ii

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
BƯỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT
FRUCTOOLIGOSACCHARIDES (FOS) BỞI
CHẾ PHẨM PECTINEX ULTRA SP-L CBHD: TS. HUỲNH NGỌC OANH
SVTH: TRẦN TRƯỜNG LUÂN
MSSV: 60601418
BỘ MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Tp. HCM, tháng 01 năm 2011
ii



ABTRACTS

Fructooligosaccharides (FOS) from sucrose, new alternative sweeteners wih functional
properties such as low calories, no cariogenicity, safety for diabetics. Pectinex Ultra
SPL is commercial enzyme with fructosyltransferase activity, is able to catalyze the
production of short chain fructooligosaccharide. It was immobilized by alginate gel
entrapment. The optimum of immobilization is 3.5% alginate, 5% CaCl
2
, protein-
enzyme immobilized yield 57.79%. Using Respones Surface Methodology with CCD
predits the best tranfructosylating condition to produce FOS by immobilized enzyme:
Temperature = 55
o
C, pH = 5.6, initial sucrose concentrations = 58.76% (w/v), shaking
speed at 159 rpm. A typical solution product consists of a mixture of sucrose
(95mg/ml), glucose (218mg/ml), FOS (279.96mg/ml).
iv MỤC LỤC
CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC HÌNH vii
DANH MỤC BẢNG ix
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu 1
1.3. Nội dung nghiên cứu 2
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

3.3.2. Phương pháp tính toán hồi quy và kiểm định ANOVA 42
3.3.3. Phân tích hồi quy đa tham số 44
3.4. Phương pháp tiến hành nghiên cứu 45
3.4.1. Xác định hoạt tính fructosyltransferase của chế phẩm Pectinex Ultra SP-L
tự do 45

3.4.2. Quá trình cố định chế phẩm Pectinex Ultra SP-L 47
v

3.4.3.
Phương pháp tối ưu bằng phương pháp đáp ưng bề mặt trên chế phẩm
Pectinex Ultra SP-L cố định 49

3.4.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và tỷ lệ enzyme/cơ chất ảnh
hưởng đến hoạt tính fructosyltransferase tự do của chế phẩm Pectinex Ultra S-PL
tự do. 50

3.4.5. Tối ưu hóa ảnh hưởng của 4 yếu tố: pH, nhiệt độ, nồng độ sucrose ban
đầu, tốc độ lắc đến quá trình tổng hợp FOS bằng chế phẩm Pectinex Ultra SPL cố
định. 51

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 52
4.1. Đường chuẩn 52
4.1.1. Đường chuẩn xác định hàm lượng đường khử glucose 52
4.1.2. Đường chuẩn xác hàm lượng protein 53
4.2. Hoạt tính fructosyltransferase và hàm lượng protein trong chế phẩm
Pectinex Ultra SPL tự do 53

4.2.1. Hàm lượng protein của chế phẩm Pectinex Ultra SPL 53
4.2.2. Hoạt tính fructosyltransferase của chế phẩm enzyme Pectinex Ultra SPL

cố định 72

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74
5.1 Kết luận 74
5.2 Kiến nghị 75
TÀI LIỆU THAM KHẢO 76
PHỤ LỤC 81
vi

CÁC TỪ VIẾT TẮT FOS: Fructooligosaccharides
GF : Sucrose
GF
2
: 1-kestose
GF
3
: nytose
GF
4
:1F-fructofuranosylnytose
RSM : Response Surface Mothodology – Phương pháp đáp ứng bề mặt
CCD : Central Composite Design – Thiết kế đáp ứng tâm
ANOVA: Analysis of Variance – Giải tích phương sai
vii

pháp định lượng đường khử DNS 46

viii

Hình 3.3: Phương pháp cố định enzyme fructosyltransferase trên chất mang Alginate.
48

Hình 3.4: Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 49
Hình 4.1: Đường chuẩn xác định hàm lượng glucose 52
Hình 4.2: Đường chuẩn xác định hàm lượng protein 53
Hình 4.3: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính fructosyltransferase của chế phẩm Pectinex
Ultra SP-L tự do. 55

