BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
LÊ THANH HẢI NGHIÊN CỨU THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG NGĂN CHẶN
BIẾN ĐEN CỦA DỊCH CHIẾT NẤM RƠM (Volvariella
volvacea) TRÊN TÔM SAU THU HOẠCH
Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch
Mã ngành: 60.54.10 LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGƯỜI HƯỚNG DẪN:
TS. HUỲNH NGUYỄN DUY BẢO
TS. NGUYỄN MINH TRÍ
NHA TRANG - NĂM 2013
- i -
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa
Sinh học và Môi trường, Trung tâm thí nghiệm thực hành – Trường Đại học Nha
Trang, gia đình và bạn bè luôn luôn chia sẽ cùng tôi trong quá trình nghiên cứu.
- iii -
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC BẢNG vi
DANH MỤC HÌNH vii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix
LỜI MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ nấm ở trong và ngoài nước 3
1.1.1. Tình hình sản xuất nấm ngoài nước 3
1.1.2. Tình hình sản xuất nấm trong nước 4
1.1.3. Các chất có hoạt tính sinh học hiện diện trong nấm ăn 4
1.2. Giới thiệu về nấm rơm 6
1.2.1. Đặc điểm hình thái 6
2.4.4. Các phương pháp phân tích 32
2.5. Phương pháp xử lý số liệu 33
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34
3.1. Ảnh hưởng của điều kiện chiết tách đến hoạt tính chống oxy hóa của
dịch chiết nấm rơm 34
3.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch
chiết nấm rơm 34
3.1.2. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của
dịch chiết nấm rơm 35
3.1.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ nấm/nước đến hoạt tính chống oxy hóa của
dịch chiết nấm rơm 37
3.1.4. Đề xuất quy trình chiết nấm thích hợp 39
3.2. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dịch của chiết nấm rơm, khả năng ức
chế enzyme polyphenoloxydase và phân tích hàm lượng ergothioniene có
trong dịch chiết nấm rơm 40
3.2.1. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm 40
3.2.2. Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme PPO của dịch chiết nấm rơm 41
- v -
3.2.3. Phân tích hàm lượng ergothioneine 44
3.3. Ảnh hưởng nồng độ dịch chiết nấm rơm và thời gian xử lý đến sự biến
đen của tôm thẻ chân trắng trong quá trình bảo quản bằng nước đá 45
3.3.1. Ảnh hưởng nồng độ dịch chiết nấm rơm và thời gian xử lý đến sự
biến đen của tôm thẻ chân trắng đánh giá bằng phương pháp đánh giá cảm
quan biến đen 45
3.3.2. Ảnh hưởng nồng độ dịch chiết nấm rơm và thời gian xử lý đến sự
biến đen của tôm thẻ chân trắng đánh giá bằng phương pháp phân tích
hình ảnh 51
3.3.3. Ảnh hưởng nồng độ dịch chiết nấm rơm và thời gian xử lý đến sự
biến đen của tôm thẻ chân trắng đánh giá bằng phương pháp đánh giá cảm
quan chất lượng 59
- vii -
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Các cơ chế sinh hóa học liên quan đến việc hình thành các đốm đen
ở tôm 12
Hình 1.2. Sơ đồ các phản ứng sinh hóa học hình thành đốm đen ở tôm 12
Hình 2.1. Nấm rơm (V. volvacea) 20
Hình 2.2. Tôm thẻ chân trắng (P. vannamei) 21
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát xác định các thông số thích hợp
cho quy trình chiết tách chất chống oxy hóa từ nấm rơm 23
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính chống
oxy hóa của dịch chiết nấm rơm 24
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính chống
oxy hóa của dịch chiết nấm rơm 25
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của tỷ lệ nấm/nước đến hoạt tính
chống oxy hóa của chiết nấm rơm 26
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân tích hàm lượng ESH, hoạt tính ức chế
enzyme PPO và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm 27
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khả năng ngăn chặn biến đen của dịch chiết
nấm rơm trên tôm thẻ chân trắng 31
