Bộ giáo dục v đo tạo bộ y tế

trờng đại học Y h nội nguyễn thị vân anh
Nghiên cứu gen PreS, gen X
của virut viêm gan B trong mô, huyết thanh
v một số dấu ấn huyết thanh ở bệnh nhân
ung th biểu mô tế bo gan
Chuyên ngành: Miễn dịch học
Mã số: 62.72.04.20

tóm tắt luận án tiến sỹ y học Các công trình đ công bố có liên quan đến luận án 1. Nguyễn Thị Vân Anh và cs (2006), Bớc đầu nghiên cứu một số
đặc điểm của HBV- DNA trong mô ung th gan bằng PCR, Y hc Vit
Nam, (322), tr. 25-30.
2. Nguyễn Thị Vân Anh và cs (2007), Hoàn chỉnh kỹ thuật tách ADN
từ mô ung th gan và phản ứng PCR xác định HBV, Y hc thc hnh s
3, tr. 20-22.
3. Nguyễn Thị Vân Anh và cs (2007), Nhn xột mt s du n ca
virut viờm gan B trong huyt thanh bnh nhõn ung th gan,Y hc Vit
Nam,(332), tr. 47-52.
4. Nguyễn Thị Vân Anh và cs (2008). Nghiên cứu tính đa hình thái
vùng gen X của HBV trên bệnh nhân ung th biểu mô tế bào gan bằng kỹ
thuật cloning, Tạp chí Y học Việt Nam, (350), tr. 14-21.
5. Nguyễn Thị Vân Anh và cs (2008), Trình tự gen của HBV thuộc 2
kiểu gen B và C trên 2 bệnh nhân ở Việt Nam, Tạp chí Y học Việt Nam,
(351), tr.16-23.

sản phẩm protein đợc mã hoá từ vùng gen này gây rối loạn phân bào, ức
chế apoptosis, ức chế sửa chữa ADN. Gen PreS2 mã hoá cho MHBs có
liên quan tới cơ chế tăng phân bào do kích thích liên tục tín hiệu c-raf-
1/Erk2. Đột biến ở hai vùng gen này, thờng thấy các đột biến mất đoạn
làm tăng nguy cơ HCC đã đợc chứng minh.
Một số nghiên cứu trờn th
gii cho thấy HBV có tính biến đổi cao,
thậm chí có sự khác nhau giữa mô và huyết thanh. Nghiên cứu đặc điểm
của vùng gen X, gen PreS mụ v huyt thanh nhm tỡm hiu s thay i
ca HBV bnh nhõn nhiễm HBV mạn tính, bnh nhõn ung th biu mụ
t bo gan Vit Nam cho tới nay cha c tỏc gi no cp n. Vì
vậy nghiên cứu đợc tiến hành nhằm mục tiêu:

1. Nghiên cứu tỷ lệ ADN- HBV(+), trình tự nucleotid vùng gen PreS, X trong
huyết thanh và mô ung th ở bệnh nhân ung th biểu mô tế bào gan.
2. Phát hiện một số đột biến vùng gen PreS, X ở bệnh nhân ung th biểu
mô tế bào gan.
3. Xác định tỷ lệ phân bố giữa kiểu gen của HBV với một số dấu ấn huyết
thanh bệnh nhân ung th biểu mô tế bào gan.

2

ý nghĩa khoa học v thực tiễn của luận án

1. ý nghĩa thực tiễn:
1.1. ứng dụng đợc một số kỹ thuật về sinh học phân tử: tách chiết ADN từ
mô, huyết thanh, kỹ thuật Nested- PCR, cloning, giải trình tự gen để
phục vụ cho các nghiên cứu về sinh học phân tử.
1.2. Nghiên cứu và đánh giá đợc khá đầy đủ về đặc điểm hai vùng gen X,
gen preS của HBV, làm cơ sở dữ liệu cho các nghiên cứu về HBV tại
3

Chơng 1 :

