1

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ MÔI TRƯỜNG NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ
Theo Nghị định thư Khoa học - Công nghệ với Liên bang Nga
(2010 - 2012)
BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NHIỆM VỤ
NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP CHẾ TẠO MỘT SỐ VẬT LIỆU XENLULO
CỐ ĐỊNH ENZYM PHÂN HỦY PROTEIN
SỬ DỤNG ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG
Thỏa thuận với Viện Nghiên cứu Vật liệu dệt, Viện Hàn lâm Kỹ thuật Nga được
ký ngày 29 tháng 5 năm 2009.
Cấp ký kết thoả thuận:
- Về phía đối tác Nga: do Viện trưởng, Viện Nghiên cứu Vật liệu dệt, Viện Hàn
lâm Kỹ thuật Nga, GS. TSKH. V. N. Filatov ký.
- Về phía Việt Nam: do Viện trưởng, Viện Công nghệ môi trường, Viện Khoa
học và Công nghệ Việt nam, PGS. TS. Nguyễn Hoài Châu ký.
3

DANH SÁCH CÁC CÁN BỘ THAM GIA NHIỆM VỤ
STT

Họ và tên Đơn vị Nội dung công việc
1 TS. Huỳnh Thị Hà
Viện Công
nghệ môi
trường, Viện
KH&CN VN
Chủ trì Nhiệm vụ, phụ trách
mảng nghiên cứu phương pháp
chế tạo một số vật liệu xenlulo
cố định enzym phân hủy
protein.
2 PGS. TSKH. Ngô Quốc Bưu
3 PGS. TS. Nguyễn Hoài Châu
4 CN. Đào Trọng Hiền
5 KS. Nguyễn Thúy Phượng
6 KS. Lê Anh Bằng
7 KS. Hoàng Thị Mai
8 TS. Phạm Thị Bích Hợp

kiện cho các cán bộ VN tiếp
xúc với các cơ quan và các nhà
khoa học Nga, cung cấp
enzym, hướng dẫn phương
pháp nghiên cứu tính chất và
đánh giá chất lượng sản phẩm,
giảng bài và tham dự hội thảo
tại VN.
16 TSKH. Medusheva E. O.

4

MỤC LỤC
Thông tin chung về Nhiệm vụ: 2
DANH SÁCH CÁC CÁN BỘ THAM GIA NHIỆM VỤ 3
MỤC LỤC 4
СÁС TỪ VIẾT TẮT 7
DANH MỤC BẢNG 8
DANH MỤC HÌNH 11
ĐẶT VẤN ĐỀ 15
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI
NƯỚC 17
1.1. Một số tính chất cơ bản của vật liệu xenlulo và enzym sử dụng trong y học 17
1.2. Vật liệu phủ vết thương trên cơ sở xenlulo cố định enzym 18
1.3. Viện NCVLD Moskva đi đầu trong nghiên cứu chế tạo vật liệu phủ vết thương
hiệu quả cao 23
1.4. Một số tính chất đặc thù của vật liệu phủ vết thương cố định enzym 25
1.5. Đặc tính công nghệ của vật liệu phủ vết thương trên cơ sở xenlulo biến tính do
Viện NCVLD Moskva đề xuất 26
1.6. Tình hình nghiên cứu trong nước 31