Hình 3.1. Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết nấm rơm theo nhiệt độ chiết 34
Hình 3.2. Tổng năng lực khử của dịch chiết nấm rơm theo nhiệt độ chiết 35
Hình 3.3. Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết nấm rơm theo thời
gian chiết. 36
Hình 3.4. Tổng năng lực khử của dịch chiết nấm rơm theo thời gian chiết 36
Hình 3.5. Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết nấm rơm theo các tỷ
lệ chiết 37
Hình 3.6. Tổng năng lực khử của dịch chiết nấm rơm theo các tỷ lệ chiết. 38
Hình 3.7. Quy trình chiết nấm thích hợp 39
Hình 3.8. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm; Khả năng khử gốc
- ix -
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ESH : Ergothioniene
PPO : Polyphenoloxydase
DOPA : Dihydroxyphenylalanine
AP-PCR : Arbitrarily-primed polymerase chain reaction
FA : Ferulic Acid
OFA : Oxy hóa Ferulic Acid
SMS : Sodium metabisulphite
DPPH : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
EDTA : Ethylendiamin Tetraacetic Acid - 1 -
LỜI MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết của đề tài
Các mặt hàng tôm chiếm vị trí quan trọng trong cơ cấu các sản phẩm thủy
sản xuất khẩu của Việt Nam. Một trong những dạng hư hỏng thường gặp trong quá
trình bảo quản chế biến tôm đó là sự biến đen. Hiện tượng này thường xảy ra ở tôm
trong quá trình bảo quản sau thu hoạch, đặc biệt là trong điều kiện nhiệt độ bảo
quản dao động và không duy trì tốt dưới 4
O
C. Mặc dù ăn tôm bị biến đen không ảnh
hưởng đến sức khỏe của người tiêu dùng nhưng sự biến đen có ảnh hưởng lớn đến
- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp thêm dẫn liệu khoa học có giá trị tham
khảo cho cán bộ kỹ thuật, các nhà sản xuất kinh doanh và sinh viên ngành Chế biến
thủy sản về hoạt tính chống biến đen ở tôm của chất chiết suất từ nấm rơm; về khả
năng ứng dụng các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên và an toàn thực phẩm để thay
thế các hóa chất độc hại bị ngăn cấm hoặc hạn chế sử dụng trong xử lý và bảo quản tôm.
- Tạo cơ sở khoa học để nghiên cứu sản xuất chất ngăn chặn sự biến đen ở
tôm từ nấm rơm bằng phương pháp sinh học.
Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Thành công của đề tài sẽ mở ra một hướng mới giúp giải quyết vấn đề dư
lượng sulfite và các chất bảo quản khác được sử dụng để ngăn chặn sự biến đen ở
tôm trong các xí nghiệp chế biến thủy sản hiện nay. - 3 -
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ nấm ở trong và ngoài nước
1.1.1. Tình hình sản xuất nấm ngoài nước
Ngành sản xuất nấm ăn đã hình thành và phát triển trên thế giới hàng trăm
năm. Hiện nay người ta đã biết 2000 loài nấm ăn được, trong đó 80 loài nấm ăn
ngon và đang được nghiên cứu trồng nhân tạo (UNESSCO-2004). Việc nghiên cứu
trồng nấm trên thế giới đang ngày càng phát triển mạnh mẽ, đã trở thành một ngành
công nghiệp thực phẩm thực thụ. Theo Tổ chức Nông lương thế giới (FAO), trong
10 năm qua (1997-2007) Sản lượng nấm ăn nuôi trồng tăng từ 2,18 lên đến 3,41
triệu tấn nấm tươi/năm, tỉ lệ gia tăng đạt 56% [30].
Bảng 1.1. Sản lượng nấm ăn trên thế giới (FAO, 2009)
Quốc gia 1997 (tấn) 2007 (tấn)
Trung Quốc 562,194 1,568,523
90% sản lượng nấm rơm.
- Sản lượng nấm Mộc nhĩ đạt 120.000 tấn. Mộc nhĩ được trồng tập trung ở
các tỉnh miền Đông Nam bộ (Đồng Nai, Lâm Đồng, Bình Phước…) chiếm 70% sản
lượng Mộc nhĩ cả nước.
- Nấm sò, nấm hương, nấm mỡ chủ yếu trồng ở các tỉnh miền bắc, sản lượng
mỗi năm đạt khoảng 60.000 tấn.
- Nấm dược liệu: Linh chi, Vân chi, đầu khỉ… mới được nuôi trồng ở một số
tỉnh, thành phố (Hà Nội, Hưng Yên, Vĩnh Phúc, Hồ Chí Minh, Đà Lạt…), sản
lượng mỗi năm đat khoảng 4.000 tấn.
- Một số loại nấm khác như kim châm, trân châu… đang được nghiên cứu và
sản xuất thử nghiệm nên sản lượng không đáng kể.
