VIỆN HOÁ HỌC CÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỬ DỤNG CÂY KIẾN CÒ (RHINA
CANTHUS NASUTUS) ĐỂ SẢN XUẤT THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC CNĐT: HOÀNG PHƯƠNG LAN

9622



2.1. VẬT LIỆU 255

2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 255

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 255

2.3.1. Định lượng rhinacanthin trên HPLC 265

2.3.2 Qui trình chiết nhanh mẫu để phân tích rhinacanthin trên HPLC 255

2.3.3. Phương pháp thu nhận dịch chiết chứa rhinacanthin nồng độ cao 256

2.3.4. Phương pháp xử lý và bảo quản nguyên liệu cây Kiến cò 266

2.3.5. Phương pháp đánh giá sơ bộ một số chỉ tiêu sinh hóa của cây Kiến cò 266

2.3.6. Thử nghiệm hoạt tính sinh học của dịch chiết đối với sâu hại 277

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 288

3.1. NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT HOẠT CHẤT RHINACANTHIN TỪ CÂY KIẾN CÒ 288

3.1. 1. Xác định hàm lượng rhinacanthin trong lá, thân và rễ của cây Kiến cò 288

3.1.2. Lựa chọn dung môi chiết xuất hoạt chất rhinacanthin 299

2
3.1.3. Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình chiết xuất rhinacanthin 30


TNF-alpha Tumor Necrosis Factor-alpha
IL-4 Interleukin-4
AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome
CMV Cytomegalovirus
5-FU 5-Fluorouracil
PGE2
Prostaglandin E2
UV Ultraviolet (cực tím)
HPLC High-performance liquid chromatography
(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)
GC-MS Gas chromatography–mass spectrometry
(Sắc ký khí khối phổ)
IR Infrared spectroscopy (Phổ hồng ngoại)
LC
50
Lethal concentration ( Nồng độ gây chết) 4
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1. Hàm lượng rhinacanthin trong lá, thân và rễ cây Kiến cò 288

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của các loại dung môi tới hàm lượng cao chiết Kiến cò và
hàm lượng tổng các rhinacanthin trong cao chiết Kiến cò 30
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của độ etanol tới quá trình chiết xuất rhinacanthin……… 31

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình chiết xuất rhinacanthin 322
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình chiết xuất rhinacanthin từ cây Kiến cò………… 33
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi và bột Kiến cò tới quá trình chiết rhinacanthin 346


Hiện nay, dư lượng thuốc trừ sâu hóa học trong các sản phẩm nông
nghiệp tăng cao, gây mất an toàn cho người sử dụng, ảnh hưởng xấu tới môi
trường và sức khỏe cộng đồng. Ngoài ra, các sản phẩm làm ra không thể xuất
khẩu được nên ảnh hưởng lớn đến thu nhập của nông dân. Đây cũng là một
thách thức lớn cho nông dân Việt Nam khi gia nhập WTO.
Để giảm thiểu tác động xấu c
ủa thuốc trừ sâu đến môi trường và cộng
đồng, xu hướng sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc sinh học đang thay thế
dần thuốc hóa học. Các thuốc trừ sâu sinh học là một trong những lĩnh vực mà
Hóa học xanh quan tâm và hướng tới. Do đó việc nghiên cứu, tìm kiếm nguồn
nguyên liệu mới để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học luôn luôn được thúc đẩy.
Nguồn nguyên liệu là cây Kiến cò (
Rhinacanthus nasutus) hy vọng sẽ mở ra
hướng nghiên cứu ứng dụng khả quan cho thuốc trừ sâu sinh học. Chất chiết
rhinacanthin từ cây Kiến cò đáp ứng đầy đủ của một thuốc trừ sâu tự nhiên,
nó có khả năng phân hủy trong môi trường ánh sáng sau 8 tuần, không độc hại
cho con người [14].
Trong Rhinacanthus nasutus chứa các hoạt chất rhinacanthin như là
rhinacanthin-C, rhinacanthin-D, rhinacanthin-N,…có hoạt tính diệt sâu bọ,
kháng nấm, kháng khuẩn, kháng virut, chống viêm, ho
ạt tính chống dị ứng,
ngăn ngừa khối u phát triển [5]. Nghiên cứu cho thấy việc sử dụng dung môi
etyl axetat, etanol, methanol,…đều có thể chiết tách được rhinacanthin từ
Rhinacanthus nasutus [4,6].
Từ những năm 90 của thế kỷ trước, các nhà nghiên cứu Việt Nam tại
Viện Công nghệ sinh học đã đề cập đến việc sử dụng chất chiết cây Kiến cò
làm thuốc trừ sâu, nhưng chưa đi sâu nghiên cứu v
ề chất chiết rhinacanthin.
Gần đây nhất 9/2012 các nhà nghiên cứu Thái Lan đã nghiên cứu sử dụng