2.2.11. Nghiên cứu ảnh hưởng của tia bức xạ gama lên hoạt tính phân hủy
protein của tổ hợp enzym HP phụ thuộc vào thời gian bảo quản 52
2.2.12. Nghiên cứu liều độc tính cấp của dung dịch enzym HP 52
2.2.13. Nghiên cứu tác dụng điều trị vết thương của băng gạc chứa enzym HP và
chitosan Multiferm trên động vật thí nghiệm 53
2.2.14. Nghiên cứu tách chiết tổ hợp enzym phân giải protein từ gan tụy một số
loài cua biển Việt Nam 55
2.2.14.1. Lựa chọn vật liệu và phương pháp sàng lọc 57
2.2.14.2. Phương pháp tách chiết enzym từ nội tạng cua ghẹ 58
2.2.14.3. Nghiên cứu tinh chế enzym HP từ nội tạng cua ghẹ 60
2.2.14.4. Xác định hoạt tính protease của tổ hợp enzym hepatopancreas 60
2.2.14.5. Xác định định lượng nồng độ protein 62
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 64
3.1. Lựa chọn các vật liệu vải sợi xenlulo phù hợp cho việc chế tạo băng gạc điều trị
vết thương hiệu quả cao 64
3.2. Nghiên cứu biến tính xenlulo bằng periodat natri 67
3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ HIO
4
đến mức độ oxy hóa xenlulo 67
3.2.2. Ảnh hưởng của modul bể đến mức độ oxy hóa xenlulo 68
3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian lên mức độ oxy hóa xenlulo 69
3.3. Nghiên cứu đánh giá một số tính chất của đialđehyt xenlulo 70
3.3.1. Khảo sát hình thái học các mẫu DAC trên kính hiển vi điện tử truyền qua70
3.3.2. Khảo sát phổ FTIR của các mẫu DAC có mức độ oxy hóa khác nhau 72
3.3.3. Kết quả đánh giá mức độ đồng đều về phân bố của các nhóm đialđehyt trên
vải xenlulo biến tính 75
3.4. Nghiên cứu cố định enzym HP lên DAC 78
3.4.1. Nghiên cứu cấy chitosan lên DAC 78
3.4.2. Ảnh hưởng của mức độ oxy hóa xenlulo đến hoạt tính enzym HP 84

Nam 120
3.11.1. Khảo sát ảnh hưởng của dung dịch đệm đến hoạt tính của proteaza 121
3.11.2. Tách phân đoạn enzym bằng cồn theo các tỷ lệ thể tích khác nhau 121
3.11.3. Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm đến khả năng làm sạch proteaza 122
3.11.4. Tách phân đoạn tổ hợp enzym proteaza sử dụng màng siêu lọc 122
3.11.5. Tách chiết tổ hợp enzym proteaza từ gan tụy cua biển dùng (NH
4
)
2
SO
4
123
3.11.6. Xác định hoạt tính enzym proteaza và hàm lượng protein 124
3.12. Nghiên cứu tinh chế tổ hợp enzym phân hủy protein tách chiết từ cua ghẹ Việt
Nam 124
3.12.1 Nghiên cứu tinh chế tổ hợp enzym phân hủy protein………………… 124
3.12.2 Xác định hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch. . . . . . . . . . . . . . . . . 130
3.12.3 So sánh thành phần enzyme chiết tách từ cua ghẹ Việt Nam với chế phẩm
enzyme công nghiệp của Nga…………………………………………… … 133
KẾT LUẬN 136
KIẾN NGHỊ 137
TÀI LIỆU THAM KHẢO 138
PHỤ LỤC 142
7

СÁС TỪ VIẾT TẮT

ADCTA – 2-amino-4,6-dichlor-2-triazin
APS – amonium persunfat
APTES - 3-aminopropyl triethoxysilan

TEM – hiển vi điện tử truyền qua
TLPT – trọng lượng phân tử trung bình
TRIS base – 2-amino-2-hydroxymethyl-propan-1,3-diol
TES – dung dịch đệm: Tris-EDTA- trong dung dịch CaCl
2
TTC – 2,3,5-triphenyltetrazol clorua
VNCVLD – Viện Nghiên cứu Vật liệu dệt

8

DANH MỤC BẢNG

STT

Số bảng

Tên bảng Trang

1 1.1
Động học phân hủy thủy phân của vật liệu mang cố định
enzym trong dung dịch đệm phosphat so với vật liệu mang
chưa cố định enzym
26
2 1.2
Hiệu quả điều trị vết thương của băng DAC được cố định
enzym tripsin và băng DAC được cố định tổ hợp enzym
hepatopancreat so sánh với băng không chứa enzym
29
3 2.1
Một số đỉnh hấp thụ đặc trưng trên phổ FTIR của các mẫu

xenlulo
69
11 3.6
Ảnh hưởng của nồng độ axit periodic và chỉ số modul bể
oxy hóa lên mức độ oxy hóa xenlulo trong cùng thời gian
phản ứng
70
12 3.7
Tỷ số cường độ của các cặp đỉnh hấp thụ (ĐHT) đialđehyt
xenlulo phụ thuộc vào mức độ oxy hóa xenlulo, xác định
trên phổ FTIR
73
13 3.8
Tỷ số cường độ của các cặp đỉnh hấp thụ (ĐHT) trên các
phân đoạn của sợi đialđehyt xenlulo
76
14 3.9 Các mức oxy hóa DAC được sử dụng trong nghiên cứu 78
15 3.10
Kết quả phân tích hoạt tính enzym phụ thuộc vào mức độ
78
9

oxy hóa DAC
16 3.11
Kết quả phân tích hoạt tính enzym phụ thuộc vào trọng
lượng phân tử chitosan (Mẫu không rửa enzym –đợt 1)
79
17 3.12
Kết quả phân tích hoạt tính enzym phụ thuộc vào trọng
lượng phân tử chitosan (Mẫu rửa enzym –đợt 1)