1.1.3. Các chất có hoạt tính sinh học hiện diện trong nấm ăn
Trong nấm ăn có chứa rất nhiều chất có hoạt tính sinh học quý, đã được biết
đến như:
- Saponin có nhiều trong nấm linh chi (Ganoderma lucidum). Saponin được
biết là chất có khả năng chống oxid hóa, chống lão hóa, nhiều khảo cứu cho thấy vai
trò của các saponin-triterpen và các polyphenol. Trung Quốc đã chứng minh khả
năng khử gốc tự do hydroxyl của G. lucidum và khả năng chống lão hóa tế bào, gần
đây Jing Song Zhang (2002) đã chiết được một chất đặt tên là GLIS từ quả thể Linh
chi làm tăng sinh bạch huyết bào ở lách chuột thí nghiệm và là một nhân tố kích
thích lympho bào B làm tăng khả năng miễn dịch cho người sử dụng [39].
- 5 -
- Ergothioneine có nhiều trong nấm Pleurotus cornucopiae, Pleurotus
eryngii, Flammulina velutipes là chất có khả năng chống oxy hóa mạnh. Bao và
cộng sự (2010) chỉ ra rằng hàm lượng Ergothioneine chiết từ trong môi trường nuôi
trồng nấm F. velutipes cao hơn 1,7 lần so với chiết từ nấm F. velutipes (Bảng
1.2)[14].
Bảng 1.2. Hàm lượng Ergothioneine được chiết từ các loại nấm
(Bao và cộng sự, 2010)
Tên loài nấm Hàm lượng ESH (mg/ml)
năng chống oxy hóa và tính chống oxy hóa được sắp xếp theo thứ tự: Agaricus
bisporus > Hypsizigus marmoreus > Volvariella volvacea > Flammulina velutipes >
Pleurotus eryngii > Pleurotus ostreatus [32].
Từ các nghiên cứu trên cho thấy các hoạt chất chống oxy hóa trong các loại
nấm ăn là rất lớn, đặt biệt là ergothioniene. Chất này có khả năng chống oxy hóa
cao được Bao và cộng sự nghiên cứu nhiều trên nấm kim châm (F. velutipes). Bên
cạnh đó, nấm rơm là loài được trồng khá phổ biến ở nước ta, là một trong những
loài nấm có khả năng chống oxy hóa, tuy nhiên chưa có bài báo nghiên cứu chuyên
sâu về nấm rơm và ứng dụng những chất có trong nấm rơm để chống biến đen trên
tôm thẻ chân trắng. Từ những giả thuyết nêu trên cho thấy việc xác định và ứng
dụng những chất có hoạt tính chống oxy hóa trong nấm rơm là hướng đi có hiệu quả.
1.2. Giới thiệu về nấm rơm
Nấm rơm là nấm ăn được của vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Lần đầu tiên
được trồng ở Trung Quốc vào đầu năm 1822. Khoảng năm 1932-1935, nấm rơm
được đưa vào Việt Nam, Malaysia và các nước Đông Nam châu Á khác. Điều kiện
để nấm rơm phát triển là nhiệt độ tối thiểu 25°C, nhiệt độ tối ưu 37°C, nhiệt độ tối
đa 40°C; pH tối ưu 6,0 và độ ẩm tối ưu 57-60%.
1.2.1. Đặc điểm hình thái
- Nấm rơm gồm có 3 phần:
+ Bao gốc (volva): Dài và cao lúc nhỏ, bao lấy tai nấm. Khi tai nấm trưởng
thành, nó chỉ còn lại phần trùm lấy phần gốc chân cuống nấm, bao nấm là hệ sợi tơ
- 7 -
nấm chứa sắc tố melanin tạo ra màu đen ở bao gốc. Độ đậm nhạt tùy thuộc vào ánh
sáng. Ánh sáng càng nhiều thì bao gốc càng đen.
+ Cuống nấm: Là bó hệ sợi xốp, xếp theo kiểu vòng tròn đồng tâm. Khi còn
non thì mềm và giòn. Nhưng khi già xơ cứng và khó bẻ gãy.
+ Mũ nấm: Hình nón, cũng có melanin, nhưng nhạt dần từ trung tâm ra rìa mép.
- Chu kỳ sống của nấm rơm gồm 6 giai đoạn:
+ Giai đoạn đầu đinh ghim.
+ Giai đoạn hình nút nhỏ.
phần còn lại hầu như không thay đổi ở tất cả các giai đoạn phát triển. Nấm rơm giàu
khoáng chất như natri, kali và phốt pho. Các nguyên tố vi lượng như: Cu, Zn, Fe
không thay đổi ở các giai đoạn phát triển khác nhau [20].