8
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. ĐẶC ĐIỂM, PHÂN BỐ CỦA CÂY KIẾN CÒ (RHINACANTHUS NASUTUS)
Mô tả : Là cây nhỏ mọc thành bụi, cao 1-2m, có rễ chùm. Thân non có
lông mịn. Lá mọc đối, có cuống, phiến hình trứng thuôn dài, mặt trên nhẵn,
mặt dưới hơi có lông mịn. Hoa nhỏ, mọc nhiều hoa ở nách lá hoặc đầu cành
hay ngọn thân. Hoa màu trắng nom như con hạc đang bay nên có tên gọi là
Bạch hạc. Quả nang dài, có lông.
Cây rất dễ trồng, mùa xuân hoặc mùa thu, trồng bằng cành, ra hoa tháng 8.

Hình 1.1. Lá và hoa cây Kiến cò
Thông thường sử dụng phần lá, cành và rễ cây[19].
Đặc điểm phân loại [5,7,11]
Giới
Plantae
Họ
Acanthaceae (Ô rô)
Phân giới
Viridaeplantae
Phân họ
Acanthoideae
Ngành

Nagamallige, Doddapatika (Kannada); Juipana
(Bengali) Damari (KonKani); Palakjuhi (Urdu);
Yudhikaparni, Yoodhikaparni (Sanskrit)
Spanish (Tây Ban
Nha)
Pajarito
Việt Nam
Nam uy linh tiên, Bạch hạc [17].
Phân bố: Cây Kiến cò phân bố nhiều ở Ấn Độ, Thái Lan, Myanmar, Nhật
Bản và các nước Đông Nam Á khác [1,11]. Hiện nay, tại Ấn Độ và Thái Lan
đã sử dụng phương pháp nuôi cấy mô để nhân rộng vùng trồng nguyên liệu
cây Kiến cò[7].
Tại Việt Nam, cây Kiến cò được trồng ở nhiều nơi từ Bắc đến Nam: Hòa
Bình, Phú Thọ, Thường Tín (Hà Nội), Thái Bình,Bình Dương, Kiên Giang…,
tuy nhiên cây chưa được trồng thành vùng nguyên liệu, nên khi cần sử dụng
phải thu gom từ nhiều vùng khác nhau.
Thành phần hóa học
Trong cây Kiến cò (Rhinacanthus nasutus) có chứa các thành phần hóa học
chính là : rhinacanthin-C, rhinacanthin-D, rhinacanthin-N…, ngoài ra còn có
10
rhinacanthin-A, rhinacanthin-B, rhinacanthin-E, rhinacanthin-F, rhinacanthin-
Q, lupeol, b-sitosterol, stigmasterol [2,5,11].
Hàm lượng rhinacanthin trong lá Kiến cò : rhinacanthin-C (1,9%),
rhinacanthin-D (0,16%), rhinacathin-N (0,07%) [4,13].
Một số tài liệu lại chứng minh từ lá và cành cây Kiến cò tách chiết được các
thành phần flavonoid,benzenoid, coumarin, anthraquinon, quinon, glycoside,
cacbohydrate, triterpens, sterol, và chlorophyll. Rhincanthone (3,4 dihydro-
3,3-dimethyl-2H naptho[1,2-b]pyran-5,6dione) có tác dụng chính chống ung
thư. Ngoài ra, trong thành phần còn chứa dehydro alapachone, p-
hydroxybenzaldehyl, methyl vanillate syringaldehyde, lupeol, wogonin,