25 3.20
Hoạt tính còn lại của tổ hợp enzym HP của Mẫu Nga sau
khi ngâm trong dung dịch đệm với thời gian khác nhau
90
26 3.21
Quá trình phân hủy thủy phân của enzym HP cố định trên
vải DAC (3,12%) phụ thuộc vào thời gian thủy phân
93
27 3.22
Hoạt độ enzym trên mẫu băng DAC-Chit-EnzHP
(“Multiferm”)
96
28 3.23
Kết quả phân tích nhiệt vi sai của một số mẫu DAC được
cấy chitosan rồi sau đó cố định enzym hepatopancrease
100
29 3.24
Hoạt độ enzym của băng Multifern Việt Nam và
Multiferm Nga đo sau khi được chế tạo
101
30 3.25
Hoạt độ enzym của băng Multifern Việt Nam và
Multiferm Nga, đo ngay sau khi được chiếu xạ gama
101
31 3.26
Hoạt độ enzym của băng Multifern Việt Nam và
Multiferm Nga, đo sau khi chiếu xạ gama một tháng
102
32 3.27
Hoạt độ enzym của băng Multifern Việt Nam và

2
) nhóm 4
114
44 3.37 Biến đổi mô học ở nhóm 1 117
45 3.38a Diễn biến mô học của nhóm 2 và 3 theo thời gian 118
46 3.38b
Diễn biến mô học theo thời gian hai vùng trên tiêu bản
sinh thiết
119
47 3.39 Ảnh hưởng của dung dịch đệm đến hoạt tính của enzym 121
48 3.40
Tách phân đoạn enzym bằng cồn theo các tỷ lệ thể tích
khác nhau
121
49 3.41
Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm đến khả năng tinh sạch
proteaza
122
50 3.42
Kết quả đo hoạt tính của dịch chiết tách theo các phân
đoạn (NH
4
)
2
SO
4

123
51 3.43
Xác định hàm lượng protein trong các phân đoạn

Tương tác giữa enzym trypsin với cơ chất protein phosphoryl
hóa dưới tác dụng của graphen oxit được chức năng hóa bằng
polyethylen glycol có nhóm amin ở cuối.
23
2 1.2 Nguyên lý cố định enzym trên vật liệu xenlulo 24
3 1.3 Sơ đồ cố định enzym trên sợi xenlulo 27
4 2.1
Thiết bị xác định độ mao dẫn của vật liệu xenlulo theo chuẩn
GOST 10681-75
34
5 2.2 Thiết bị xác định độ cứng uốn PT-2 theo tiêu chuẩn 36
6 2.3
Quá trình hình thành các gốc alđehyt trên sợi xenlulo bằng
phản ứng oxy hóa periodat
38
7 2.4 Phổ FTIR của một mẫu DAC có mức độ oxy hóa 17% 40
8 2.5
Cơ chế hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm amin đầu
cuối của phân tử enzym và gốc cacbonyl của đơn nguyên
DAC
42
9 2.6
Đường chuẩn tyrosin dùng để xác định hoạt tính PGP của
enzym
45
10 2.7
Động học quá trình phân hủy thủy phân của vật liệu xenlulo
cố định enzym trong dung dịch đệm phosphat pH = 6,0
47
11 Ghẹ xanh (Portunus Pelaicus) 57

74
27 3.15
Phổ FT-IR của các mẫu vải DAC có mức độ oxy hóa khác
nhau
74
28 3.16
Biến thiên của các cặp tỷ số CĐHT theo chiều dài của sợi
đialđehyt xenlulo
77
29 3.17
So sánh hoạt tính PGP của các mẫu có mức oxy hóa khác
nhau với hai lần làm mẫu chitosan
79
30 3.18
So sánh hoạt tính PGP của các mẫu có mức oxy hóa khác
nhau với hai loại chitosan (trước khi rửa mẫu-đợt 1)
80
31 3.19
So sánh hoạt tính PGP của các mẫu có mức oxy hóa khác
nhau với hai loại chitosan (sau khi rửa mẫu-đợt 1)
81
32 3.20
So sánh hoạt tính PGP của các mẫu có mức oxy hóa khác
nhau với hai loại chitosan (trước khi rửa mẫu-đợt 2)
81
33 3.21
So sánh hoạt tính PGP của các mẫu có mức oxy hóa khác
nhau với hai loại chitosan (sau khi rửa mẫu-đợt 2)
82
34 3.22