Bảng 1.3: Giá trị dinh dưỡng của nấm rơm (Verma, 2002)
Thành phần (Khối lượng/100g tươi nấm)
Độ ẩm (g) 90,40
Chất béo (g) 0,25
Protein (g) 3,90
Chất xơ (g) 1,87
tro (g) 1,10
Photpho (g) 0,10
Kali (g) 0,32
Sắt (g) 1,70
Canxi (mg) 5,60
Thiamine (mg) 0,14
Riboflavin (mg) 0,61
Niacin (mg) 2,40
Ascorbic acid (mg) 18,00
Hàm lượng của thiamin và riboflavin trong nấm rơm thấp hơn so với nấm
Agaricus bisporus và Lentinula edodes, trong khi hàm lượng niacin là ngang với hai
nấm. Trong các giai đoạn acid amino thiết yếu nhiều nhất là lysine và acid amino
- 9 -
không thiết yếu nhiều nhất là acid glutamic và acid aspartic (Bảng 1.4). Hàm lượng
thấp nhất trong số các acid amino thiết yếu là tryptophan và methionine. Hàm lượng
của phenylalanine tăng gần gấp hai lần ở giai đoạn kéo dài, trong khi lysine giảm
khoảng một nửa ở giai đoạn nút. Trong thực tế, tỷ lệ phần trăm các acid amino thiết
yếu trong nấm rơm cao hơn so với nấm khác và quan trọng nhất là chứa nhiều
lysine [20].
Bảng 1.4: Thành phần acid amino trong nấm rơm
Enzymes Lignocellulolytic từ nấm rơm [21]. Năm 1994, Cai và cộng sự cũng đã sản
xuất thành công cellulases và hemicellulases từ nấm rơm [18]. Ball và Jackson
(1995) đã thu hồi enzyme lignocelluloses từ môi trường sản xuất nấm rơm [15].
- Một số nghiên cứu trong chế biến, bảo quản nấm rơm cho thấy tiềm năng
kinh tế to lớn của nấm rơm.Theo Gow-Chin Yen, 1992, cho rằng nấm rơm khi nấu
thì hàm lượng acid amin ban đầu sẽ bị mất đi khoảng 80%. Trong quá trình bảo
quản ở 4
O
C trong 5 ngày thì hàm lượng acid amin lại tăng lên, nhiều nhất là hàm
lượng của 2-phenylethylamine và tyramine. Tuy nhiên, hàm lượng của tất cả acid
amin tăng rõ rệt hơn khi bảo quản ở nhiệt độ 25
O
C và hàm lượng putrescine và
cadaverine tăng đáng kể so với các acid amin khác khi bảo quản ở nhiệt độ 4
O
C[33].
Năm 1995, Siu Wai Chiu và cộng sự đã thành công trong việc sử dụng AP-PCR
(arbitrarily-primed polymerase chain reaction) để tạo ra các dấu DNA và phân biệt
các loài và giống. Thông qua phương pháp này để xác định tính không đồng nhất
chủng V.volvacea trong thương mại [55]. Theo Jeng-Leun và cộng sự (1997) cho
rằng các hợp chất hương vị của nấm rơm Volvariella volvacea khác nhau ở các giai
đoạn. Các hợp chất hương vị dễ bay hơi tìm thấy trong nấm rơm bao gồm:
limonene, octa-1 ,5-dien-3-ol, 3-octanol, 1-octen-3-ol, 1-octanol, và 2-octen-1-ol,
trong đó các hợp chất chính là 1-octen-3-ol, chiếm 71,6-83,1% tổng số các chất bay
hơi. Nấm rơm trưởng thành có hương thơm nhất. Nấm rơm hàm lượng cao nhất là
trehalose (349,0-457,6 mg/g trọng lượng khô) và thấp nhất là mannitol (0-25,5
- 11 -
mg/g). Trong quá trình phát triển của nấm rơm, hàm lượng acid aspartic và
glutamic, tăng đáng kể, từ 36,11 đến 11,20 mg/g trọng lượng khô ở giai đoạn 1 lên
60,18 và 26,21 mg/g ở giai đoạn 5, trong đó acid glutamic là tăng nhiều nhất, tăng
tôm (Cobb, 1977)
Ban đầu không có sự xuất hiện của enzyme gây sự biến đen. Dưới tác động
của các enzyme thủy phân protein, phân tử tyrosine được phát tán vào các mô. Sau
đó enzyme Polyphenoloxydase được phân tán vào dịch cơ thể (hemolymph) qua các
tuyến nằm dưới vỏ giáp. Dưới tác dụng xúc tác của enzyme Polyphenoloxydase,
tyrosine chuyển thành dihydroxyphenylalanine (DOPA) có màu vàng nhạt. Enzym
Polyphenoloxydase tiếp tục xúc tác chuyển hóa DOPA thành DOPA-quinone có
màu vàng. Các DOPA-quinone này đa tụ lại tạo thành những đốm đen ở tôm.
