31
3.4.2.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào [9, 40]
 Hình thái khuẩn lạc

Sơ đồ 3.3: Quy trình phân lập và quan sát hình thái khuẩn lạc trên đĩa [9, 40]
Hình dáng khuẩn lạc: lồi, trơn, màu vàng trùng với màu môi trƣờng xung quanh.
Đƣờng kính khuẩn lạc: 2,5 mm.
 Hình thái tế bào
Tế bào đƣợc quan sát ở vật kính 100X sau khi đã tiến hành nhuộm Gram (xem phụ
lục 5.1). Vi khuẩn L. sporogenes có hình que, bắt màu Gram (+), không tạo chuỗi. Bào tử
nằm ở một đầu tế bào. Kích thƣớc tế bào: 0,4 – 0,8 µm  2,5 – 4,5 µm.
 Hình thái bào tử
Bào tử đƣợc quan sát ở vật kính 100X sau khi đã tiến hành nhuộm Gram (xem phụ
lục 5.2). Bào tử L. sporogenes có hình bầu dục, bắt màu hồng, nằm ở một đầu tế bào.
Kích thƣớc bào tử: 0,9 – 1,2 µm  1 – 1,7 µm. Mẫu chế phẩm
Pha loãng trong 9 ml NaCl 9%
0
đến nồng độ 10
-8

Giữ 3 ống nồng độ pha loãng 10
-6
,
10
-7
, 10
-8

10%, 25 ml diethyl ether và lắc đều. Thu lấy tầng ether và cho bốc hơi thật kỹ
trong bồn nƣớc nóng (trong khoảng 60 - 100
0
C)cho đến khi còn lại một thể tích dung dịch
ổn định. Hòa tan phần còn lại này trong 2,5 ml nƣớc cất. Thêm vào 2,5 ml thuốc thử
Uffelman màu tím xanh. Đọc kết quả.
Kết quả
Phản ứng (-): dung dịch không chuyển thành màu vàng
Phản ứng (+): dung dịch chuyển thành màu vàng
Giống
Cấy tăng sinh trong GYE lỏng
Ủ 37
0
C/24 giờ
Cấy sang các môi trƣờng thử
sinh hóa
Lên men đƣờng

Di động

Catalase 33 3.4.3.2. Định lƣợng
 Nguyên tắc
L. sporogenes lên men đƣờng tạo ra acid nên có cũng có khả năng làm đông vón sữa.
Dựa vào đặc điểm này, chúng tôi xác định và đánh giá lƣợng acid lactic (chiếm hơn 85%

Sữa đặc có đƣờng
Pha loãng bằng nƣớc
cất với tỉ lệ 1:10
Chiết 40 ml vào bình
tam giác
Ủ 37
0
C/24 giờ
Hút 10 ml dịch lên men +
90 ml nƣớc cất + 2-3 giọt
phenolphtalein
Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N
cho đến khi dịch lên men
chuyển sang màu hồng nhạt
bền trong 5 phút
Ghi nhận V
NaOH
0,1N

Tính giá trị độ chua
(T) theo công thức

35

3.4.4 Khảo sát khả năng hình thành bào tử
 Nguyên tắc
Sự hình thành và hồi sinh của bào tử L .sporogenes chịu ảnh hƣởng lớn bởi những điều
kiện môi trƣờng. Thí nghiệm sau đây đƣợc thực hiện nhằm khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ và
môi trƣờng nuôi cấy lên khả năng tạo bào tử. Đối tƣợng đƣợc lựa chọn để thực hiện thí nghiệm
là 3 trong số các chủng giữ giống.

Nghiệm thức 4
2
Nghiệm thức 5
Nghiệm thức 6
Nghiệm thức 7
Nghiệm thức 8
3
Nghiệm thức 9
Nghiệm thức 10
Nghiệm thức 11
Nghiệm thức 12

Chú ý: mỗi thí nghiệm lập lại 3 lần
A = 0,009.n.100/V = 0,009.T
A: khối lƣợng acid lactic (g)
n : V
NaOH
0,1N chuẩn độ (ml)
0,009 : hệ số chuyển 1 ml NaOH 0,1N
sang số gam acid lactic
V : thể tích dịch sữa lên men chƣa lên
men (ml)
C/2 giờ
Ủ 37
0
C/2 ngày,
tiếp tục ủ ở
50
0
C/2 giờ và
70
0
C/2 giờ
Thu sinh khối
(a)
Thu sinh khối
(a)
Thu sinh khối
(a)