Quá trình giải phóng enzym của mẫu M3-D5 sau khi ngâm
trong dung dịch đệm phosphate có pH 6.2 và 7.8 tại 45
o
C
88
42 3.30
Độ mất hoạt tính của mẫu M4-D5 sau khi ngâm trong dung
dịch đệm phosphate thủy phân có pH 6.2 và 7.8 tại 37
o
C
89
43 3.31
Độ mất hoạt tính của mẫu M4-D5 sau khi ngâm trong dung
dịch đệm phosphate thủy phân có pH 6.2 và 7.8 tại 45
o
C
89
44 3.32
Độ mất hoạt tính của mẫu Nga sau khi ngâm trong dung dịch
đệm phosphate thủy phân có pH 6.2 và 7.8 tại 37
o
C
90
45 3.33 Độ mất hoạt tính của mẫu Nga sau khi ngâm trong dung dịch 90
13

đệm phosphate thủy phân có pH 6.2 và 7.8 tại 45
o
C
46 3.34

54 3.42
Quá trình phân hủy thủy phân của DAC (mức độ ôxy hóa
6%) chứa tổ hợp enzym HP trong dung dịch đệm phôtphat
pH 7,4 sau 72 giờ phản ứng
95
55 3.43
Xenlulo biến tính với mức oxy hóa 3,12% được cấy chitosan
và sau đó cố định enzym HP
97
56 3.44 Băng multiferm do VCNMT chế tạo 98
57 3.45
Băng gạc multiferm do Viện CNMT chế tạo trước (a) và sau
khi (b) chiếu tia gama 25 kGrey
98
58 3.46
Phổ NVS của một mẫu băng phủ vết thương DAC-Chit-
EnzHP
99
59 3.47
Tốc độ suy giảm hoạt tính của tổ hợp enzym HP cố định trên
DAC có mức độ oxy hóa khác nhau, so sánh với “Multiferm
của Nga”.
103
60 3.48
Tốc độ suy giảm hoạt tính của tổ hợp enzym HP cố định trên
DAC có mức độ oxy hóa khác nhau, so sánh với “Multiferm
của Nga”
103
61 3.49 Cho chuột nhắt trắng uống dung dịch enzym HP 105
62 3.50 Chuột nhắt trắng sau 72h uống dung dịch enzym HP 105

Thiết bị siêu lọc cho phép thu nhận phân đoạn protein có
TLPT trong dải 10 kDa - 100 kDa trong đó chứa toàn bộ tổ
hợp enzym HP
122
79 3.63
Điện di xác định trọng lượng phân tử enzym thuộc phân đoạn
40 - 70 % (NH
4
)SO
4

123
80 3.64
Sơ đồ quy trình tách chiêt tổ hợp enzym HP bằng phương
pháp tách phân đoạn với cồn etylic
125
81 3.65
Sơ đồ quy trình thu nhận tổ hợp enzym HP bằng phương
pháp tách phân đoạn với sunfat amoni có nồng độ giảm dần
126
82 3.66
Sơ đồ quy trình tinh chế tổ hợp enzym HP trên cột TĐA
Amberlit IRA-420
127
83 3.67 Phổ điện di của các tổ hợp enzym HP 129
84 3.68 Sơ đồ thu hồi bằng kết tủa phân đoạn 131
85 3.69 Sơ đồ thu hồi trên cột IRA 420 132
86 3.70.
Sơ đồ quy trình công nghệ tinh chế tổ hợp enzym phân giải
protein từ gan tụy cua biển sử dụng cột trao đổi anion