- Ít độc hơn đối với người, gia súc và không ảnh hưởng tới các loài có ích
như chim, cá và các thiên địch.
- Phân hủy sinh học nhanh, ít để lại dư lượng trong môi trường và nông
phẩm nên thuốc rất thân thiện với môi trường và thường được thay thế các
thu
ốc trừ sâu thông thường trong các chương trình quản lý dịch hại tổng hợp
(IPM) [17].
1.3. MỘT SỐ SẢN PHẨM THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC
- Nguồn gốc thảo mộc: VINEEM 1500 EC – chiết xuất từ nhân hạt
Neem (Azadirachta indica A. Juss ) có chứa họat chất Azadirachtin, có hiệu
lực phòng trừ nhiều lọai sâu hại trên cây trồng như lúa, rau màu, cây công
nghiệp, cây ăn trái, hoa kiểng.
Hoạt chất Rotenone được chiết xuất từ hai giống cây họ
đậu là Derris
elliptica Benth và Derris trifoliata có tác dụng diệt trừ sâu rầy trên lúa, ốc
bươu vàng cũng như các lọai cá dữ, cá tạp trong ruộng nuôi tôm.
Karanjin – chiết xuất từ cây hoa đào Ấn Độ, Matrine – chiết xuất từ cây
khổ sâm, Saponin – bã trà
Chế phẩm Đầu trâu Bihopper ( hoạt chất Rotenone ) diệt tuyến trùng và
chế phẩm Olicide (Oligo – Sacarit) tăng sức đề kháng bệnh của cây trồng.
12
- Nguồn gốc vi sinh: Thuốc trừ sâu vi sinh BT (Bacciluss Thuringiensis
var.) có nguồn gốc vi khuẩn, phổ diệt sâu rộng và hữu hiệu đối với các loại
sâu như sâu cuốn lá, sâu tơ, sâu xanh, sâu khoang, sâu ăn tạp… Sản phẩm
thương mại có trên thị trường khá nhiều như Vi-BT 32000WP, 16000WP; BT
Xentary 35WDG, Firibiotox P dạng bột; Firibiotox C dạng dịch cô đặc …
- Nguồn gốc nấm: sản phẩm VIBAMEC với hoạt chất Abamectin được
phân lập từ quá trình lên men n
ấm Steptomyces avermitilis. Diệt trừ sâu vẽ
bùa, nhện, sâu tơ, sâu xanh, bọ trĩ, bọ phấn; Ngoài ra cũng trong nhóm này

phẩm tiêu biểu là Vizubon – D với hoạt chất Methyl Eugenol dẫn dụ đối với
ruồi đực rất mạnh. Trong sản ph
ẩm có pha trộn thêm chất diệt ruồi Naled. Đối
với sâu đục vỏ trái cam quýt (Prays citri Milliire) cũng đã được sử dụng
pheromone có hoạt chất Z(7)- Tetradecenal.
- Nguồn gốc tuyến trùng: tuyến trùng EPN (Entomopathogenic
nematodes) ký sinh và gây bệnh cho côn trùng, là tác nhân có nhiều triển
vọng bởi có khả năng diệt sâu nhanh, phổ diệt sâu rộng rộng, an toàn cho
người, động vật và không gây khả năng “kháng thuốc” ở sâu hại. Nhóm các
nhà khoa học ở Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vậ
t, Viện Khoa học và
Công nghệ VN đã sản xuất thử nghiệm 6 chế phẩm EPN có tên từ Biostar-1
đến Biostar-6, trong đó Biostar-3 và Biostar-5 được sản xuất hàng trăm lít để
thử nghiệm rộng rãi trên đồng ruộng[ 17].
1.4. RHINACANTHIN
Rhinacanthin là các dẫn xuất của naphtoquinon được tìm thấy trong cây
Kiến cò (Rhinacanthus nasutus), bao gồm các rhinacanthin-C, rhinacanthin-
D, rhinacanthin-N…, ngoài ra còn có rhinacanthin-A, rhinacanthin-B,
rhinacanthin-E, rhinacanthin-F, rhinacanthin-Q.
Các rhinacanthin tan trong nước, và các dung môi hữu cơ như etanol,
etyl axetate, metanol…
Chất chiết rhinacanthin được bảo quản ở nhiệt độ 4
0
C-30
0
C±2 trong điều
kiện kín, tránh ánh sáng trực tiếp. Theo dõi thấy, sau khi cho tiếp xúc với ánh
sáng, chất chiết rhinacanthin sẽ mất tính ổn định sau một tuần. Ở nhiệt độ
45
0

Rhinacanthin-N tinh thể vàng.
Rhinacanthin-C và –D đều đóng vai trò là chất chuyển hóa thứ sinh, không
tham gia trực tiếp vào quá trình sinh trưởng, và phát triển của cây [3,14].
Cả hai rhinacanthin-C và rhinacanthin-D đều có khả năng ức chế loại vi
rút CMV(cytomegalovirus) với liều lượng tương ứng là 0,02-0,22µg/mL, đó
là loại vi rút làm cho tế bào biểu mô to ra, gây nhiễm trùng cơ hội ở bệnh
15
nhân HIV đẩy nhanh tiến triển thành AIDS và tử vong, loại vi rút này cũng
gây bệnh ở trẻ sơ sinh. Đặc biệt rhinacanthin-C còn có khả năng chống lại
một loạt các vi khuẩn S.mutans, P.acnes, H.pylori, S.aureus, S.epidermidis và
C.albicans [5].
Rhinacanthin-C có khả năng chống sự tăng sinh tế bào tương đương với
5-FU (5-Fluorouracil) là thuốc chống ung thư kháng pyrimidin.
Rhinacanthin-Q một dẫn chất của 1,4 napthoquinon tách chiết từ rễ có
hoạt tính ngăn cản sự phân bào và kháng tiểu cầu [3,6,9,10,11,13,14].