Hình 4.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính fructosyltransferase của chế phẩm
Pectinex Ultra SP-L tự do. 56

Hình 4.5: Ảnh hưởng của tỷ lệ Enzyme/Cơ chất đến khả năng tạo glucose do hoạt tính
fructosyltransferase của chế phẩm Pectinex Ultra S-PL tự do. 57

Hình 4.6: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng tổng hợp FOS của chế phẩm
Pectinex Ultra S-PL tự do. 58

Hình 4.7: Ảnh hưởng của nồng độ alginate trong quá trình cố định protein lên chất
mang ở nồng độ alginate 2.5% (trái) và alginate 3.0% (phải). 59

Hình 4.8: Ảnh hưởng của nồng độ alginate trong quá trình cố định protein lên chất
mang ở nồng độ alginate 3.5% (trái) và alginate 4.0% (phải). 60

Hình 4.9: Hiệu suất cố định enzyme ở nồng độ alginate 2.5%(w/w). 61
Hình 4.10: Hiệu suất cố định enzyme ở nồng độ alginate 3.0 %(w/w). 61

Bảng 2.5: Lượng FOS hình thành theo thời gian phản ứng 20
Bảng 2.6: Một số ứng dụng của alginate 31
Bảng 2.7: Ảnh hưởng nồng độ alginate lên hiệu suất cố định. 33
Bảng 2.8: Ảnh hưởng của nồng độ saccharose lên hiệu suất cố định. 33
Bảng 3.1 : Tỷ lệ pha loãng mẫu protein ban đầu. 36
Bảng 3.2 : Mẫu điều tra k mức 2 yếu tố không lặp 43
Bảng 3.3. Bảng phân tích ANOVA hai yếu tố không lặp 43
Bảng 3.4 : ANOVA phân tích hồi qui đa tham số. 44
Bảng 3.5: Bảng ANOVA kiểm định tương thích thực nghiệm của phương trình hồi
quy 45

Bảng 4.1 : Độ biến thiên mật độ quang theo mẫu glucose chuẩn. 52
Bảng 4.2 : Độ biến thiên mật độ quang theo mẫu protein chuẩn. 53
Bảng 4.3: Xác định hàm lượng protein trong mẫu chế phẩm Pectinex Ultra Sp-L tự
do. 54

Bảng 4.4: Xác định hoạt tính fructosyltransferase của chế phẩm Pectinex Ultra SP-L
tự do. 54

Bảng 4.5 : Xác định hoạt tính fructosyltransferase theo ảnh hưởng của pH. 55
Bảng 4.6 : Xác định hoạt tính frucotsyltransferase theo ảnh hưởng của nhiệt độ 56
Bảng 4.7 : Hàm lượng glucose theo tỷ lệ enzyme/cơ chất. 57
x

Bảng 4.8: Ảnh hưởng của thời gian phản ứng tạo FOS ở chế phẩm Pectinex Ultra SP-
L dạng tự do. 58

Bảng 4.9: Phân tích ANOVA đối với 2 nhân tố : tỷ lệ enzyme: alginate và nồng độ
CaCl
2

trong cơ thể,
chống loãng xương.
Hiện nay, tại Việt Nam bệnh béo phì, tiểu đường ngày càng có tầm ảnh hưởng
đến cuộc sống. Do đó việc tìm nguồn chất ngọt mang ít giá trị năng lượng và không
làm thay đổi nồng độ glucose trong máu để thay thế cho các chất ngọt truyền thống là
một yêu cầu cấp thiết. Bên cạnh đó công nghiệp thực phẩm chức năng đang ngày càng
phát triển mạnh và mang lại giá trị kinh tế cao. Việt Nam có nhiều tiềm năng phát triển
công nghiệp sản xuất FOS với nguồn mía đường cung cấp nguyên liệu đầu vào cho sản
xuất.
Từ thực trạng trên, sản xuất FOS công nghiệp là vấn đề hết sức cần thiết hiện
nay, mang lại lợi ích về sức khỏe con người cũng như nguồn lợi về kinh tế.
1.2. Mục tiêu
Nghiên cứu này thực hiện với mục đích xác định điều kiện tối ưu khi sản xuất
FOS bằng chế phẩn Pectinex Ultra SPL cố định trên gel alginate bước đầu định hướng
các nghiên cứu về sản xuất FOS bằng enzyme cố định sau này. Hướng nghiên cứu tập
trung vào hai mục tiêu chính:
Chương 1: Mở đầu
2