hủy protein được đưa lên vết thương dưới dạng tự do sẽ bị rửa ra dễ dàng khỏi bề mặt
tổn thương cùng với tiết dịch do tính chất hút nước cao của băng gạc từ vật liệu
xenlulo. Có lẽ chính vì những hiện tượng nêu trên mà ở vào những thập niên cuối thế
kỷ trước việc sử dụng enzym để điều trị vết thương mủ - hoại tử đã bị hạn chế rất
nhiều. Tuy nhiên, do khả năng làm sạch nhanh vết thương và không gây đau đớn cho
bệnh nhân khi thay băng, vấn đề sử dụng các chế phẩm hoạt tính sinh học (HTSH)
trong điều trị vết thương vẫn là một đề tài nghiên cứu đầy hứa hẹn, buộc các nhà khoa
học nghiên cứu hoàn thiện các loại băng gạc cố định enzym.
Vào những năm cuối của thế kỷ 20 đã xuất hiện một số giải pháp điều trị sử dụng
enzym phân hủy protein để phân hủy chất hoại tử bằng cách cấp liên tục proteaza vào
vị trí tổn thương hoặc sử dụng enzym được cố định trên các vật liệu mang khác nhau.
Tuy nhiên các kết quả đáng khích lệ thu được vẫn không cho phép mở rộng khả năng
ứng dụng của phương pháp điều trị, chủ yếu là do công nghệ sản xuất các loại băng
gạc này đòi hỏi chi phí cao, đồng thời vẫn không giải quyết được vấn đề duy trì hoạt
tính cao của enzym với tác dụng kéo dài trong quá trình điều trị vết thương.
Có thể nói trong công nghệ sản xuất vật liệu phủ vết thương các nhà khoa học
Nga thuộc Viện Nghiên cứu vật liệu dệt Moskva là những người đi đầu trong việc
khắc phục những trở ngại nêu trên bằng cách oxy hóa một số lượng nhất định các đơn
nguyên glucopyranose trên phân tử xenlulo nhằm tạo ra các nhóm đialđehyt để liên kết
hóa học với các phân tử enzym, đồng thời lượng enzym còn lại được hấp phụ tiếp lên
lớp enzym đã được liên kết cộng hóa trị với xenlulo. Nhờ vậy đã chế tạo được nhiều
chủng loại vật liệu phủ vết thương cố định enzym có tác dụng kéo dài và hiệu quả điều
16

trị cao, cho phép giảm thiểu hàng trăm lần tải lượng thuốc trên bệnh nhân, đồng thời
thể hiện hiệu ứng giảm đau (Atraumatic) cho bệnh nhân khi thay băng.
Thực hiện nhiệm vụ hợp tác KHCN với Viện Nghiên cứu Vật liệu dệt Moskva
theo Nghị định thư chúng tôi nghiên cứu chế tạo vật liệu phủ vết thương trên cơ sở
xenlulo cố định enzym phân hủy protein. Bản báo cáo này trình bày kết quả nghiên
cứu chế tạo băng gạc xenlulo cố định enzym hepatopancreat (HP) từ gan tụy cua biển

các tính chất của chúng đã được nghiên cứu nhiều trong những thập kỷ gần đây [9-11].
Enzym thường được cố định trên vật mang không tan phục vụ cho mục đích làm
buồng phản ứng sinh học, thiết bị cảm biến sinh học, vật liệu xúc tác trong y học, công
nghiệp thực phẩm và dược phẩm, xử lý ô nhiễm môi trường v.v
Trong lĩnh vực y học, đặc biệt là trong điều trị vết thương, vật liệu mang enzym
trên cơ sở xenlulo được sử dụng nhiều nhất nhờ tính chất tương hợp sinh học và khả
năng đảm bảo vệ sinh tuyệt vời của xenlulo. Đồng thời, xenlulo không tương tác hóa
học với các chất sinh học, trong khi ít nhiều tham gia vào quá trình làm sạch vết
thương như hút tiết dịch, bảo vệ vết thương khỏi sự nhiễm bẩn từ không khí và duy trì
chế độ nhiệt trong môi trường vết thương. Việc đưa các thuốc điều trị cố định trên
xenlulo vào vùng tổn thương không gây ra bất kỳ hiệu ứng phụ nào, cho phép giải
quyết đồng thời một số vấn đề như nâng cao hoạt tính của chế phẩm, giảm thiểu lượng
enzym tiêu hao, loại bỏ các tác dụng không mong muốn của chế phẩm lên các mô lành
xung quang vùng tổn thương [10].
Xenlulo tự nhiên là vật liệu hữu cơ phổ biến nhất trên Trái đất. Chất polyme tự
tái sinh này có mặt trong tất cả các loài thực vật trên đất liền, dưới biển và còn được
18

