ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN
*********
TÊN ĐỀ TÀI:
Nghiên cứu một số đột biến của virut viêm gan B tại Việt Nam nhằm tìm
hướng phòng chống và điều írị.
MÃ SỎ: QG.09.17
CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI : PGS.TS.NGÔ GIANG LIÊN
CÁN B ộ THAM GIA : Th.S.Đỗ Thị Vinh An
Th.S.Trần Thu Hà
Th.s. Phạm Đức Ngọc
Th.s. Nguyễn Văn Tuấn
CN . Le Xuân Thịnh
TAI HỌC QUỐC GIA HA NỌI
TRUNG Tâ m t h ô n g tin Thư viê n
00060000^3
BÁO CÁO TÓM TẮT
1. Tên đề tài: Nghiên cứu một số đột biến của virut viêm gan B tại Việt
Nam nhằm tìm hưởng phòng chống và điều trị
2. Mã số : QG.09.17
3. Chủ trì để tà i: TS. Ngô Giang Liên
4. Các cán bộ tham gia:
stt Họ và tên Cơ quan
1 Th.s. ĐỖ Thị Vinh An Bệnh viện Bạch Mai, Hà Nôi
2 Th.s. Trần Thu Hà Khoa Sinh, ĐHKHTN
3 Th.S.Phạm Đức Ngọc Khoa Sinh, ĐHKHTN
4 Th.S.NguyễnVănTuấn Khoa Sinh học Phân tử, Viện SR Hà
Nội
5 CN. Lê Xuân Thịnh Viện Huyết học Truyền máu Hà Nội
5. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu:
5.1. Mục tiêu nghiên cứu:

Nhóm 1 bao gồm các đột biến đặc trưng cho mẫu thu thập tại VN : Đột
biến tại vị trí 876 với G biến đổi thành c, ở vị trí 1116 với G biến đổi thành A
và ở vị trí 1130 với c biến đổi thành G. Nhóm 2 bao gồm các đột biến cho các
mẫu thu thập tại VN và 1 số các nước khác: Đột biến tại vị trí 887 với A biến
đổi thành G, ở vị trí 888 vói G biến đổi thành A, ở vị trí 942 với A biến đổi
thành c, ở vị trí 1120 với T biến đổi thành A. Nhóm 3 bao gồm các đột biến
chung cho tật cả ở các mẫu trên thế giới kể cả mẫu từ Việt Nam: ở vị trí 891
với T biến đôi thành c, ở vị trí 897 với A biến đổi thành G và ở vị trí 898 với
G biên đôi thanh A. Những đột biển phát hiện trong nghiên cứu này đều là các
đột biên thay thê nucleotide. Những nghiên cứu gần đây cho thấy tầm quan
trọng của các đột biên ở gen s vì chứa vùng quyết đinh kháng nguyên “a”. Do
I
2
vậy các nghiên cứu về những đột biên thuộc gen s cua HBV rat can cho viẹc
thiết kế các vaccine cho nhiều đột biên và kit chân đoán HB V
6.2. Ket quả : 02 công bổ
6.2.1. Quốc tế: 01 báo cáo khoa học
N Giang Lien, B Khanh Hoa, T Thu Ha (2010), “ The survey of s gene
mutation of Hepatitis B virus circulating in Vietnam”. Poster presentation at
14 th International Congress of Infectious Diseases, March 2010, Myami,
USA.
6.2.2. Trong nước: 01 bài báo
Pham Due Ngoc, Tran Thu Ha, Tràn Thị Lien, Le Xuan Thinh, Nguyen Van
Tuan and Ngo Giang Lien (2010), “ Preliminary study on some s gene
mutation of HBV isolated in Vietnam”. Journal of Science and Technology,
Vol26,No.4S, 2010.
6.3. Đào tạo:
-01 cử nhân sinh học: Trần Thị Thơ (2009)
-01 Nghiên cứu sinh : Trần Thu Hà (2012)
7. Tình hình kinh phí của đề tài:

+ Determination of mutations in the s gene region of HBV
+ To analyze these mutations and to compare mutations from samples
collected in Vietnam to others regions in the world.
5.1. Research content
+ To collect samples from blood donor group infected HBV
+ To keep the above samples in good condition for lab assays
+ To extract DNA-HBV
+ To amplify DNA (300bp) in s gene region
+ To sequence PCR product (DNA-300bp)
+ To analyze mutations on s gene
+ To determine the characters of these mutations circulating in VN
To compare mutations from VN with others in the world
6. Main results:
6.1. Results in science and technology
6.1.1. HBVsamples collection
A total of 25 HBV samples collected from screening patients infected HBV
from Center of Hematology and Blood transfusion, Hanoi. HBV-DNA
samples were extracted from serum or peripheral blood for PCR
amplification.
6.1.2. DNA-HB Vamplification
After 35 cycles of PCR reaction, the PCR product (DNA- HBV) fragments
with the size 300 bp was obtained.
6.1.3. HBV-DNA sequencing
The purified DNA were sequencing for mutations analysis
6.1.4. Sequencing analysis
There were ten mutations were found. These mutations could be divided into
three groups. Group 1 consisted of mutations typical only for samples from
Vietnam and they included: the point mutation at nucleotide position 876
with a G to c substitution, the mutation at nucleotide 1116 with a G to an A
substitution, and another point mutation at nucleotide 1130 with a c to G

- 01 Ph.D in Cell Biology : Tran Thu Ha will be completed Ph.D study in
2013
7. Budget justification
- Total of financial support: 100.000.000 VND
- Planned budget: 2009: 50.000.000 VND., 2010: 50.000.000 VND
6
I
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU

i
CHƯƠNG I : TỎNG QUAN TÀI LIỆU 2
1.1. Virut viêm gan

^
1. ỉ. 1 Cấu trúc genom và các protein của HBV.
2
ỉ. 1.2.Chu trình nhân lên của HBV
4
1.1.3. Các marker chẩn đoán viêm gan B

5
1.2 Đột biến ở virut viêm gan B
6
1.3. Tình hình nhiễm HBV trên thế giới 7
1.4. Tình hình nhiễm HBV tại Việt Nam 8
CHƯƠNG 2. ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

9
2.1. Đối tượng nghiên cứu

2
Hình 2
Ảnh điện di sản phấm PCR
11
Hình 3
Kết quả giải trình tự
13-14
DANH MỤC BẢNG
SỐTT
1
rn«A J A I 7
Tiêu đê bảng
Trang
Bảng 1
Tỷ lệ HBsAg dương tính tại 1 số nước lưu hành
HBVthap
7
Bảng 2
Tỷ lệ HBsAg dương tính tại 1 số nước lưu hành
HBV trung bình
8
Bảng 3
Tỷ lệ HBsAg dương tính tại 1 số nước lưu hành
HBV cao
8
Bảng 4
Tỷ lệ nhiêm HBV qua nghiên cứu của một số tác
giả trong nước
8
Bảng 5

- ADN vòng đóng tương đương •
(convalently closed circular DNA)
- Kháng nguyên lõi của virút viêm gan B
(Hepatitis B core Antigen)
- Gen bề mặt
(surface gen)
- Kháng nguyên e của vữút viêm gan B
(Hepatitis B e Antigen)
- Kháng nguyên bề mặt của virút viêm gan B
(Hepatitis B swface Antigen)
- Virút viêm gan B
(Hepatitis B virus)
- Đơn vị quốc tế
(International unit)
- Prôtein bề mặt của virút viêm gan B loại lớn
(Large Hepatitis B surface Protein)
MHBs - Prôtein bể mặt của virút viêm gan B loại trung bình
(Medium Hepatitis B surface Protein)
PCR - Phản ứng chuỗi polymeraza
(Polymerase Chain Reaction)
Pre-Si - Gen hoặc prôtein tiền SI
Pre-S2 - Gen hoặc prôtein tiền S2
SHBs - Prôtein bề mặt cùa virút viêm gan B loại nhỏ
(Small Hepatitis B surface Protein)
VGB - Viêm gan B
MỞ ĐẦU
Việt nam là một nước có tỷ lệ nhiễm virut viêm gan B cao, vói tỷ lệ mang
kháng nguyên bề mặt của virut viêm gan B (HBsAg) 10-25%. HBsAg mang
các thụ thể trung hòa chủ yếu của virut viêm gan B và được sử dụng làm
thành phần chính của vaccine viêm gan B hiện nay. Bệnh này đã trở thành