+ Xác định điều kiện cố định tối ưu của chế phẩm Pectinex Ultra SPL trên gel
alginate.
+ Xác định điều kiện tối ưu sản xuất FOS bằng enzyme cố định.
1.3. Nội dung nghiên cứu
Gồm ba nội dung chính:
+ Nghiên cứu ảnh hưởng đơn lẻ của pH, nhiệt độ, tỷ lệ enzyme/cơ chất lên hoạt
tính fructosyltransferase của chế phẩm Pectinex Ultra SPL. Tìm khoảng biến thiên cho
mô hình quy hoạch thực nghiệm CCD.
+ Nghiên cứu sự phụ thuộc quá trình cố định chế phẩm Pectinex Ultra SPL trên
gel alginate bởi các yếu tố: nồng độ alginate sử dụng, tỷ lệ enzyme/alginate, nồng độ
CaCl

chống béo phì, an toàn cho người bị bệnh tiểu đường, ngăn ngừa sâu răng … Đặc
biệt, FOS còn giúp tăng khả năng hấp thu Ca, Mg, Fe…, ngăn ngừa bệnh thiếu máu,
thiếu sắt, cân bằng ion Mg
2+
, Ca
2+
trong cơ thể, chống loãng xương [20].
FOS là chất tạo ngọt năng lượng thấp, không được hấp thu ở tuyến tiêu hóa
trên, tuy nhiên được sử dụng chọn lọc bởi hệ vi khuẩn đường ruột Bifidobacteria,
nên có đặc tính prebiotic. FOS đang dần thay thế các loại đường truyền thống như
đường kính và syrup giàu fructose, được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm chức
năng, công nghệ sản xuất bánh kẹo truyền thống [30].
Chương 2: Tổng quan tài liệu
4

Việc sử dụng FOS hằng ngày đem lại những lợi ích cho sức khỏe, mỗi ngày sử
dụng 4-15g FOS giúp cơ thể khỏe mạnh, giảm bệnh táo bón được xem là vấn đề của
xã hội hiện nay, giúp trẻ sơ sinh thích ứng với cuộc sống.
2.1.2. Nguồn gốc FOS – Cấu tạo
FOS có nhiều trong tự nhiên, tồn tại trong các loại rau quả như chuối, mận,
đào, quýt, atiso, cà chua, hành, tỏi, lúa mì, măng tây và mật ong [10,13]. Hàm lượng
FOS ở một số loại rau quả có thể tham khảo ở bảng 2.1 [8].
FOS là những oligosaccharide mà trong phân tử của chúng gồm một phân tử
đường sucrose liên kết với 1, 2 hay 3 gốc fructose thông qua mối liên kết β-2,1-
glucoside. Công thức tổng quát của đường FOS là GF
n
, trong đó n là số nhóm n = 2,
3, 4 (G là gốc đường glucose, F là gốc đường fructose), tương ứng là các đường 1-
kestose (GF
2

không có tính kinh tế do nồng độ rất thấp, lượng enzyme lại bị giới hạn bởi điều
kiện thời tiết, vì vậy, FOS thương mại được sản xuất bằng phương pháp tổng hợp
hoặc thủy phân [35].
FOS có thể được sản xuất ở quy mô công nghiệp từ nguồn nguyên liệu
sucrose, với xúc tác là enzymeβ-fructofuranosidase thu nhận từ các loại nấm mốc
như Aureobasidiums sp. và Aspergillus niger [35].
Bảng 2.1: Hàm lượng FOS của một số loại cây quả (mg/g chất khô) [8].
Loại cây
quả
1-Kestose
(GF
2
)
Nystose
(GF
3
)
Fructofuranosylnystose
(GF
4
)
Tổng FOS
(GF
n
)
Chuối
5.9
0.1
0.0
6.0