tổng hợp bởi các vi sinh vật. Tổng sinh khối xenlulo trong tự nhiên được tổng hợp mỗi
năm là khoảng từ 500 - 1000 tỷ tấn.
Khảo sát các thành tựu trong lĩnh vực vật liệu phủ vết thương cố định enzym,
phải thừa nhận rằng một khối lượng lớn (hơn 2000) các chủng loại vật liệu điều trị tổn
thương đã được điều chế bằng các công nghệ khác nhau trong những thập kỷ gần đây.
Tuy nhiên, đa số các vật liệu phủ vết thương này dễ bị vô hoạt hoặc chỉ có tác dụng
ngắn đối với các ổ nhiễm trùng trên các tổn thương. Có vô số các cách thức và nguyên
lý công nghệ đưa thuốc lên vật liệu băng gạc. Trong mọi trường hợp, ý tưởng và
nguyên lý thể hiện tác dụng điều trị của vật liệu phủ vết thương là phải làm sao tạo ra
được một kho chứa mà trong đó vật hấp thu là một polyme rắn (vải sợi, màng phim,
bọt xốp v v ) để có thể đưa vào đó thuốc chữa bệnh hoặc chất hoạt tính sinh học. Từ
kho chứa này, một chế phẩm thuốc hoặc hỗn hợp chất hoạt tính sinh học có thể được

giảm lượng enzym tiêu hao, các nhà khoa học đã chế tạo ra loại vật liệu phủ được cấy
enzym có tác dụng điều trị kéo dài. Loại vật liệu phủ vết thương chứa enzym này có
khả năng đề kháng cao trước những biến đổi của các yếu tố môi trường, nhưng hoạt
tính phân hủy protein của chúng vẫn thấp hơn đáng kể so với hoạt tính của các enzym
dạng tự do.
Trong bản quyền sáng chế của Nga công bố năm 1979 [19] một loại vật liệu
màng được giới thiệu với chất mang là triacetat xenlulo được cố định enzym phân hủy
protein (tripsin hoặc -chymotripsin), trong đó triacetat xenlulo chiếm từ 80 – 90% và
còn lại là enzym. Vật liệu màng nói trên được điều chế bằng cách nhũ tương hóa dung
dịch nước của enzym phân hủy protein vào trong dung dịch ete xenlulo trong dung
môi hữu cơ không tan trong nước, rồi sau đó tiến hành đổ khung tạo màng. Trong vật
liệu màng đó enzym tồn tại dưới dạng các bao thể siêu tinh vi, cho phép phân hủy các
thành phần hoại tử trên vết thương với thời gian kéo dài nhờ khả năng giải phóng từ từ
các liều lượng enzym nhỏ ra khỏi màng phim. Tuy nhiên, một khi enzym được giải
phóng vào dịch vết thương dưới dạng tự do nó thể hiện tất cả các tính chất của enzym
nguyên khai với tất cả các nhược điểm vốn có như khả năng đề kháng kém đối với các
tác nhân ức chế, các biến đổi về pH và nhiệt độ môi trường, đồng thời thể hiện tính
chất kháng nguyên và gây sốt. Ngoài ra, vật liệu màng này còn có những nhược điểm
đáng chú ý như sau:
- Tỷ lệ tiêu hao enzym rất cao - chiếm nhiều phần trăm trọng lượng màng;
- Việc sử dụng màng còn bị hạn chế bởi nguy cơ hoạt tính enzym có thể bị vô
hiệu hóa trong dung môi hữu cơ sử dụng trong quá trình điều chế màng phim.
Các nhà khoa học thuộc một số nước phương tây đề xuất phương pháp điều chế
vật liệu có hoạt tính sinh học dưới dạng hạt với chất mang như là dextran hoặc chitin,
chitosan, được cấy enzym như tripsin hoặc chymotripsin, với tỷ lệ như sau: chất mang
từ 80 – 80,5% và còn lại là enzym ([20,21,22]). Phương pháp được tiến hành theo các
bước như sau:
- Chuẩn bị vật liệu dạng hạt (chất mang) từ chitin hoặc chitosan hoặc dextran
bằng cách cho trương trong nước;
20