CHƯƠNG l.TỎNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Virus viêm gan B
Năm 1885, Lurman đã thông báo 191 trường hợp viêm gan sau khi tiêm
chủng vaccine đậu mùa. Năm 1963, Blumberg đã nhận xét bệnh viêm gan B có
tích chất vùng địa lý. Năm 1970, nhà bác học Dane và cộng sự đã phân lập được
virus viêm gan B hoàn chinh gọi là thể Dane . Những năm tiếp theo các dấu ấn
miễn dịch khác của virus viêm gan B như kháng thể HBs, HBeAg, kháng thể HBc,
kháng thể HBe, HBcAg lần lượt được phát hiện [10].
ỉ. 1.1. Cẩu trúc genom và các protein của HBV
Virus viêm gan B (thể Dane) có đường kính từ 40 - 42 nm, là virus thuộc
nhóm có nhân DNA, họ Hepanaviridae. cấu trúc của virus gồm các thành phần cơ
bản sau:
- Phần vỏ: Gồm 2 lớp lipoprotein và các protein màng
Hình 1. Cấu trúc virut viêm gan B
- Phân nhân: Bao gôm các protein được mã hồa bời các gen c (Core), lóp
này mang đặc trưng của kháng nguyên HBc.
- Genome của virus HBV
Partially double-stranded DNA
2
Genom của vừut HBV chỉ có 3.200 cặp bazơ, được tổ chức đặc biệt dưới
dạng vòng mờ dạng sợi kép không hoàn toàn gồm 2 sợi có kích thước khác nhau
(hình). Sợi nằm bên ngoài là sợi âm mã hóa cho toàn bộ thông tin di truyền của
HBV. Genome của HBV chứa các gen mã hóa gối nhau (chồng lớp) gồm 4 khung
đọc mờ s, c, p và X. Các gen s (surface) mã hóa cho kháng nguyên bề mặt
HBsAg bao gồm 3 phần: Tiền SI hay pre Sl, tiền S2 hay Pre S2 và s. Vùng s và
tiền S2 có chiều dài thay đổi tùy theo typ của virut. Các gen s mã hóa cho 3 loại
protein khác nhau là s, M và L [10J.
+ Protein s (small) là protein nhỏ nhất (24kD) trong số các protein bề mặt,
chứa 226 axit amin. Đây là protein chính hay còn gọi là SHBsAg được mã hóa bởi
gen s và được sản xuất với số lượng lớn. Các typ của virut được xác định dựa vào

