1

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM


MÔN: VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM
ĐỀ TÀI:
CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ SỰ
SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN
CỦA VI SINH VẬT
GVHD: TRẦN QUỐC HUY
LỚP: 01DHTP1-Thứ 2-Tiết 3,4
NHÓM THỰC HIỆN: 11
MỤC LỤC
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN
CỦA VI SINH VẬT 3
2.1. Phương pháp xác định số lượng 3
2.1.1. Phương pháp xác định tế bào tổng cộng 3
2.1.1.1. Đếm tế bào trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu 3
2.1.1.2. Đếm trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang 4
2.1.1.3. Đếm bằng máy đếm điện tử 5
2.1.2. Phương pháp xác định tế bào riêng biệt 5
2.1.2.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc 5
2.1.2.2. Phương pháp lọc màng 12
2.2. Phương pháp xác định sinh khối 14

khối vi khuẩn tăng lên, nhưng số tế bào không thay đổi, ngược lại, vào cuối pha logarit kích
thước tế bào giảm đi nhưng số tế bào vẫn còn tăng.
Một vi sinh vật trong điều kiện môi trường thích hợp sẽ không ngừng hấp thụ chất
dinh dưỡng và tiến hành trao đổi chất. Nếu quá trình đồng hóa lớn hơn quá trình dị hóa thì
tổng số nguyên sinh chất (khối lượng, thể tích, kích thước) sẽ không ngừng tăng lên. Đó là
hiện tượng sinh trưởng của cá thể. Nếu là quá trình sinh trưởng cân bằng thì các thành phần
của tế bào cũng tăng lên theo những tỉ lệ thích hợp, khi đạt đến một mức độ nhất định sẽ
hình thành sự sinh sản. Khi đó số lượng cá thể tăng lên. Cá thể ban đầu sẽ phát triển dần lên
thành một quần thể, sự tiếp tục sinh trưởng của cá thể trong quần thể tạo ra sự sinh trưởng
của quần thể. Do đó:
Sinh trưởng cá thể  sinh sản cá thể  sinh trưởng quần thể.
Sinh trưởng quần thể = sinh trưởng cá thể + sinh sản cá thể
Trong vi sinh vật học khi nói đến sinh trưởng là nói đến sự sinh trưởng của cả quần
thể (khác với khi nói tới sinh trưởng ở các sinh vật có kích thước lớn)
Như đã nói ở trên, giữa số lượng tế bào và sinh khối mặc dù có mối liên hệ theo tỉ lệ
thuận y = kx nhưng mối liên hệ này chỉ đúng trong điều kiện thí nghiệm rất hạn chế, không
có ý nghĩa phổ biến. Điều này chính là do kích thước và khối lượng của từng vi khuẩn thay
đổi tùy theo loài và chủng, trong quá trình sinh trưởng thì phụ thuộc vào thời gian (ở các pha
đường cong sinh trưởng), vào tốc độ sinh trưởng, thành phần môi trường cấy và vào điều

2

kiện nuôi cấy. Vì vậy trong việc theo dõi sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn cần phân
biệt các phương pháp xác định số lượng tế bào và sinh khối. Chính vì vậy, qua quá trình tìm
hiểu và chọn lọc, nhóm đã đưa ra một số phương pháp có khả năng áp dụng trong nghiên
cứu và thực tế sản xuất, bao gồm hai nhóm phương pháp chính:
+ Các phương pháp xác định số lượng tế bào : tùy theo mục đích thí nghiệm, ta có thể
xác định số lượng tế bào tổng cộng (cả tế bào sống và chết) hoặc số lượng tế bào sống.
+ Các phương pháp xác định sinh khối tế bào: trong thực tế có thể dùng các phương
pháp trực tiếp (xác định sinh khối khô, xác định hàm lượng Nitơ, xác định hàm lượng