Tổng quan ti liệu

1.1.Tình hình nhiễm HBV và các biến chứng thờng gặp:
Nhiễm HBV có thể gặp ở hầu hết các quốc gia trên thế giới, tỷ lệ nhiễm
tùy thuộc vào chủng tộc và vùng địa lý. Trên thế giới có khoảng 2 triệu
ngời bị phơi nhiễm với HBV, khoảng 400 triệu ngời mang HBV mạn tính
và 50 triệu trờng hợp đợc chẩn đoán mới mỗi năm. Nhiễm HBV hiện nay
vẫn là nguyên nhân chính gây nên các biến chứng xơ gan và ung th gan
của một số nớc nằm trong vùng dịch tễ lu hành HBV cao, đặc biệt là ở
các nớc vùng Châu á. Nguy cơ hàng năm của HCC là 0,4%-0,6% trên
bệnh nhân nhiễm HBV không có xơ gan, 2% trên bệnh nhân nhiễm HBV
có xơ gan.
Việt Nam nằm trong vùng dịch tễ lu hành HBV cao trên thế giới, tỷ lệ
nhiễm HBV trong cộng đồng cao, chiếm từ 15-20%. Trên 70% ngời mắc
ung th gan có HBsAg(+). Biến chứng viêm gan cấp, viêm gan mạn, xơ gan,
ung th gan đều có thể gặp trên các đối tợng nhiễm HBV ở Việt Nam.

1.2. Cấu trúc HBV và chức năng các kháng nguyên:
HBV thuộc nhóm Hepadnavirus cấu trúc lõi là ADN, có ái tính đặc biệt
với tế bào gan. Các kháng nguyên: HBsAg, HBeAg, HBcAg, Polymerase,
HBxAg đợc mã hoá từ 4 khung đọc mở quan trọng trong cấu trúc gen của
HBV là: PreS1/PreS2/S; PreC/C; Polymerase và gen X. Ngoài ra, còn có 2
vùng gen tăng cờng có thể đóng vai trò quan trọng trong sao chép virut:
vùng EnhI, EnhII và các vùng gen khởi động promoter kích thích mã hoá

khu vực địa lý, có thể khác nhau về kích thớc, vị trí các khung đọc mở. Các
kiểu gen khác nhau có ý nghĩa khác nhau trong tiên lợng bệnh trên lâm sàng.

1.3.Diễn biễn một số dấu ấn trong huyết thanh khi nhiễm HBV:
1.3.1.Diễn biến các dấu ấn trong viêm gan B cấp:
Giai đoạn đầu trong huyết thanh xuất hiện đồng thời cả 3 dấu ấn của
HBV: HBsAg(+), HBeAg(+) và ADN-HBV. Nếu bệnh nhân hồi phục thì
các kháng nguyên sẽ mất trong vòng 6 tháng, sau đó là các kháng thể xuất
hiện. Đặc biệt IgM HBc xuất hiện sớm và giảm đi sau giai đoạn viêm cấp
vì vậy việc chẩn đoán xác định nhiễm viêm gan B cấp thờng dựa trên sự
có mặt của kháng thể này. Kháng thể (IgG HBc và IgG HBs) xuất hiện
muộn hơn nhng còn tồn tại kéo dài sau nhiều năm và các kháng thể này
đợc sử dụng để xác định quá trình phơi nhiễm của viêm gan B.
1.3.2.Diễn biến các dấu ấn huyết thanh trong viêm gan B mạn tính
Nhiễm HBV mạn tính, gặp chủ yếu do truyền dọc từ mẹ sang con ở
thời kỳ bào thai hoặc ở giai đoạn nhiễm chu sinh. Các triệu chứng lâm
sàng hầu nh không có gì thay đổi, trẻ hoàn toàn bình thờng cho tới tuổi
trởng thành nếu nh không đợc xét nghiệm máu sẽ không biết đã bị
nhiễm HBV. Nồng độ HBsAg, ADN-HBV thờng khá cao và tồn tại trong
nhiều năm, tỷ lệ trẻ mất HBsAg là rất hiếm. 15-40% sô ngời mang
HBsAg mạn tính có biến chứng viêm gan mạn, xơ gan ,ung th
gan.