năng khác nhau như tham gia vào viêc truyè tín hiêu, điều hòa chu trình tế bào.
1.1.2.Chu frinh nhân lên của HBV
Trước hết virut HBV gắn đặc hiệu vào thụ thể nằm trên mặt tế bào
gan. Sau khi cởi bỏ vỏ ngoài, nucleocapsit di chuyển vào vùng nhân. Sau khi
cời vỏ capsit, ADN kép với 2 sợi không bằng nhau được chui vào nhân để
chuyển hóa thành dạng ADN kép khép vòng, siêu xoắn(cccADN). Dạng
này được dùng làm khuôn để tổng hợp 4 loại ARN 3,5; 2,4; 2,1 và 0,7kb.
Các mARN được gắn đuôi và di chuyển ra tế bào chất.
mARN 3,5kb gọi là ARN tiền genom dùng để tổng họp genom. Các
mARN còn lại được gọi là dưới genom dùng để tổng hợp các protein khác
nhau trong đó có ADN- polimeraza(P), protein lõi c và tiền c, popypeptit X,
protein bề mặt s và proteinkinaza. Protein lõi c tạo thành nucleocapsit
(HBcAg). Polypeptit tiền lõi được vận chuyể đến MLNC, từ đó chúng được
tiết ra ngoài dưới dạng KN tiền lõi (HBeAg). ARN tiền genom được đóng
gói cùng với ADN-polymeraza của virut và protein kinaza để thành hạt lõi.
ở đây tiền genom được dùng làm khuôn để tổng hợp các chuỗi ADN(-)sợi L
theo cơ chế sao chép ngược [10].
Polymeraza của HBV phân giải ARN tiền genom, chỉ để lại 1 đoạn
ngắn dùng làm mồi cho tổng hợp ADN (+) trên khuôn của ADN (-). Một số
genom trưởng thành sau khi được tổng hợp lại quay về nhân để chuyển
thành cccADN nhằm duy trì một lượng khuôn ổn định cho dịch mã, còn
4
i
phần lớn được lắp ráp hoàn chinh rồi nảy chồi ra ngoài để lặp lại chu kỳ
nhân lên ở tế bào gan khác. Trong quá trinh nhân lên, virut luôn tổng hợp
thừa protein vỏ nên trong huyết thanh người bị nhiễm HBV, ngoài virut
hoàn chỉnh (hạt Dane) còn xuất hiện các dạng không hoàn chỉnh hình cầu
hoặc hình que.
1.1.3. Các Marker chẩn đoán HBV
Thời kỳ ủ bệnh của nhiễm HBV thay đổi tùy thuộc vào từng bệnh nhân,

vaccine cao hơn so với các trường hợp không tiêm phòng vaccine. Một lần nữa,
vấn đề này lại hạn chế sự thành công của các chương trình tiêm phòng mờ rộng.
Tuy vậy đột biến trên gen s còn chưa được nghiên cứu chi tiết, vì vậy tầm
quan trọng của đột biến virut viêm gan B đối với sức khỏe cộng đồng đang là một
vấn đề gây nhiều tranh cãi. Những nghiên cứu và quan sát sâu hom về các điểm nổi
bật của loại virut này là yếu tố cốt lõi để đánh giá chính xác hiệu quả của các chiến
lược chủng ngừa bệnh viêm gan B hiện nay [7,9].
1.3. Tìuh hình nhiễm HBV trên thế giới
Theo ước tính của tổ chức Y tế thế giới, hiện có tới 5-6% dân số toàn thể
giới mang virus viêm gan B (khoảng 400 triệu người), phần lớn số người nhiễm
HBV này thuộc các nước đang phát triển. Dựa vào tỷ lệ HBsAg dương tính và
kháng thể HBs dương tính trong cộng đồng mà tổ chức Y tế thế giới đã chia thành
ba khu vực lưu hành HBV như sau [5,10,6].
+ Khu vực lưu hành HBV thấp: Tỷ lệ HBsAg dương tính: 0,1 - 0,5%,
kháng thể HBs dương tính: 4 - 6% (bảng 1)
Bảng 1. Tỷ lệ HBsAg dương tính tại một số nước lưu hành HBV thấp
Khu vực
Tên nước
Tỷ lệ %
Châu Âu
- Tây Âu, Bắc Âu
<0,1-0,5
Châu Mỹ
- Nam Mỷ, Caribe
0,1-1,6
Châu Úc
- Úc, New Zealand
0,1%
+ Khu vựa lưu hành HBV trung bình: Tỷ ỉệ HBsAg dương tính: 2-7%,
kháng thể HBs dương tính: 20-55% (bảng 2).