Phương pháp tiến hành
Thêm vài giọt formalin vào trong những lọ chứa mẫu, trộn đều. Pha loãng mẫu cần
đếm sao cho trong mỗi ô nhỏ của buồng đếm có khoảng 5 -10 tế bào vi sinh vật. Để đạt được
độ pha loãng như vậy cần phải ước lượng được số lượng vi sinh vật trong mẫu, đồng thời
phải thử vài lần trong quá trình pha loãng. Mẫu phải được pha loãng bằng dung dịch pha
loãng chứa 0,1% pepton, 0,1% laurylsulphat và 0,01% methyl blue. Tất cả các dung dịch pha
loãng đều phải cần lọc trước khi sử dụng.
Đặt một giọt mẫu được pha loãng vào trong đĩa
đếm trên buồng đếm, đậy bằng kính đậy vật. Tất cả các
buồng đếm và kính đậy vật phải được lau thật sạch.Thể
tích mẫu chứa trong buồng đếm là khoảng không gian
giữa đĩa đếm và kính đậy vật, không để mẫu tràn ra bên
ngoài rãnh của đĩa.
Sau khi đặt mẫu, để yên khoảng 5 phút để ổn
định vị trí của các tế bào trong buồng đếm. Đếm ngẫu
nhiên khoảng 50-100 ô nhỏ. Tính trung bình số lượng Hình 1: Buồng đếm vi sinh vật
vi khuẩn trong tất cả các ô đã đếm. Sau đó nhân với
20000 và với độ pha loãng mẫu trước khi đếm để có được số lượng tế bào trong 1ml.
Lặp lại hai lần hay nhiều hơn để lấy giá trị số đếm trung bình. Đối với các vi sinh vật
tụ thành từng cụm, không thể phân biệt từng tế bào thì mỗi cụm được xem là một vi khuẩn.
Với những kinh nghiệm của mỗi cá nhân về độ pha loãng, thao tác kỹ thuật thành
thạo có thể nhận được các số đếm chính xác. Tuy vậy kết quả có chính xác hay không còn

4

phụ thuộc vào sự sạch sẽ của buồng đếm, kính đậy vật nhằm đảm bảo không có vi khuẩn
khác không phải từ mẫu hiện diện trong buồng đếm và trong kính đậy vật.
có
nồng độ vi khuẩn là 28 X 25 X 50 X 10
3
= 3,5 X 10
7
vi
khuẩn. Nhân với độ pha loãng ban đầu (nếu có) sẽ biết
được nồng độ vi khuẩn trong mẫu kiểm tra. Ưu điểm:
Phương pháp này đơn giản, rẻ tiền và tương đối nhanh chóng. Cung cấp đồng thời
những thông tin về kích thước, số lượng và hình thái vi sinh vật.
Nhược điểm:
Mật độ vi sinh vật cần đạt đủ độ đậm đặc, bởi vì mẫu được lấy ở một thể tích rất nhỏ.
Khó phân biệt tế bào sống và tế bào chết. Dễ nhầm lẫn, độ chính xác không cao, không thích
hợp cho huyền phù vi sinh vật có mật độ thấp.

2.1.1.2. Đếm trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang
Phương pháp

5

Sử dụng dầu nhúng phát quang thấp là một phát minh quan trọng trong việc hạn chế
sự phát huỳnh quang của các màng lọc. Màng carbonate Nuclepore là một màng cellulose
cao cấp dùng trong việc đếm trực tiếp vi khuẩn bởi vì chúng có kích thước lỗ đồng nhất và
bề mặt màng phẳng, chúng có thể giữ lại tất cả các vi sinh vật trên bề mặt của chúng.
Màng Nuclepore có thể nhuộm với thuốc nhuộm Irgalan đen hay các loại thuốc
nhuộm phù hợp khác để tạo nên một nền màu đen tương phản với màu phát quang của vi
sinh vật vì thế việc đếm được thực hiện dễ dàng.

môi trường đã chọn phù hợp với các đối tượng cần xác định. Mổi khuẩn lạc được hình thành
được gán cho một đơn vị hình thành khuẩn lạc (cfu-colony forming units).