1.4.Cơ chế tổn thơng mô bệnh học ở gan khi nhiễm HBV
Cơ thể nhiễm HBV sẽ loại thải virut bằng cả hệ thống đáp ứng miễn
dịch tự nhiên và đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Hoạt động của các yếu tố

5
miễn dịch, các tế bào miễn dịch, các cytokin sẽ kích thích quá trình viêm
trong gan làm cho nguy cơ huỷ hoại tế bào gan tăng lên. Tuỳ thuộc mức

có thể gặp ở vùng gen X trên bệnh nhân HCC nh cắt đoạn, đảo đoạn,
chuyển đoạn, thêm đoạn. Đột biến điểm ở vị trí A1762T/G1764A của
vùng gen X đợc thấy xuất hiện trớc khi phát triển HCC.
Tích hợp gen của HBV vào ADN của tế bào chủ làm hoạt động gen
của tế bào chủ bị rối loạn, đặc biệt ở những gen quan trọng cho tăng
trởng và biệt hoá tế bào gan, hoặc tăng cờng biểu lộ các protein tham
gia vào quá trình phân bào và ức chế apoptosis. Mặt khác, tích hợp gen
cũng làm tăng cờng biểu lộ gen và đột biến gen của HBV, đặc biệt
thờng thấy ở vùng PreS, X của HBV hơn các vùng gen khác ở các bệnh
nhân HCC. Các protein thay đổi chức năng đợc sản xuất từ các vùng gen
bị đột biến cũng làm tăng nguy cơ HCC.

6

HBx là một protein điều hòa đa chức năng,
tác động trực tiếp hoặc gián
tiếp vào nhiều chức năng của tế bào vật chủ nh: điều khiển các tín hiệu
chuyển dạng làm tăng sinh tế bào, kích thích khởi động mạng lới cytokin
gây viêm cấp và mạn tính, làm thay đổi chức năng bảo vệ tự nhiên của các tế
bào, có thể tham gia tác động vào hầu hết các cơ chế hình thành HCC:


con
đờng tín
hiệu
Điều hoà
chu kỳ tế
bào
Điều hoà
apoptosis
Điều hoà
tạo mạch
máu
ức chế
sửa chữa
lỗi ADN

Điều hoà
chức
năng
telomere
Cân bằng
liên kết t
ế

bào

7
Chơng 2

Đối tợng v phơng pháp nghiên cứu


Nhóm ung th gan (n = 35) gồm:
- 13 mẫu mô gan lấy sau phẫu thuật cắt ung th gan tại Bệnh viện Việt Đức.
- 22 mẫu mô lấy từ chọc hút tế bào gan tại Bệnh viện TWQĐ -108.
Nested PCR vùng gen X, Pre
S
Trình tự Nu, acid amin, đột biến

8
Nhóm chứng (n=32) gồm:
- Các đối tợng HBsAg(+) đợc lấy từ Bệnh viện E và Bộ môn Miễn
dịch- Sinh lý bệnh, Đại học Y Hà Nội.
2.2.3. Địa điểm tiến hành nghiên cứu:
- Bộ môn Miễn dịch- Sinh lý bệnh Trờng Đại học Y Hà Nội
- Dep.Viral infection and International Health Trờng Đại học Y
Kanazawa Nhật Bản.
2.2.4. Các kỹ thuật nghiên cứu:
2.2.4.1.Kỹ thuật tách ADN:
Kỹ thuật tách ADN huyết thanh: Sinh phẩm của Qiagen
Kỹ thuật tách ADN mô gan: Bộ sinh phẩm của Promega Mỹ
2.2.4.2.Kỹ thuật ELISA: xét nghiệm xác định các dấu ấn của HBV trong
huyết thanh sử dụng sinh phẩm Phamatech
2.2.4.3.Kỹ thuật Nested-PCR: sinh phẩm Invitrogen- Nhật Bản
Mồi vùng gen PreS dựa trên thiết kế nghiên cứu của Stuyver L và mồi
vùng gen X dựa trên thiết kế nghiên cứu của Wang Y
2.2.4.4. Kỹ thuật giải trình tự trực tiếp: Big Dye Terminator sử dụng sinh
phẩm của hãng Applied Biosystems- Mỹ
2.2.4.5. Kỹ thuật cloning: sinh phẩm Invitrogen- Nhật
2.3.Các biến số nghiên cứu:
- Các chỉ số đánh giá chung: Tuổi, Giới
- Các chỉ số về dấu ấn của HBV mang ý nghĩa tiên lợng :HBeAg, anti HBe

(-) 35 (100%) 33 (94,3%) 12 (34,3%) 0 (0%)
Tổng 35 (100%)
Nhận xét:
Tỷ lệ HBeAg(+) chiếm 5,7%, tỷ lệ xuất hiện antiHBe(+) là 65,7%. Số
bệnh nhân antiHBe (-) là 34,3%. 100% bệnh nhân HBsAg(+) có antiHBs(-).