vaccine không những được phát hiện ở vùng quyết định KN mà còn thấy xuất hiện
6
ở vùng ngoài của quyết định kháng nguyên này. Những NC về huyết thanh học ờ
trẻ em Thái Lan có ADN- HBV dương tính, tỷ lệ các trường hợp mang đột biến
trên vùng quyết định kháng nguyên (QĐKN) ‘a’ năm 1984 là 7,8% , năm 1989 là
19,6%, năm 1994 tăng cao là 28,1%. Điều dáng lưu ý là tỷ lệ các trường hợp xuất
hiện đột biến trong vùng QĐKN “a” của HBsAg ở các trường hợp đã tiêm phòng
vaccine cao hơn so với các trường hợp không tiêm phòng vaccine. Một lần nữa,
vấn đề này lại hạn chế sự thành công của các chương trình tiêm phòng mờ rộng.
Tuy vậy đột biến trên gen s còn chưa được nghiên cứu chi tiết, vì vậy tầm
quan trọng của đột biến virut viêm gan B đối với sức khỏe cộng đồng đang là một
vẩn đề gây nhiều tranh cãi. Những nghiên cứu và quan sát sâu hơn về các điểm nổi
bật của loại virut này là yếu tố cốt lõi để đánh giá chính xác hiệu quả của các chiến
lược chủng ngừa bệnh viêm gan B hiện nay [7,9],
1.3. Tình hình nhiễm HBV trên thế giới
Theo ước tính của tổ chức Y tế thế giới, hiện có tới 5-6% dân số toàn thế
giới mang virus viêm gan B (khoảng 400 triệu người), phần lớn số người nhiễm
HBV này thuộc các nước đang phát triển. Dựa vào tỷ lệ HBsAg dương tính và
kháng thể HBs dương tính ừong cộng đồng mà tổ chức Y tế thế giới đã chia thành
ba khu vực lưu hành HBV như sau [5,10,6].
+ Khu vực lưu hành HBV thấp: Tỳ lệ HBsAg dương tính: 0,1 - 0,5%,
kháng thể HBs dương tính: 4-6% (bảng 1)
Bảng 1. Tỷ lệ HBsAg dương tính tại một số nước lưu hành HBV thấp
Khu vực
Tên nước
Tỷ lệ %
Châu Âu
- Tây Âu, Bắc Âu
<0,1-0,5
Châu Mỹ

Theo thông báo của Tổ chức Y tế thế giới mỗi năm có khoảng 2 triệu người
chết liên quan đến viêm gan B, 70% - 80% các trường hợp ung thư gan là do viêm
gan virus B, 25% người mang mạn HBV chết vì xơ gan và ung thư gan. Những
người nhiễm HBV thỉ có nguy cơ bị ung thư gan gấp 100 lần so với những người
không bị nhiễm HBV.
1.4. Tình hình nhiễm HBV tại Việt Nam
Việt Nam nằm trong vùng lưu hành HBV cao, tỷ lệ viêm gan B trong quần
thể từ 10-15% và có những vùng trên 20%. Bảng 1-6 dưới đây cho biết tỷ lệ
HBsAg dương tính trong quần thể người khỏe mạnh qua nghỉên cứu của một số
tác giả [2,3].
Bảng 4. Tỷ lệ nhiễm HBsAg qua nghiên cứu của một số tác giả trong nước
Tên tác già, năm nghiên cứu, đối tượng
Tỷ lệ %
Vũ Triệu An (quần thể) - 1987
15
Ngô Quang Lực, Đỗ Trung Phẩn (Quần thể) - 1995
16,5
ề
8
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ử u
2.1. Đổỉ tượng nghiên cứu
Tổng số 25 mẫu bệnh phẩm đã được chẩn đoán nhiễm virut viêm gan B
bằng huyết thanh học HBsAg theo nguyên lý miễn dịch gắn men (ELISA)
thu nhận từ Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương phục vụ cho nghiên
cứu này.
2.2. Vật liệu và thiết bị NC:
Các hóa chất, sinh phẩm và trang thiết bị được sử dụng tại phòng Sinh
học phân tử, Khoa Sinh học Trượng ĐHKHTN.
- Bộ sinh phẩm tách chiết AND (DNA mini kit) QIAamp
DNA(QIAGEN)