Cấu trúc hóa học của rhinacanthin-A,-B và –O

Các rhinacanthin C, D, N, Q
Ngoài các rhinacanthin trên, tác giả Ấn Độ Suman Bukke (2011) còn cho rằng
trong cây Kiến cò chứa nhiều loại rhinacanthin khác mang những hoạt tính
sinh học [11]:

16

Phân đoạn etyl axetat (17,0g) Lớp H
2
O

Phân chia giữa n-Butanol/ H
2
O Phân đoạn n-Butanol(11,7g) Phân đoạn H
2
O
Hình 1.4. Chiết xuất phân đoạn chất chiết cây Kiến cò
Tác giả R.Nirmaladevi và cộng sự (2010) cũng sử dụng methanol để chiết
các thành phần có hoạt tính sinh học từ lá Kiến cò và sấy cao chiết ở 60
0
C,
tránh ánh sáng. Tác giả đã dùng phép phân tích HPLC, GC-MS và phổ hồng
ngoại IR nhằm nhận dạng các thành phần tự nhiên có hoạt tính chống oxy hóa
trong cao chiết Kiến cò [4,13].
Theo tác giả M.Upendra Rao và cộng sự (2010) các hoạt chất rhinacanthin
của Rhinacanthus nasutus được chiết bằng etanol và etyl axetat. Rễ cây được
rửa sạch, để khô ở 30-40
0
C, nghiền thành bột thô. Chiết bột thô bằng
18
methanol trong thiết bị soxhlet. Phần chiết methanol được cô ở dưới 45
0
C,
điều kiện áp suất giảm, thu dịch khan, dùng cho dược. Hoặc dùng etyl axetat

sâu tơ đều chết 100%, càng pha loãng thì hiệu lực diệt sâu càng gi
ảm. Pha
loãng đến 200 lần thì hiệu lực diệt sâu rất thấp.
Gần đây nhất, tháng 9/2012, các nhà khoa học tại đại học Madihol (Thái
Lan), Pethuan S và cộng sự công bố rằng trong cây Kiến cò (Rhinacanthus
19
nasutus) chứa ba thành phần rhinacanthin-A, -B, và –C đều có hoạt tính diệt
sâu khoang (Spodoptera frugiperda) và ức chế muỗi gây bệnh sốt rét
Anopheles minumus[14].
Hoạt tính kháng vi rút
Từ lâu, tác giả người Thái Lan Anna SendlA và cộng sự (1996) đã chứng
minh hai napthoquinone, rhinacanthin-C và rhinacanthin-D tách chiết từ cây Kiến
cò (Rhinacanthus nasutus) có khả năng ức chế vi rút CMV (cytomegalovirus).
Rhinacanthin E và F có hoạt tính kháng vi rút cúm tuýp A [5,11].
Hoạt tính kháng vi khuẩn
Năm 2010, tại khoa Hóa dược, Đại học Dược Annamacharya (Ấn Độ),
tác giả M.Upendra Rao cùng cộng sự khẳng đị
nh thêm hoạt tính kháng khuẩn
của cao chiết Rhinacanthus nasutus, chất chiết thô thể hiện khả năng kháng vi
khuẩn kỵ khí gram dương Streptococcus mutans, Propionibacterium acnes
với nồng độ là 4-32mcg/ml, kháng vi khuẩn hiếu khí gram dương
Streptococcus aureus, Streptococcus epidermidis với nồng độ tương ứng 256
và 512mcg/ml. Chỉ có chất chiết thô mới có khả năng kháng vi khuẩn gram
âm hiếu khí Helicobacter pylori với nồng độ 512mg/ml. Cao chiết Kiến cò
chứa hàm lượng rhinacanthin cao tới 70% có hoạt tính diệt khuẩn t
ốt. Sở dĩ
như vậy có thể là do tác dụng cộng hưởng của các rhinacanthin[5,11].
Hoạt tính kháng nấm
Kodam et.al.(2007) đã tách được một dẫn xuất của napthopyran (3,4-
dihydro-3,3-dimethyl-2H-naphtho[2,3-b]pyran-5,10dione) từ cây Kiến cò có