Nhận xét:
Trong nhóm tuổi từ 40-60 có 2 bệnh nhân HCC HBeAg(+) và 11 bệnh
nhân cha xuất hiện antiHBe. Số bệnh nhân cha có antiHBe là những
bệnh nhân cha có chuyển đảo huyết thanh.
0
2
0
4
24
5
3

15
5
1

11
0
0

5

11
(31,4%)
(-) 6
(17,1%)
6
(17,1%)
5
(14,3%)
7
(20,0%)
5
(14,3%)
7
(20,0%)
Tổng 14
(40,0%)
21
(60,0%)
15
(42,9%)
20
(57,1%)
17
(48,6%)
18
(51,4%)
Giá trị p p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05
Nhận xét:
Không có sự khác biệt giữa AFP, AST, ALT với antiHBe (p > 0,05).
Đánh giá các chỉ tiêu nhóm HCC và nhóm chứng:

400
300
200
100
400b
p

11
Nhận xét:
Có sự khác nhau về kết quả nested-PCR giữa mô và huyết thanh. Tỷ lệ
dơng tính gen vùng PreS của HBV trong huyết thanh bệnh nhân HCC
chiếm 94,3%, tại mô gan chiếm 57,1%.
3.2.1.2. Kết quả sản phẩm Nested-PCR vùng gen từ 1286 -1948:
M 9 11 18 19 20 21 22 50 52 53 5456 19M50M52M54M

Nhận xét:
Có nhiều băng sản phẩm ở cùng một mẫu bệnh phẩm. Sản phẩm có
vị trí, kích thớc là 663bp đợc xác định là ADN-HBV(+). Các vị trí băng
khác xuất hiện kèm theo đợc đánh giá là dơng tính và có đoạn ADN
phân ly.
Bảng 3.6: Kết quả Nested- PCR gen X ở mô và HT bệnh nhân HCC:
Huyết thanh Mô
Kết quả
phản ứng


12

Bảng 3.7: Nhận xét số vị trí Nu và aa khác nhau giữa mô và huyết thanh
của 9 bệnh nhân HCC
Ký hiệu mẫu nghiên cứu
Số vị trí
thay đổi
5 69 80 86 87 97 64 88 91
Trình tự Nu 12 1 2 0 2 1 9 3 11
Trình tự aa 5 1 1 0 1 0 2 2 8
Nhận xét:
Các mẫu bệnh nhân đợc sắp xếp theo cặp huyết thanh và mô. So sánh
trình tự nu, trình tự acid amin vùng gen preS giữa mô gan và huyết thanh
nhóm HCC, cho thấy tỷ lệ khác nhau về Nu giữa hai kiểu gen là 41/312
(13,2%), số vị trí Nu thay đổi giữa mô và huyết thanh ở mẫu nhiều nhất là 12
vị trí và 8 vị trí thay đổi của acid amin.

Phát hiện các đột biến gen X của HBV ở mô và HT bằng kỹ thuật cloning:

Kết quả sàng lọc PCR sau cloning một số mẫu có phân ly xùng gen X:
Hình 3.3 và 3.4: Sản phẩm điện di trên thạch các clon mẫu số 18 ở HT và mô