đệm thôi gen. Các bước tiến hành theo chỉ dân của nhà sàn xuất:
- Cho 20ịi\ dung dịch proteinase K vào tube 15 mi
- Thêm vào tube 200 JJ.1 mẫu huyết thanh trộn đều
- Thêm 200 Jil dung dịch dệm ly giải (AL) trộn kỹ trong 15 giây sau đó
- ly tâm nhanh và ủ 56 ° c (10 phút)
- Sau khi ủ, ly tâm nhanh, cho thêm 200 [li ethanol vào trộn đều
- Cho toàn bộ hỗn dịch trong tube vào cột ly tâm QIA amp và ly tâm
8000vòng/phút trong 1 phút
- Cho tiếp vào cột 500 ịil đung dịch đệm rửa (AW1) đã có ethanol, ly
tâm 14.000 vòng phút trong 3 phút
- Thêm 60 fil nước cất vô trùng hoặc dung dịch (AE) vào cột và ủ ở
nhiệt độ phòng trong 1 phút sau đó ly tâm 8000 vòng phút trong 1 phút.
Lúc này ADN đã được tách chiết và sử dụng cho phản ứng PCR
2.2.2. Phương pháp quang phổ kế (đo OD)
Đe xác đinh nồng độ và độ sạch của ADN tổng số tách chiết được chúng
tôi dùng phương pháp quang phổ kế. Nguyên tắc của phương pháp này
là dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sang tử ngoại ở bước sóng 260nm của
các bazơ purin và Pyrimidin, đồng thời cũng kiểm ừa độ sạch của dung
địch ở bước sóng 280nm. Các bước tiến hành như sau:
1. Pha loãng đung dịch ADN thu được trong nước siêu sạch
2. Chuyển dung dịch ADN đã pha loãng sang ống thạch anh nhỏ của
máy quang phổ kế và đo ở bước sóng 260nm-280nm
3. Nồng độ ADN của mẫu đo sẽ được tính theo công thức:
C adn = A 260 X 5 0 X d
Trong đó: CADN là nồng độ ADN tính bằng ịig/nrtl
A260 là chỉ số hấp thụ ánh sáng ở bức sóng 260 ran
d là độ pha loãng của mẫu cần đo
Sau đỏ xác định độ sạch của mẫu bằng tỷ số A260/A280. Khi tỉ số A260/A280
năm ữ o n g khoảng 1,8 - 2,0 A D N tách chiết được đạt tiêu chuẩn (xem
phần phụ lục 1)

2.2.4. Giải trình tự vùng gen s dài 300 bp, phát hiện đột biến.
Chọn các mẫu ADN(HBV) có các băng gọn, sáng cho tinh sạch trước khi
giải trình tự (các bước tinh sạch ADN( phụ lục 2)
Chúng tôi sử dụng bộ kit sinh phẩm và máy của hãng Applied BIO (USA).
Phản ứng giải trình tự nucleotide dựa trên phương pháp kết thúc chuỗi
dideoxy sử dụng Big Dỵe terminator(các bước tiến hành xem phần phụ lục
3). Kêt quả được xử lý bằng phần mềm sequencing nalysis MEGA 4.0
11
I
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Phát hiện và khuếch đại ADN (HBV) bằng PCR
Sau khi tách chiết, ADN được xác định nồng độ và độ sạch bằng phương
pháp quang phổ kế. Chúng tôi chon những mẫu ADN có kết quà đo OD nằm
trong khoảng 1,8-2,0 là những mâu đạt tiêu chuẩn và sử dụng như ADN
template cho phản ứng PCR. Đoạn gen có kích thước 300 bp thuộc gen s
(chứa vùng quyết định kháng nguyên “a” được khuếch đại sau 35 chu kỳ
phản ứng (hình 2).
1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10
Hình 2. Ảnh điện di sản phẩm PCR
M: Thang ADN chuẩn (lOObp)
Giếng 1,2,4,5,6,7,9,10: ADN (HBV)
Sản phẩm PCR sau khi thu lại từ gel agarose qua kiểm tra độ tinh sạch
sẽ được sử dụng làm khuôn giải trình tự. Qua phân tích trình tự một số các
đột biến đã được phát hiện. Dưới đây là bảng so sánh trình tự ADN các mẫu
HBV Việt Nam với trình tự của một số mẫu từ ngân hàng gen:
12
3.2. Phân tích trình tự đoạn ADN thuộc gen s của HBV
Mẫu số 1 chủng kiểu dại (từ ngân hàng gen)
Mẫu từ số 2 đến số 18 từ ngân hàng gen
Mẫu số 19,20,21,22 của Việt Nam