Rau dền đỏ
0.1
0.0
0.0
0.1
Rau cần tây
0.2
0.0
0.4
0.6
Hành ta
0.4
0.3
0.4
1.1
Dứa
0.5
0.0
0.0
0.5
Cà chua
0.2
0.0
0.4
0.6
Tỏi
8.7
1.2
0.4
10.3

quá trình tiêu hóa và hấp thu chất dinh dưỡng tốt hơn sucrose. Độ bền nhiệt ổn định
lên đến 140
o
C, pH hoạt dộng từ 4.0- 7.0 [13, 12].
Bảng 2.2: Đặc tính của FOS so với một số loại đường khác.
Đường
Độ ngọt
(Sucrose = 1)
Độ ổn định
Độ nhớt
Tính hút
ẩm
Nhiệt độ
pH
Sorbitol
0.7
< 160
0
C
2 – 10
Thấp
Cao
Xylitol
0.9
< 160
0
C
2 – 10
Rất thấp
Cao

Cao
Thấp
Lactitol
0.40
< 160
0
C
2 – 10
Rất thấp
Trung bình
Maltidex
0.75
< 160
0
C
2 – 10
Cao
Trung bình
FOS
0.30
< 160
0
C
2 – 10
Cao hơn
Trung bình

Ở dạng lỏng, FOS mạch ngắn là chất lỏng trong, không màu hoặc màu vàng
như syrup, có mùi trái cây và vị ngọt. Ở dạng bột, FOS có màu trắng đến vàng nhạt,
mùi trái cây và vị ngọt. FOS hòa tan trong nước [19].

béo trong quá trình trao đổi chất với sự hiện diện của FOS. Nguyên nhân của các
hiệu ứng này là do FOS không bị tiêu hoá ở ruột non bởi tác dụng của hệ enzyme
đường ruột, mà bị lên men trong ruột già dưới tác dụng của vi khuẩn
Bifidobacterium (là một chi trong họ Lactobacteraceae, tế bào hình que, phân
nhánh, thẳng hoặc cong, bất động, gram (+), sống kỵ khí, ưa ấm, không sinh bào
tử, thường gặp trong ruột già). Kết quả của quá trình là sinh ra các acid béo đoản
mạch (SCFA) như acid acetic, acid propionic và acid butyric. Các chất này sau
đó được thấm vào thành ruột già hoặc chuyển lên gan, ức chế sự gia tăng của
glucose và chất béo trong máu [34].
Đối với bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường (có hoặc không rối loạn tiết
insulin) ngoài sự bất bình thường về hàm lượng đường trong máu, chất béo trong
máu cũng luôn bị rối loạn. Vì thế việc hạn chế sự gia tăng hàm lượng chất béo
trong máu cũng là một biện pháp để chữa bệnh tiểu đường. FOS đã làm giảm
đáng kể hàm lượng phospholipid và triglyceride trong máu. FOS không chỉ làm
thay đổi hàm lượng chất béo trong máu mà còn có thể điều chỉnh sự tạo ra các
enzyme tổng hợp acid béo. Trong gan, hoạt lực của enzyme trên tăng lên nếu khi
dùng sucrose nhưng sẽ được bình thường hoá bởi sự cung ứng FOS. Như vậy
FOS có vai trò khá tích cực trong việc phòng và chữa bệnh tiểu đường xét ở góc
độ bệnh lý liên quan đến sự gia tăng của lipoprotein trong máu. Vì thế FOS hiện
nay được dùng nhiều như là một chất ngọt thấp năng lượng đặc biệt dành cho các
đối tượng mắc bệnh tiểu đường [2, 13].
2.1.4.2. Ảnh hưởng của FOS đến hệ vi sinh vật đường ruột
Nhiều carbohydrate được cho là prebiotic, trong đó bao gồm cả
fructooligosaccharides (FOS), galactooligosaccharide (GOS). Các prebiotic đã
được định nghĩa là một thành phần không tiêu hóa và ảnh hưởng có lợi trên
Chương 2: Tổng quan tài liệu
9

chủng chủ bằng cách chọn lọc kích thích sự tăng trưởng hoạt hoạt độ của vi
khuẩn trong ruột kết. FOS trở thành nguồn năng lượng cung cấp cho sự phát triển