Hình 3.5: Sản phẩm điện di các clon mẫu số 80HCC huyết thanh và mô
Hình 3.7: Hình ảnh điện di các clon của mẫu 22HCC ở mô và huyết thanh
Nhận xét:
Các kết quả gen X trên hình ảnh điện di khi sàng lọc PCR bằng mồi
X1 và CR2 đợc tách dòng với các dạng khác nhau. Ký hiệu trên các sản
phẩm là kích thớc đợc xác định sau khi đã đợc giải trình tự.
Bảng 3.8: Một số đặc điểm của các clon khác nhau phát hiện ở vùng gen X
trong 8 cặp mẫu mô - huyết thanh bệnh nhân HCC:
Kích thớc gen Kiểu gen Đặc điểm giải trình tự gen
Số mẫu
Mô HT Mô HT Mô HT
10HCC 663, 663 C C X X
12HCC 663,592 663 C C X,X xoá đoạn X
18HCC 663,355 663,428 B, B X, X/gen ngời/PreC X,Xxoá đoạn
22HCC 685,768 663 B B X chèn đoạn X
62HCC 663 663, B B X X
64HCC 663,508 663,438 C C X,X xoá đoạn X,Xxoá đoạn
69HCC 663 663 B B X X
80HCC 663,621 663,438 B B X,X xoá đoạn X,Xxoá đoạn
Nhận xét:
663b
p

438b
p

Tóm tắt các sơ đồ giải trình tự gen (sơ đồ: 3.3; 3.4; 3.5; 3.6; 3.7; 3.8; 3.9)

3.3. Kết quả kiểu gen, một số đột biến của HBV nhóm HCC và nhóm
chứng:
Kiểu gen và phân bố kiểu gen ở nhóm HCC và nhóm chứng:
Bảng 3.9: Tỷ lệ kiểu gen trong HT giữa nhóm HCC và nhóm chứng:
Nhóm HCC (n=35) Nhóm chứng (n=32)
Kết quả
B C KXĐ B C KXĐ
Số BN 22 11 2 22 8 2
Tỷ lệ 62,9% 31,4% 5,7% 68,8% 25,0% 6,2%
Giá trị p>0,05
Nhận xét:
1286 1506 1948
Xoá đo
ạ
n
41b
p
151b
p
224b

Không thấy có sự khác
biệt về kiểu gen đợc phân bố giữa 2 nhóm (p > 0,05). Số mẫu không xác
định (KXĐ) đợc kiểu gen do không có sản phẩm PCR.
Kết quả so sánh đặc điểm Nu, acid amin vùng gen Surface promoter
2 (3021-3180) ở nhóm HCC và nhóm chứng:
Trong 21/22 mẫu HCC, 21/22 mẫu chứng thuộc kiểu gen B và 8 mẫu
chứng, 11 mẫu bệnh nhân HCC thuộc kiểu gen C đợc giải trình tự
vùng gen
từ vị trí 3021-3180. Kết quả cho thấy các điểm Nu khác nhau giữa các mẫu
phân bố rải rác trong nhóm HCC và nhóm chứng. Không tìm thấy đột biến
có liên quan giữa nhóm HCC và nhóm chứng trong đoạn gen đợc so sánh .

Kết quả đánh giá vùng tăng cờng EnhII (vị trí từ 1636- 1774)
Bảng 3.10: Kết quả Nested- PCR gen X trong HT nhóm HCC và nhóm chứng
Nhóm HCC Nhóm Chứng
Kết quả
phản ứng
Số BN Tỷ lệ Số BN Tỷ lệ

Giá trị
ADN-HBV (+) 8 22,9% 15 46,9%
ADN-HBV(+) phân ly 13 37,1% 7 21,9%
p < 0,05
ADN-HBV(-) 14 40% 10 31,2%
Tổng s
ố
35 100% 32 100%

Nhận xét:
Tỷ lệ có ADN-HBV(+) không phân ly chiếm 22,9% ở nhóm HCC và

Bảng 3.13: So sánh đột biến G1896A ở hai kiểu gen B và C
Kết quả Kiểu gen B Kiểu gen C Giá trị
G1896A 11(68,8%) 0
Không đột biến 5 (31,2%) 11(100%)
Tổng số 16 (100%) 11 (100%)
p <0,001
Nhận xét:
Kiểu gen B đột biến nhiều hơn kiểu gen C, sự khác biệt có ý nghĩa
thống kê với p<0,001.
3.4. Kết quả so sánh kiểu gen với một số dấu ấn:
Bảng 3.14: Kết quả so sánh kiểu gen với HBeAg và antiHBe
Nhóm HCC Nhóm chứng
HBeAg antiHBe HBeAg antiHBe