Các bước tiến hành
+ Bước 1: Chuẩn bị dịch pha loãng mẫu
Một số dung dịch dùng để pha loãng có thể làm chết tế bào như: nước muối, nước cất.
Các dung dịch pha loãng không được dùng ngay khi lấy ra từ tủ lạnh có thể gây sốc và làm
cho vi sinh vật không thể phát triển được. Dung dịch pepton water là dung địch pha loãng
được sử dụng nhiều nhất và được xem là dung dịch pha loãng cho tất cả các loại mẫu. Nếu
trong mẫu còn có một ít các chất khử trùng thì phải thêm vào dung dịch pha loãng tác nhân
giảm thiểu khả năng khử trùng của chúng, ví dụ: nếu trong mẫu còn dư lượng của các hợp
chất amonium (NH
4
-) thì có thể thêm vào đó Tween 80 hay lecithin. Ngược lại nếu trong
mẫu có chứa các hợp chất chlorin hay iodin thì cần thêm vào đó các muối như sodium
thiosulphate.

+ Bước 2: Chuẩn bị các chuỗi pha loãng mẫu

Hình 3: Chuỗi pha loãng mẫu

Bơm chính xác 9ml dung dịch pha loãng vào trong ống nghiệm có nắp đậy. Nếu sử
dụng các ống nghiệm có nắp không đóng chặt được thì phải khử trùng ống nghiệm, sau đó
bơm dung dịch pha loãng vào, các thao tác này phải được thực hiện một cách vô trùng. Phân
phối dung dịch pha loãng vào các ống sau khi khử trùng còn có ý nghĩa đảm bảo thể tích

7

dung dịch pha loãng không bị mất do quá trình khử trùng. Các thao tác pha loãng tuỳ thuộc
vào từng loại mẫu. Cụ thể như sau:

vào trong các bao dập mẫu hay các máy xay vô trùng, thêm 90ml dung dịch pha loãng và
đồng nhất mẫu, phải đảm bảo sao cho vi khuẩn phân tán đều vào trong dung dịch. Sau khi
mẫu và dung dịch pha loãng được đồng nhất ta được dung dịch pha loãng 1/10. Các độ pha
loãng sau được tiến hành tương tự như phần pha loãng mẫu lỏng. Trong 1ml các dung dịch
pha loãng chứa hàm lượng mẫu như sau:

Ống số
Tỉ lệ pha loãng
Thể tích mẫu ban
đầu (g)
Độ pha loãng
1
1/10
0.1
10-1
2
1/100
0.01
10-2
3
1/1000
0.001
10-3
4
1/10000
0.0001
10-4

tích phù hợp. Được làm mát trong các bể điều nhiệt ở 45
0
C.
Hút 1ml mỗi dung dịch pha loãng cho vào trong đĩa petri vô trùng. Mỗi độ pha loãng
thường được cấy vào hai đĩa petri hay nhiều hơn. Cũng sử dụng các pipette sạch cho mỗi độ
pha loãng. Chỉ chọn cấy vào đĩa petri những độ pha loãng có mật độ vi sinh vật phù hợp,
thường trong khoảng 25-300 tế bào/ml.
Đổ vào mỗi đĩa đã cấy 10-15ml môi trường đã được đun chảy và làm nguội, lắc đĩa
theo chiều và ngược chiều kim đồng hồ khoảng 5-6 lần, đặt đĩa lên mặt phẳng ngang và đợi
cho đến khi môi trường trong đĩa đông đặc. Lật ngược đĩa và ủ trong điều kiện nhiệt độ và
thời gian xác định.

9

Ưu điểm :
Cấy được thể tích mẫu lớn (1ml). Xác định được các vi sinh vật cần dinh dưỡng tiếp
xúc từ nhiều phía. Cho phép đếm được mật độ vi sinh vật cao, khoảng 150-300 khuẩn lạc.
Nhược điểm:
Không định lượng được những vi sinh vật quá nhạy nhiệt. Không xác định được hình
dạng khuẩn lạc nhất định. Khó làm thuần một dòng vi sinh vật.

b. Phương pháp cấy bề mặt
Môi trường phải được chuẩn bị trên đĩa trước 1-2 ngày để khô mặt.