gồm lớp bảo vệ (vải không dệt), lớp hấp thụ dịch (bông hút nước) và lớp tiếp giáp vết
thương (vải không dệt, màng polyuretan hoặc polyetylen hoặc triacetat xenlulo có
chứa bột đồng) mà trên đó được phủ một lớp enzym [23]. Vật liệu phủ này khi tiếp
xúc với dịch vết thương, lớp enzym bị vô hiệu hóa rất nhanh giống như enzym nguyên
khai, vì vậy đã không tìm được ứng dụng rộng rãi.
Theo một patent của Đức [24], quá trình chế tạo vật liệu phủ vết thương cố định
enzym được thực hiện như sau:
- Trước tiên vải sợi xenlulo được hoạt hóa bằng cách tạo ra nhóm đialđehyt trên
các phân tử monosaccarit xenlulo cho tới khi nồng độ các nhóm này đạt giá trị 0,0625
– 3,125 mg-đương lượng trên một gram vật mang.
- Vật mang đã hoạt hóa sau đó được cho phản ứng với các enzym thích hợp trong
dung dịch đệm có pH 6,5 - 7,5 tại nhiệt độ phòng trong vòng 8 -16 giờ, sau đó rửa và
sấy khô.
Phương pháp có nhược điểm thường hay gặp là hoạt tính enzym trên vết thương
giảm nhiều so với enzym ở dạng tự do. Trước hết, đó là vì lượng enzym được cố định
trên xenlulo hoàn toàn bằng liên kết hóa học (liên kết cộng hóa trị) mà không có các
21

thành phần liên kết khác tham gia (như liên kết hấp phụ và liên kết cơ học). Sở dĩ như
vậy chủ yếu là do quá trình oxy hóa xenlulo thành đialđehyt đã được diễn ra một cách
không được kiểm soát, dẫn đến số lượng các đơn nguyên đialđehyt được tạo ra vượt
quá số lượng cần thiết, làm cho các phân tử enzym có mặt dễ dàng tiếp cận với nhóm
đialđehyt để hình thành liên kết azomethin.
Nhiều kết quả nghiên cứu của Viện Nghiên cứu Vật liệu dệt Moskva [5,15,16,17)
đã chỉ ra rằng tính chất liên kết của enzym cũng như các chất HTSH khác với nền
xenlulo được xác định bởi mức độ oxy hóa và bởi số lượng các nhóm chức được tạo ra
trên vật liệu mang. Trong lĩnh vực công nghệ enzym người ta biết rằng quá trình cấy
một khối lượng lớn các protein lên vật mang có thể dẫn đến hiệu ứng che chắn không
gian [15,16], gây cản trở cho các phản ứng hóa học. Khả năng bắt giữ phân tử enzym
(hoặc các chất HTSH khác) của vật mang có thể được mô tả bằng tỷ số của mức độ

dịch vết thương của các oligome được tạo ra sau đó, nghĩa là phụ thuộc vào sự hình
thành các hạt nano xenlulo cùng với các phân tử enzym được cố định trên đó.
Kết quả thực nghiệm thu được trên vật liệu phủ vết thương chế tạo theo patent
Anh Quốc ở trên cho thấy hiệu quả điều trị của nó không cao, bởi vì hầu hết tripsin đã
được liên kết hóa học bền vững với xenlulo, dẫn đến hoạt tính của enzym bị suy giảm
mạnh.
Nhằm mục đích chế tạo vật liệu chuyên sử dụng cho các buồng phản ứng sinh
học (bioreactor), làm đầu dò cảm ứng sinh học hoặc làm vật liệu sắc ký ái lực, trước
khi cố định các chất hoạt tính sinh lý học (HTSLH) lên vật liệu xenlulo, các nhà khoa
học Nhật Bản (US Patent 50 153 87, May 14 1991[27]) đã hoạt hóa màng xenlulo
bằng cách cho tác dụng với một hợp chất có công thức Cl-SO
2
-R, trong đó R là một
gốc alkyl hoặc một phenyl, có khả năng tạo liên kết hóa học bền vững giữa chất
HTSLH và phân tử xenlulo. Quá trình hoạt hóa màng xenlulo được các tác giả thực
hiện như sau: 100 ml dung dịch hỗn hợp phản ứng, trong đó chứa khoảng 0,3 – 0,5
mol p-toluen sunfonyl clorua trong dung môi (aceton hoặc acetonitryl) , thêm vào đó 1
g màng xenlulo với sự có mặt của một lượng bazơ (pyridin hoặc triethylamin) tương
đương 1,5 – 3,0 đương lượng p-toluen sunfonyl clorua, và cho phản ứng tại nhiệt độ
40 – 60
0
C trong khoảng 1 – 2 giờ. Quá trình cố định chất HTSLH lên màng xenlulo
đã được hoạt hóa có thể được thực hiện như sau: hòa tan chất HTSLH vào trong một
dung dịch đệm không chứa nhóm amin bậc I và có pH 6 - 8 (đệm phosphat), sau đó
cho dung dịch chạy quay vòng qua màng dưới áp suất dư tại nhiệt độ phòng trong thời
gian một vài giờ và cuối cùng rửa màng bằng dung dịch đệm.
Có thể thấy vật liệu xenlulo cố định ezym được chế tạo theo patent này, như đã
nói tới ở trên, chủ yếu nhằm sử dụng cho mục đích chế tạo bioreactor hoặc biosensor
v.v , và trong thực tế không thể sử dụng chúng làm băng gạc điều trị vết thương do
lực liên kết hóa học giữa enzym với sợi xenlulo ở đây lớn hơn đáng kể so với liên kết

