấp phụ trên pha tĩnh
M là pha động
MX
i
chất phân tích trên pha động.
Ngoài bản chất của nền pha tĩnh, kích thước hạt nhồi và chiều dài cột tách cũng ảnh
hưởng rất lớn đến khả năng phân tách các chất. Do vy, trong điều kiện phân tích
thực tế chúng ta phải nghiên cứu, khảo sát chọn pha tĩnh có cỡ hạt, chiều dài cột
tách như thế nào để đạt được độ phân giải theo yêu cầu phân tích. Thông thường đối
với một hỗn hợp chất phân tích nhất định, yếu tố quyết định đến hiệu quả tách ở đây