Kết quả
(+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-)
Kiểu gen B

0 22
66,7%
19
57,6%
3
9,1%
4
13,3%
18
60,0%
14
46,7%

Kết quả
<20 20 <50 50 <50 50
Kiểu gen B 5
15,2%
17
51,5%
9
27,3%
13
39,4%
10
30,3%
12
36,4%
Kiểu gen C 8
24,2%
3
9,1%
4
12,1%
7
21,2%
5
15,1%
6
18,2%
Giá trị p <0,01 p > 0,05 p > 0,05
Nhận xét:
Kiểu gen B có tăng AFP nhiều hơn kiểu gen C, sự khác biệt có ý
nghĩa thống kê với p <0,01. Sự khác biệt giữa AST,ALT với antiHBe


18

Chơng 4

Bn luận

4.1.Tuổi, giới, một số dấu ấn trong huyết thanh bệnh nhân HCC:

Tuổi trung bình trong nhóm nghiên cứu là 50,02 9,97, tuổi thấp nhất
là 33 và cao nhất là 75. Số bệnh nhân HCC tập trung nhiều nhất ở độ tuổi
từ 41- 60 chiếm đa số các trờng hợp (25/35). Theo nghiên cứu Liu CJ,
nguy cơ ung th gan ở ngời nhiễm HBV tăng theo tuổi. Trong nghiên
cứu, số bệnh nhân HCC có tuổi trên 60 chiếm ít (5/35), còn lại đa số là ở
tuổi dới 60 (30/35), nh vậy là nhiều bệnh nhân HCC còn khá trẻ. Một
trong những đờng lây truyền chủ yếu của HBV ở Việt Nam là từ mẹ sang
con nên tình trạng nhiễm HBV ở nớc ta có thể kéo dài trong nhiều năm,
đây là yếu tố thuận lợi cho quá trình viêm mạn tính, phát sinh các đột
biến, hình thành các oncogen gây ung th.
Giới: tỷ lệ nam/nữ là 10/1, đây có thể là một yếu tố nguy cơ có liên
quan đến cơ địa, nghề nghiệp, thói quen sinh hoạt hoặc sự khác biệt về nội
tiết của nam giới so với nữ giới .
Đặc điểm các dấu ấn trong huyết thanh nhóm HCC:
Dấu ấn HBeAg đợc đánh giá là có liên quan với nồng độ ADN của
virut trong máu. Việt Nam cũng giống nh các nớc vùng Châu á thờng
tồn tại HBeAg kéo dài, có thể sau tuổi dậy thì và làm tăng nguy cơ HCC.
Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.1 cho thấy số bệnh nhân HCC có HBeAg(+)
không nhiều, chỉ chiếm 2/35 bệnh nhân (5,7%) nhng số bệnh nhân
antiHBe(-) chiếm 12/35 (34,3%) cho thấy ở những bệnh nhân này có thể
HBeAg mới chỉ bắt đầu giảm xuống thấp dới ngỡng phát hiện hoặc mới