Kiểm tra số
lƣợng bào tử
trong sinh
khối
(b)
So sánh số lƣợng bào tử và đánh
giá khả năng hình thành bào tử
trong mỗi thí nghiệm bố trí
Kiểm tra số
lƣợng bào tử
trong sinh
khối

0
. Chuyển 4 ml dịch sinh khối vào ống nghiệm.
o Phƣơng pháp kiểm tra số lƣợng bào tử trong sinh khối [9,40]
 Nguyên tắc
Số lƣợng bào tử L. sporogenes trong sinh khối chỉ có thể đếm đƣợc sau khi đã
pha loãng nhiều lần và cấy trang trên đĩa. Ngoài ra, để đánh giá chính xác số lƣợng
bào tử trƣớc khi cấy trang, chúng tôi gia nhiệt những ống pha loãng ở nhiệt độ và
thời gian thích hợp để tiêu diệt toàn bộ tế bào sinh dƣỡng. Những bào tử còn sống
sau quá trình gia nhiệt sẽ hồi sinh trở lại khi cấy trang. Vì vậy, số khuẩn lạc đặc
trƣng thu nhận đƣợc cũng tƣơng ứng với số bào tử trong dịch pha loãng.
 Tiến hành
Từ sinh khối thu đƣợc, hút 1ml và đồng nhất trong 9 ml NaCl 9%
0
để có nồng
độ pha loãng 10
-1
. Hút tiếp 1 ml và đồng nhất trong 9 ml NaCl 9%
0
để có nồng độ
pha loãng 10
-2
. Tiếp tục nhƣ thế cho đến nồng độ pha loãng 10
-9
. Giữ 3 ống 10
-7

,10
-8
, 10
-9

V
1
h
1
x
N
X

X: số lƣợng khuẩn lạc trong 1 g mẫu hay 1 ml
dịch mẫu
N: tổng số khuẩn lạc trong các đĩa cùng nồng
độ pha loãng
x: số đĩa cùng nồng độ pha loãng
h: nồng độ pha loãng (10
-7
, 10
-8
, 10
-9
)
V: thể tích dịch mẫu cấy trên 1 đĩa (ml)
3
XXX
Y
321

Y: số khuẩn lạc trung bình ở các nồng độ pha

100%
20
100%
Vì 100% khuẩn lạc nghi ngờ đƣợc chọn đều có hình thái vi thể và đặc điểm sinh hóa
phù hợp với L. sporogenes nên chúng tôi kết luận trong chế phẩm của Thorne Research
(USA) chỉ thuần một loại vi khuẩn L. sporogenes.
4.4.2. Đặc điểm hình thái của L. sporogenes
4.4.2.1. Quan sát khuẩn lạc
Vi khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng GYE ở 37
0
C/48 giờ. Chúng tôi quan sát
đƣợc hình dạng khuẩn lạc nhƣ sau: tròn, lồi, đều, màu vàng, bề mặt mịn; đƣờng kính
khuẩn lạc trung bình 2 – 3 mm; vùng môi trƣờng xung quanh khuẩn lạc chuyển từ màu
tím sang màu vàng.

4.4.2.2. Quan sát hình thái tế bào

Hình 4.1: Khuẩn lạc vi khuẩn L. sporogenes trên môi trƣờng GYE

40
Chúng tôi tiến hành nhuộm Gram khuẩn lạc điển hình phân lập đƣợc trên môi
trƣờng thạch GYE sau 48 giờ ủ ở 37
0
C. Vi khuẩn đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi ở độ
phóng đại 1000 lần (100X). Hình thái của tế bào vi khuẩn đƣợc chúng tôi ghi nhận nhƣ
sau: hình que, bắt màu Gram (+), 2 đầu hơi tròn, không tạo chuỗi; kích thƣớc tế bào 0,4 –
0,8 µm  2,1 – 4,5 µm; bào tử nằm về một đầu tế bào (xem Hình 4.2).

4.4.2.3. Quan sát hình thái bào tử
Chúng tôi tiến hành nhuộm bào tử từ mẫu khuẩn lạc điển hình trên môi trƣờng GYE