kiện cho các đoạn axit amin trên phân tử protein dễ dàng tiếp cận với tâm hoạt động
của proteaza trypsin. Bằng cách ghép nối enzym với graphen oxit được chức năng hóa
với PEG-NH
2
các tác giả cho biết có thể tăng hoạt tính của trypsin lên 30 – 40 lần so
với trường hợp enzym được cố định bằng liên kết hóa học trên các vật mang khác,
trong khi khả năng chịu nhiệt của enzym cũng tăng đáng kể: 60 - 70% hoạt tính của
trypsin vẫn còn được giữ lại trên graphen sau khi xử lý nhiệt độ tại 80
0
C.
1.3. Viện NCVLD Moskva đi đầu trong nghiên cứu chế tạo vật liệu phủ vết
thương hiệu quả cao
Trong lĩnh vực sản xuất băng gạc điều trị vết thương, các nhược điểm nêu ở phần
trên đã được các nhà khoa học Nga thuộc Viện Nghiên cứu vật liệu dệt khắc phục [29-
34] bằng cách oxy hóa có kiểm soát một số lượng nhất định các đơn nguyên
glucopyranose trên phân tử xenlulo nhằm tạo ra các nhóm đialđehyt để liên kết cộng
hóa trị với các phân tử enzym, đồng thời lượng enzym cần thiết còn lại sẽ được hấp
phụ tiếp lên lớp enzym đã được liên kết hóa học.

P - Phosphat, điện tích (-)
R – Arghinin, điện tích (+)
K – Lysin, điện tích (+)
Trypsin, điện tích âm (-)
24

Các vật liệu mang trên cơ sở xenlulo có kích thước nano hoặc micrô chỉ mới bắt
đầu được biết đến trên thế giới những năm gần đây [35-38]. Tuy nhiên, trong thực tiễn
lâm sàng ở nước Nga từ vài ba thập kỷ trước đã xuất hiện một số chế phẩm thuốc chữa
bệnh được cố định trên xenlulo, trong đó nổi bật nhất là chế phẩm Dalcex - Tripsin, và
đã tạo ra một thế hệ vật liệu phủ vết thương mới trên cơ sở xenlulo tự nhiên mà trên

Xenlulo

Đial
dehyt xenluloDalcex
-
TripsinEnz
–

NH
2[IO
4
]
-
1O
C

2
OH

H

O
OO

O

CH
2
OH

H

OHO
HO

25


1
.exp(-k
1
) + a
2
.exp(-k
2
),
Trong đó: A
0
– hoạt tính enzym trên vật liệu mang tại thời điểm ban đầu; A

- hoạt tính
enzym còn lại trên vật liệu mang tại thời điểm ; a
1
và a
2
– hệ số thực nghiệm; k
1
và k
2

hằng số tốc độ phân hủy thủy phân, hay nói cách khác – hằng số tốc độ giải phóng
enzym từ vật liệu xenlulo vào dung dịch của các thành phần enzym có liên kết hóa học
và enzym có liên kết không hóa học tương ứng.
Hằng số tốc độ phân hủy thủy phân (k
1,2
) có thể xác định dễ dàng dựa trên giá trị

1/2