của TNF-alpha (Tumor Necrosis Factor-alpha) – một protein tế bào có thể
kích thích trực tiếp quá trình viêm. Tuy nhiên tác giả Kupradinun P và cộng
sự (2009) lại cho rằng dịch chiết Rhinacanthus nasutus từ rễ không có hiệu
quả đối với viêm đại tràng [15,11].
Hoạt tính chống dị ứng
Supinya Tewtrakul và cộng sự (2009) chứng minh ba dẫn chất
naphtoquinon: rhinacanthin-C,-D,-N chiết từ lá Rhinacanthus nasutus có khả
năng chống dị ứng rất tốt, chúng kháng lại kháng nguyên sinh enzym β-
hexosaminidaza đánh d
ấu quá trình mất hạt nhỏ trong các tế bào bạch cầu ưa
kiềm RBL-2H3. Ba chất này cũng kháng lại kháng nguyên sinh các protein
TNF-alpha và IL-4 (Interleukin-4) [5,16,11].
21
Tác nhân diệt ấu trùng muỗi
Yupha Rongsriyam và cộng sự (2006) đã công bố chất chiết
Rhinacanthus Nasutus có thể ức chế ấu trùng muỗi Aedes aegypti và Culex
quinquefasciatus. Chế phẩm dạng viên chứa 5-10% chất chiết thô và lactose
thể hiện khả năng diệt muỗi Aedes aegypti khác nhau nhiều, nồng độ gây chết
LC
50
trong 48 giờ tương ứng là 13,6 và 14,2 mg/l. Khả năng diệt muỗi Culex
quinquefasciatus cũng tương tự, liều gây chết LC
50
là 18,7 và 17,3 mg/l
(p>0,05). Trong khi đó cả hai nhóm ấu trùng đều không bị chết vì dung dịch
đường lactose và nước dechlorinate [5,11].
Ngoài ra, hai tác giả Ấn Độ, Pasupuleti Visweswara Rao và Malepati
Dhananjaya Naidu (2010) nghiên cứu trên hai nhóm chuột mắc bệnh tiểu
đường và chuột bình thường sau khi được tiêm cao chiết lá Rhinacanthus
Nasutus với liều lượng 200mg/kg, theo dõi sau 8 giờ lượng đường trong máu

rhinacanthin từ cây Kiến cò có tác dụng kích thích mọc tóc vô cùng hiệu quả,
độ an toàn cao, ứng dụng để sản xuất thuốc kích thích mọc tóc và mỹ phẩm
ngăn ngừa rụng tóc [6].
Công ty Lanna Health Hub (Thái Lan) đã tung ra thị trường loại kem
dưỡng da Teen Face, thành phần chứa cao chiết Rhinacanthus Nasutus, làm
đẹp da, sạch khuẩn, không bị mụn trứng cá, được giới trẻ rất ưa chuộng.

Hình 1.6. Kem bôi mặt chứa các thành phần thảo mộc Pueraria Mirifica, Aloe
Barbadensis, Emblic Myrabolan Extrac, Rhinacanthus Nasutus
Công ty Rasksa Thai Herbs của Thái Lan có sản phẩm chè thảo mộc
Rhinacanthus Nasutus dùng cho người bị dị ứng với thuốc men và thịt muối
[23].

Hình 1.7. Chè hòa tan từ cây Kiến cò
23
Chất chiết cây Kiến cò được ứng dụng nhiều vào các sản phẩm phục vụ con
người như vậy, nên khi sử dụng chất chiết này để sản xuất thuốc trừ sâu sinh
học sẽ có độ an toàn cao, và thân thiện với con người.
1.7. VÀI NÉT ĐẠI CƯƠNG VỀ NAPHTOQUINON
Hoạt chất rhinacanthin từ cây Kiến cò là dẫn xuất của naphtoquinon, nên
cần có hiểu biết sơ lược về naphtoquinon.
Naphtoquinon là dẫn xuất c
ủa naphthalen, có màu vàng, vàng cam hoặc đỏ.
Ba đồng phân của napthtoquinon là: 1,2- napthtoquinon, 1,4- napthtoquinon
(có dẫn xuất là vitamin K), và 2,6- napthtoquinon. Ngoài ra trong tự nhiên
còn nhiều dẫn xuất của naphtoquinon như: juglone, plumbagin, droserone.
Các dẫn xuất của naphtoquinon mang nhiều hoạt tính sinh học quan trọng:
diệt sâu hại, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng vi rút, chống viêm, hạ sốt. Các
thực vật chứa naphtoquinon phổ biến ở Trung Quốc, các nước Đông Nam á,
và Nam Mỹ. Thường dùng trị bệnh ác tính và ký sinh trùng.