Hình 1.2. Sơ đồ các phản ứng sinh hóa học hình thành đốm đen ở tôm
Nâu đen
(Melanine)
Tyrosine
(không màu)
DOPA
(vàng nhạt)
Polyphenoloxydase
(dịch cơ thể và các
tuyến dưới vỏ giáp)
N-Acetyldopamime
DOPA quinone
(
màu
vàng)
Diphenoloxydase
(oxy hóa)
N-Acetyldopamime
cách để hạn chế sự biến đen ở tôm là làm lạnh tôm ngay sau khi thu hoạch.
1.3.2. Phương pháp ngăn chặn
Để hạn chế sự biến đen xảy ra ở tôm sau thu hoạch thì quá trình đánh bắt
phải được thực hiện nhẹ nhàng để tránh làm tôm bị tổn thương. Vấn đề chính sau
khi thu hoạch là ngăn chặn sự khơi mào các phản ứng hình thành đốm đen. Để thực
hiện mục đích này, nhiều kỹ thuật có thể được áp dụng trong chế biến như làm lạnh,
đông lạnh, nấu chín, chiếu xạ hoặc sử dụng các chất ức chế.
Khi lựa chọn các biện pháp kỹ thuật để ngăn chặn sự biến đen ở tôm yêu cầu
không được làm ảnh hưởng đến kết cấu, hương vị của tôm và không được gây độc
trực tiếp hay gián tiếp đối với người tiêu dùng. Kỹ thuật thu hoạch tốt kết hợp với
việc duy trì nhiệt độ bảo quản lạnh ổn định là chìa khóa trong việc kiểm soát sự
- 14 -
hình thành đốm đen ở tôm. Nếu tôm bị stress, nhiệt độ bảo quản không ổn định
hoặc không bảo quản ở nhiệt độ thấp, đốm đen có thể xuất hiện ở tôm trong vòng
vài phút sau khi thu hoạch. Điều này rất quan trọng, vì khi đốm đen bắt đầu xuất
hiện thì không thể khử được, các phản ứng biến đen sẽ tiếp tục xảy ra nhanh chóng
và rất khó ngăn chặn.
Một số kỹ thuật chế biến có thể làm chậm hoặc thậm chí ngừng sự hình
thành đốm đen nhưng lại ảnh hưởng đến cấu trúc cơ thịt tôm. Đông lạnh ở -18°C
không phá hủy được các enzyme mà chỉ ngừng hoạt động của chúng. Các enzyme
này sẽ hoạt đông trở lại khi sản phẩm được rã đông. Hoạt động của các vi sinh vật
cũng góp phần xúc tiến cho phản ứng hình thành đốm đen ở tôm, nhiều nghiên cứu
cho thấy sự biến đen xảy ra nhanh hơn ở những mẫu tôm có mật độ vi sinh vật cao.
Trong hầu hết trường hợp, sự biến đen không xảy ra ở tôm đã được nấu ở
95
O
C từ 3 đến 4 phút tùy thuộc vào kích cỡ. Các thí nghiệm đã chỉ ra rằng để ngăn
chặn có hiệu quả sự hình thành đốm đen, tôm phải được nấu ở nhiệt độ cao hơn và
lâu hơn. Tuy nhiên, nếu nấu ở nhiệt độ quá cao trong thời gian dài sẽ làm ảnh
hưởng đến kết cấu, hương vị của tôm và sẽ không được người tiêu dùng chấp nhận.
+ Ưu điểm của sản phẩm 4-hexylresorcinol: tác dụng nhanh, thời gian ngăn
chặn biến đen lâu dài, màu nguyên liệu không bị thay đổi, sử dụng 1 lần trong việc
ngăn chăn biến đen.
+ Nhược điểm của natri metabisulfite: Một số nước chưa chấp nhận sử dụng,
có thể ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng.
1.3.3. Các quy định mang tính pháp lý liên quan đến việc sử dụng chất chống
biến đen
Các chất chống biến đen sử dụng phổ biến được trình bày ở Bảng 1.5
Copyright: Tài liệu đại học ©