Phương pháp
Đây là phương pháp thay thế cho phương pháp đổ đĩa để phân tích các chỉ tiêu vi sinh
trong thực phẩm, nhất là các chỉ tiêu vi sinh vật nhạy cảm với nhiệt độ như Pseudomonas,
các vi sinh vật này sẽ bị suy yếu khi tiếp xúc với nhiệt độ của môi trường agar ở trạng thái
lỏng. Phương pháp này cũng được dùng để phân tích các chỉ tiêu mà các dòng nhận được
phải cấy chuyền ở các bước tiếp theo.

triển trong môi trường agar hay không. Một số vi sinh vật có thể bị chết khi trãi trên bề mặt
môi trường trong qui trình cấy trải bề mặt. Một số loài vi khuẩn khác không thể sống trong
điều kiện nhiệt độ duy trì trạng thái lỏng của agar trong qui trình đổ đĩa. Bởi vì agar chỉ là
tác nhân làm rắn môi trường nuôi cấy trong qui trình định lượng vi sinh vật vì thế trong một
số trường hợp agar có thể được thay thế bằng các tác nhân làm rắn khác. Trong một số
trường hợp các vi sinh vật có các nhu cầu dinh dưỡng đặc biệt khác, các chất như silicagel
có thể được thay thế để làm rắn môi trường. Nhưng vì chuẩn bị môi trường silicagel khó
khăn hơn chuẩn bị môi trường agar nên chỉ dùng môi trường silicagel khi không thể thay thế
được môi trường agar.
Phương pháp ống cuộn được dùng để định lượng các vi sinh vật kỵ khí bắt buộc. Đây
là một phương pháp cải biên của phương pháp đổ đĩa. Các đĩa hay các ống sau khi cấy vi
khuẩn được ủ trong điều kiện nhiệt độ đặc biệt trong một thời gian nhất định để cho sinh vật
phát triển thành các khuẩn lạc có thể nhìn thấy bằng mắt thường, số lượng khuẩn lạc xuất
hiện trên đĩa sẽ được đếm. Số lượng khuẩn lạc sẽ được gán cho số tế bào đơn lẻ trong mẫu
ban đầu. Để số lượng khuẩn lạc phản ánh được số lượng tế bào vi khuẩn, mẫu phải được
phân tán đều vào trong môi trường hay trên bề mặt môi trường rắn. Những đĩa có quá nhiều

11

khuẩn lạc xuất hiện thì không thể cho số lượng đếm chính xác bởi vì chúng có thể chồng lấp
lên nhau. Những đĩa có quá ít khuẩn lạc cũng phải bỏ đi vì theo nguyên tắc của xác suất.
Những vấn đề chính yếu cần xem xét trong qui trình đếm khuẩn lạc là thành phần môi
trường, điều kiện và thời gian nuôi ủ. Môi trường để định lượng các vi sinh vật dị dưỡng
không thể cố định nitơ phải chứa các nguồn nitơ, carbon, phosphate dễ sử dụng và các
cation, anion cần thiết như sắt, mangie, calci, natri, clo và sulphate. Thành phần của các hàm
lượng không nhất định, chúng đặc thù cho từng loại môi trường và từng loại mẫu nhất định
để có thể nhận được số lượng vi sinh vật mục tiêu cao nhất. Như vậy môi trường nuôi cấy
phải có các thành phần dinh dưỡng phù hợp với từng yêu cầu của loài vi sinh vật, bao gồm
cả các nhân tố cần thiết khác cho sự phát triển của một hệ vi sinh vật nhất định. Mục đích
chung của môi trường là hàm lượng dinh dưỡng phải cao hơn các thành phần có trong các