Chương 2: Tổng quan tài liệu
10

thư, ngăn chặn sự hình thành khối u ở ruột kết. Ngoài ra vi khuẩn
Bifidobacterium còn có khả năng tạo vitamin, nhất là vitamin nhóm B, giảm
cholesterol trong máu và tái sinh hệ vi sinh vật đường ruột cho các bệnh nhân sau
khi dùng nhiều kháng sinh điều trị bệnh [8].
2.1.4.3. Ảnh hưởng của FOS đến bệnh sâu răng
Bệnh sâu răng chủ yếu là do vi khuẩn Streptococcus mutans và các liên cầu
khuẩn gây nên. Các vi sinh vật trên có rất nhiều trong khoang miệng của người
và động vật. Khi thức ăn đưa vào, chúng sẽ lựa chọn các thành phần dinh dưỡng
phù hợp để lên men, phát triển và gây bệnh. Streptococcus mutans sử dụng
nguồn đường tạo thành các acid và β-glucans không tan là nguyên nhân chính
gây sâu răng.Vì vậy nếu trong thành phần thức ăn của ta không chứa hoặc chứa ít
chất thích hợp cho quá trình sống và phát triển của loại vi sinh vật trên sẽ có thể
ngăn ngừa được bệnh.
Các thí nghiệm nuôi cấy vi sinh vật phân lập từ khoang miệng lên môi
trường FOS đã chứng tỏ cơ chế về khả năng phòng bệnh sâu răng của nó. Đó là
do FOS không phải là môi trường thích hợp cho các vi sinh vật gây bệnh trên
phát triển. Ngoài ra FOS không những chỉ có khả năng phòng mà còn có khả
năng chữa bệnh bệnh sâu răng. Vì thế ngày nay nhiều nơi trên thế giới người ta
đã dùng FOS thay thế cho đường kính trong thành phần ăn hoặc trong chế biến
bánh kẹo, đặc biệt là bánh kẹo cho trẻ em để phòng bệnh sâu răng [8, 21].
2.1.4.4. Vai trò thúc đẩy quá trình hấp thụ khoáng của FOS
Sử dụng FOS có thể tăng cường sự hấp thụ khoáng: magie, canxi, sắt và
kẽm. Trong đó đặc biệt là vai trò hấp thụ canxi. Nhờ đặc tính này, FOS có thể
giúp cho con người phòng và chống các bệnh về chuyển hoá và bệnh loãng
xương [17, 13]. Quá trình thúc đẩy hấp thụ canxi của FOS xảy ra trong ruột già.
Cơ chế thúc đẩy trên chưa được xác định một cách rõ ràng nhưng có một kết luận
chung là do ba yếu tố sau:

tiêu thụ trong cả nước lên đến 4000 tấn. Đường FOS bán trên thị trường Nhật Bản
rất đa dạng, từ loại có hàm lượng rất thấp đến loại có độ tinh khiết cao đến 98%,
phục vụ cho nhiều mục đích khác nhau, loại hàm lượng thấp dùng làm chất kích
thích trong môi trường lên men cho vi khuẩn Bifidobacterium, chất có hàm lượng
Chương 2: Tổng quan tài liệu
12

trung bình dùng cho người ăn trực tiếp hoặc bổ sung vào thực phẩm còn loại tinh
khiết dùng trong kỹ thuật phân tích [34].
Ở Mỹ và Nhật Bản người ta còn sử dụng FOS để làm chất bổ sung trong thức
ăn cho gia súc [34, 35]. Nhờ đặc tính của FOS là có thể tăng cường hoạt động của
hệ tiêu hoá nên giúp cho gia súc ăn nhiều, tăng cân nhanh.
Tại Trung Quốc đến tận năm 1992 công nghiệp sản xuất FOS mới bắt đầu,
nhưng trong vòng mười năm ngành công nghiệp này đã có bước phát triển vượt bậc.
Nếu như năm 1999 toàn Trung Quốc mới chỉ có 2 nhà máy sản xuất FOS tại Vân
Nam và Giang Tô với công suất 2000 tấn/năm thì đến đầu năm 2002 số nhà máy
sản xuất FOS trong toàn quốc đã lên đến mười cơ sở với công suất từ 2000 tấn đến
4000 tấn/năm. Sản phẩm FOS ở nước này được dùng nhiều cho các đối tượng già,
trẻ em và những người bệnh trong thời kỳ phục hồi sức khoẻ để tăng cường hoạt
động tiêu hoá, giúp cho các đối tượng trên nhuận tràng, ăn tốt.
Ở Mỹ và Châu Âu, nhiều công ty đã và đang xin chứng chỉ GRAS (Generally
Recognized As Safe) cho việc sử dụng sản phẩm FOS của mình, FOS đã được công
nhận chính thức bằng văn bản về độ an toàn thực phẩm. Nhờ đó số lượng người tiêu
dùng FOS ngày càng tăng cao [8].
Hiện nay các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc phân lập tuyển chọn giống
để sinh tổng hợp enzyme, ứng dụng enzyme trong sản xuất FOS và nghiên cứu tinh
chế FOS. Thông thường FOS phổ thông được sản xuất theo phương thức liên tục và
không liên tục. Trong phương thức sản xuất liên tục công nghệ cố định enzyme
hoặc cố định tế bào được sử dụng, còn đối với phương thức sản xuất không liên tục
thì sử dụng enzyme đã chiết tách. Giải pháp cố định enzyme và cố định tế bào trong

sucrose và glucose. Vì thế muốn thu được FOS có độ tinh khiết cao (FOS cao độ)
hoặc FOS tinh khiết, cần thiết phải tách bỏ hoặc chuyển hoá lượng glucose và
sucrose còn sót lại. Cho tới nay các phương pháp tinh sạch được áp dụng chủ yếu
bao gồm:
- Lọc gel: ở Nhật gần đây phương pháp này đã được đưa vào áp dụng ở qui mô
công nghiệp. Dựa trên nguyên lý của sự khác nhau về kích cỡ phân tử của các
cấu tử phân tán trong dịch mà người ta phân li được riêng rẽ từng loại đường,
nhờ đó có thể tách, loại bỏ glucose ra. Phương pháp này cần có hệ thống thiết bị
tinh lọc đồng bộ đắt tiền do đó hiệu quả kinh tế không cao.
- Lọc Nano: Đây là một phương pháp mới, sử dụng kỹ thuật thẩm thấu ngược, có
nhiều tính ưu việt rất phù hợp với qui mô công nghiệp [19].
- Phương pháp trao đổi ion: trong phương pháp này các đường thành phần được
phân li khi đi qua cột có chứa các hạt nhựa trao đổi ion. Nhờ đó ta có thể tách
glucose và sucrose ra khỏi dịch FOS.
Chương 2: Tổng quan tài liệu
14
Hình 2.5: Quy trình sản xuất FOS từ fructosyltransferase vi sinh vật [30].
Dùng công nghệ lên men: phương pháp này được thực hiện thông qua việc sử
dụng vi sinh vật để lên men glucose có trong dung dịch, loại vi sinh vật hay được
dùng là nấm men. Phương pháp này được sử dụng rất nhiều bởi nó cho hiệu quả
kinh tế cao, tuy thế nó cũng còn tồn tại là sản phẩm FOS bị nhiễm bẩn và gây mùi
vị lạ.
Dùng công nghệ enzyme: Có hai loại enzyme được sử dụng để phân giải
glucose là glucose isomerase (GI) và glucose oxidase (GOD).
Sử dụng enzyme GI: Trong phương pháp này enzyme GI có vai trò trong
chuyển hoá glucose có trong dịch thành fructose. Về lí thuyết fructose mới sinh ra
lại gắn kết với sucrose để tạo thành FOS. Nhưng trong thực tế thí nghiệm cho thấy