bule là những tác nhân ức chế vi khuẩn Gram âm. Các vi sinh vật kháng kháng sinh cũng có
thể được định lượng trên môi trường bằng cách thêm vào đó một liều lượng kháng sinh. Môi
trường phân biệt được thiết lập dựa trên nhiều cách. Các thuốc thử được thêm vào trong môi
trường để cho phép nhận ra các sự khác biệt của những vi sinh vật mong muốn. Có thể thêm
thuốc thử vào môi trường sau khi nuôi cấy để nhận ra các loài vi sinh vật đặc trưng cần tìm.
Chìa khoá nâng cao khả năng phân biệt của môi trường là qui trình nuôi cấy để cho phép
môi trường phân biệt một cách tốt nhất với vi sinh vật cần định lượng và các vi sinh vật khác
có trong mẫu.
Môi trường Eosin methyl blue (EMB) và MacConkey agar là những môi trường được
sử dụng rộng rãi trong việc phân tích vi sinh vật trong nước. Những môi trường này bao gồm
tính chọn lọc và tính phân biệt. Chúng chọn lọc cho sự phát triển của các vi khuẩn Gram âm
bởi trong đó có thêm vào các tác nhân ức chế các vi khuẩn Gram dương. Môi trường này có
thể phân biệt các vi khuẩn có thể sử dụng lactose bởi sự hình thành các khuẩn lạc có thể
phân biệt bằng màu sắc. Trên môi trường EMB, vi khuẩn thuộc nhóm coliforms là nhóm
Gram âm tạo nên những khuẩn lạc có màu tím ánh kim. Định lượng số lượng coliform bằng
cách đếm số lượng khuẩn lạc có các đặc điểm này. Cách này thường xuyên được sử dụng
trong việc phân biệt các vi sinh vật chỉ thị trong nước và trong thực phẩm.

 Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp đếm khuẩn lạc
Ưu điểm:
Cho phép xác định số tế bào sống. Định lượng chọn lọc vi sinh vật
Nhược điểm:
Không chính xác trong trường hợp tế bào vi sinh vật kết thành đám, không phân tán
đều trong quá trình trải.

2.1.2.2. Phương pháp lọc màng
Phương pháp này thường được áp dụng cho các mẫu lỏng như nước, sữa
Các mẫu chất lỏng được lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc nhỏ hơn kích thước
của vi sinh vật. Vi sinh vật được giữ lại trên màng lọc. Màng được đặt trên môi trường agar


(c)- Dùng môi trường thạch m-Endo để xác định vi khuẩn E.coli và các Coliform
khác- khuẩn lạc có màu lục;
(d)- Nắm sợi và nấm men mọc trên môi trường Thạch - Mạch nha.

Ưu điểm: Xác định được mật độ vi sinh vật cụ thể trong một thể tích mẫu lớn: 10ml,
100ml …
Nhược điểm: Không thích hợp cho việc phân tích các mẫu thực phẩm rắn.

2.2. Phương pháp xác định sinh khối
2.2.1. Phương pháp trực tiếp
Nếu hàm lượng một số vật chất trong mỗi tế bào là giống nhau thì tổng lượng chất đó
trong tế bào có tương quan trực tiếp với tổng sinh khối vi sinh vật. Chẳng hạn, thu tế bào
trong một thể tích nhất định của dịch nuôi cấy, rửa sạch đi rồi đo tổng lượng protein hay
tổng lượng Nitơ, có thể thấy sự tăng quần thể vi sinh vật là phù hợp với sự tăng tổng lượng
protein hay Nitơ.

2.2.1.1. Phương pháp xác định sinh khối khô
Sự sinh trưởng của vi sinh vật không chỉ biểu hiện ở số lượng tế bào mà còn ở cả sự
tăng trưởng của tổng khối lượng tế bào. Phương pháp trực tiếp nhất là xác định trọng lượng
khô của tế bào.
Để xác định sinh khối khô của tế bào người ta sẽ tiến hành các bước sau:

15

+ Bước 1: Ly tâm để thu nhận sinh khối tế bào.
+ Bước 2: Rửa tế bào rồi làm khô trong lò sấy.
+ Bước 3: Cân trọng lượng khô thu được.

Ưu điểm: Phương pháp này thích hợp để xác định sự sinh trưởng của nấm.
Nhược điểm: Tốn thời gian tiến hành và không thật nhạy cảm. Không dùng được với


 Nguyên lý
Dưới tác dụng của H
2
SO
4
đậm đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác , các hợp chất
hữu cơ có chứa Nitơ bị phân hủy và bị oxi hóa đến CO
2
và H
2
O, Nitơ chuyển thành
Amoniac (NH
3
) và tiếp tục kết hợp với H
2
SO
4
tạo thành muối Amoni sunfua (NH
4
)
2
SO
4
tan
trong dung dịch.
Đuổi NH
3
ra khỏi dung dịch bằng NaOH đồng thời cất và thu NH
3

Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác. Các phân tử

chứa Nitơ
dưới tác dụng của H
2
SO
4
tạo thành NH
3
. Ví dụ các protein bị thủy phân

thành acid amine;
carbon và hidro của acid amine tạo thành CO
2
và H
2
O; còn Nitơ

được giải phóng dưới dạng
NH
3
kết hợp với H
2
SO
4
dư tạo thành (NH
4
)
2
SO

ra khỏi dung dịch bằng NaOH
(NH
4
)
2
SO
4
+ 2 NaOH → Na
2
SO
4
+ 2H
2
O + 2 NH
3
↑
NH
3
bay ra được làm lạnh biến đổi thành NH
4
OH rơi vào bình hứng, bình hứng chứa
H
2
SO
4
0.1N
2NH
4
OH + H
2

dư + 2NaOH → Na
2
SO
4
+ 2H
2
O
Chuẩn độ H
2
SO
4
dư trong bình hứng bằng NaOH 0.1N cho đến khi mất màu tím hồng
và chuyển sang màu xanh lá mạ. Ghi nhận thể tích NaOH 0.1 N sử dụng.

17

+ Bước 4: Tính kết quả
Hàm lượng % nitơ tổng số được tính theo công thức
N (%) =










Trong đó:

Phương pháp định lượng protein là phương pháp dùng để xác định hàm lượng protein
trong sinh khối của vi sinh vật . Vì hầu hết trong cơ thể của vi sinh vật là protein do một mặt
protein là thành phần của mọi chất khô, mặt khác đó là những thành phần hoạt động trong
sinh khối (hầu hết protein của tế bào là ezyme), do đó có thể dựa vào hàm lượng protein để
đánh giá sự sinh trưởng của vi sinh vật
Phân loại : có 2 loại phản ứng vì acide amin của protein có 2 dạng là mạch thẳng và
mạch vòng, nên khi protein có chứa các acide amin dạng mạch thẳng thì ta sử dụng phương
pháp Biure còn các protein có chứa mạch vòng (triozin,tryptophan,…) thì ta sử dụng phương
pháp Lowry

 Phương pháp Biure
Bản chất của phản ứng : xảy ra khi từ 2 liên kết peptide trở lên mới có phản ứng
này.Tạo phức tím hồng với CuSO
4
trong môi trường kiềm. Cực đại hấp thụ tại 540 nm.

18
CuSO
4
+ 2NaOH
Cu(OH)
2
+ Na
2
SO
4


+NaOH

C
OH
N
CH
R
1
C
OH
N
CH
R
2
C
OH
N
CH
R
3
C
OH
N
CH
R
4
Cu(OH)
2
C
N


Hình 9: Đồ thị protein chuẩn

Phức màu xanh tím
Nồng Độ
OD
0

19

Dựa trên phản ứng màu Biure tạo màu thì người ta sẽ sử dụng phản ứng màu Biuret
để định lượng protein bằng cách đo mật độ quang của dung dịch phức tạo thành ở bước sóng
540nm.
Từ đồ thị protein chuẩn mà ta đã có, ta sẽ thực hiện phản ứng màu Biure rồi lợi dụng
tính chất hấp thụ bước sóng của nó đem đo OD . Sau đó dựa trên đồ thị của protein chuẩn để
xác định các nồng độ của protein cần xác định, từ đó có thể đánh giá được sự sinh trưởng
của vi sinh vật thông qua định lượng protein.

 Phương pháp Lowry
Thuốc thử Lowry có chứa LiSO
4
và molipdat Na.Tác dụng với các axit amin có vòng
thơm, hấp thụ cực đại ở 750 nm. Độ nhạy cao, tạo phức màu xanh tím.
Phương pháp này dựa trên cơ sở dùng máy đo màu để xác định sản phẩm khử

Nếu protein ta nghiên cứu là hormone hoặc các độc tố thì chúng được xác định qua
hiệu ứng sinh học mà chúng gây ra. Ví dụ như hormone sinh trưởng sẽ kích thích sự sinh
trưởng của các tế bào đích nuôi cấy.
Nếu là protein vận chuyển thì có thể xác định chúng thông qua nồng độ chất mà
chúng vận chuyển.
Phương pháp đơn giản nhất để đo nồng độ protein trong dung dịch là độ hấp thụ tia
cực tím của nó .
+ Nếu protein tinh sạch thì nồng độ tuyệt đối của nó được tính theo giá trị đo được.
+ Nếu protein không tinh sạch ( dịch chiết từ một sắc ký,… ) thì nồng độ của protein
tổng được tính tương đối từ độ hấp thụ.
+ Nguyên tắc của phương pháp này là các protein hấp thụ tia cực tím cực đại ở bước
sóng 280 nm do các acid amin thơm như : tryptophan ,tyrosine và phenylalanine . Độ hấp
thụ ở 280 nm thay đổi tùy loại protein nhưng hệ số tắt đo được ( nghĩa là độ hấp thụ của
dung dịch protein 1% với đường sóng truyền qua 1cm ) cho mỗi protein cho phép tính nồng
độ của protein tinh sạch.
+ Với một hỗn hợp các protein hoặc với bất cứ một loại protein nào mà không biết hệ
số tắt thì nồng độ protein được tính như sau :
Nồng độ protein (mg/ml)=1,55. A280 – 0,77 . A260
Trong đó:
A280 : độ hấp thụ ở bước sóng 280nm
A260 : độ hấp thụ ở bước sóng 260nm
Phương pháp này không dùng được cho các dung dịch có nồng độ protein thấp hơn
0,1mg/ml hoặc khi có mặt nhiều chất khác mà hấp thụ cùng một vùng cực tím (ví dụ: đệm ,
acid nucleic và một số chất béo), hoặc khi protein ở trong dịch huyền phù chứ không phải
trong dung dịch (ví dụ: trong màng hoặc các phức hợp có trọng lượng phân tử lớn). Cũng
cần chú ý là nếu tỷ lệ A280/A260 thấp hơn 0,6 nghĩa là dung dịch protein chưa sạch, bị lẫn
các chất khác, đặc biệt với acid nucleic thì nên sử dụng phương pháp Lowry để do nồng độ
protein.

21

thể dùng phương pháp đo độ đục trên quang phổ kế để xác định sự sinh trưởng của vi sinh
vật.
Lưu ý: Chỉ tiến hành đo độ đục các mẫu mà ở đó vi sinh vật sinh trưởng làm đục
đồng đều môi trường nuôi cấy, không tạo thành váng, khối.
Thông thường, để xác định nồng độ tế bào, ta cần phải xác định mật độ quang (OD).
Mật độ quang được xác định dựa vào tỷ số giữa cường độ ánh sáng trước khi qua mẫu và sau
khi qua mẫu:

Trong đó:
A
λ
là mật độ quang tại bước sóng λ.
I
0
là cường độ sáng trước khi qua mẫu.
I là cường độ sáng sau khi qua mẫu.

Người ta sử dụng bước sóng λ = 600 nm để xác định nồng độ tế bào theo công thức
sau:
[Số tế bào/ml] = A
600
.k .f
Trong đó:
k = 5x10
8
là hệ số chuyển đổi.
f là hệ số pha loãng.

Thông qua việc đo độ hấp thụ ánh sáng có thể xác định được sinh khối vi sinh vật.
Khi số lượng tế bào tăng lên sẽ dẫn đến việc tăng độ đục, mức độ tán xạ ánh sáng nhiều hơn