các đột biến của HBV khi ra ngoài huyết thanh. Một số nghiên cứu so
sánh trình tự gen của HBV ở mô giữa các vùng mô khác nhau, giữa mô và
huyết thanh của các tác giả trên thế giới: Nghiên cứu của Momosaki xác
định ADN trong mô gan ung th và vùng mô cận ung th ở các vùng gen
khác nhau cho thấy tỷ lệ ADN-HBV(+) cũng khác nhau giữa các vùng gen
S, C và Polymerase. Nghiên cứu Cho SW , Policino cho thấy khả năng
phát hiện HBV khác nhau giữa các vùng gen, trình tự Nu, các đột biến
cũng khác nhau giữa các vùng mô ung th và không ung th. Nghiên cứu
của Lee PI cho thấy có sự khác nhau giữa trình tự Nu vùng gen S giữa trẻ
và mẹ. Điều này chứng tỏ HBV là một virut có tính biến đổi cao, sự khác
nhau về trình tự gen giữa mô và huyết thanh trên các bệnh nhân ở Việt
Nam cũng có thể xảy ra.
Giải trình tự gen theo cặp mô và huyết thanh ở 9 mẫu bệnh nhân HCC
tại vùng gen PreS để so sánh sự khác nhau về trình tự Nu giữa mô và huyết
thanh (Bảng 3.7) cho thấy có 1 mẫu không có thay đổi về trình tự Nu, 2
mẫu có 1 vị trí thay đổi và số vị trí Nu thay đổi nhiều nhất là 12 vị trí. Số
vị trí aa thay đổi nhiều nhất là 8 vị trí. Mặc dù có sự thay đổi cả về trình tự
aa và Nu nhng kết quả nghiên cứu không thấy có sự thay đổi về phân loại
kiểu gen giữa các mẫu mô so với ở huyết thanh và cũng không có kết quả
nào nghiên cứu nào tơng tự để đối chiếu, nh
ng đã cho thấy về khả năng
thay đổi trình tự gen của HBV từ mô ra đến huyết thanh là có thể xảy ra.
MHBs là cấu trúc protein kích thớc trung bình của hạt HBsAg, đợc
mã hoá từ vùng PreS và vùng S, MHBs thay đổi sẽ làm hoạt hoá liên tục
tín hiệu phân bào c-raf-1/Erk2 dẫn đến tăng sinh tế bào gan, protein đợc
sản xuất từ vùng PreS/S nếu bị đột biến cắt đoạn vùng kết thúc COO có
thể kích thích bộc lộ tiền gen sinh u là c-fos từ 5 tới 10 lần.

20
Kích thích sản xuất các protein từ vùng gen cấu trúc thờng phụ thuộc

đợc thấy ở nhiều nghiên cứu trên thực nghiệm. Theo nghiên cứu của
WangY thì chỉ cần đột biến mất khoảng 14aa đã làm biến đổi HBx. Trong
nghiên cứu này, mặc dù số lợng nghiên cứu còn cha nhiều nhng cũng
cho thấy vùng gen X của HBV có rất nhiều dạng đột biến, có thể gặp
nhiều dạng trong cùng một bệnh nhân. Đây có thể là cơ chế quan trọng
liên quan tới ung th gan do HBV.
Các dạng đột biến vùng gen X trong nghiên cứu cũng thấy có sự khác
nhau giữa mô và huyết thanh. Trong số các mẫu nghiên cứu 64HCC,
80HCC, 18HCC đều cho thấy cắt đoạn ở mô ít hơn ở trong huyết thanh.

21
Nh vậy, sao chép của HBV có sự biến đổi từ mô ra huyết thanh và có thể
có hiện tợng tái sắp xếp gen đợc thấy trong nghiên cứu của Wang Y.
Phân tích gen PreS, gen X ở mô và huyết thanh theo cặp, khẳng định
đợc tính đột biến cao của HBV, thậm chí khác nhau từ mô tới huyết
thanh.

4.3.Đánh giá một số đột biến điểm vùng gen X thờng gặp có liên
quan tới HCC trên lâm sàng:
4.3.1.Đột biến BCP (A1762T/G1764A):
Đột biến corepromoter ở vị trí A1762T/ G1764A là các vị trí đợc
nghiên cứu nhiều, cho thấy có liên quan tới tổn thơng gan và HCC. .
Dạng đột biến tại vị trí BCP (1762/1764) có thể thấy khác nhau giữa các
kiểu gen, kiểu gen A, D, F thờng rất hiếm thấy dạng đột biến này, kiểu
gen B, C thờng gặp hơn và có liên quan tới HCC. Nghiên cứu của Liu CJ
cho thấy có thể gặp > 80% loại đột biến này ở bệnh nhân HCC ở cả hai
kiểu gen B và C và nguy cơ HCC của các bệnh nhân mang đột biến này
cao hơn 12,8 lần ngời mang chủng hoang dại (không đột biến).
Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.11 cho thấy sự khác nhau giữa nhóm HCC
và nhóm chứng ở vị trí đột biến BCP là có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.

hợp với nghiên cứu của BX Trờng, TTT Huy và đặc điểm dịch tễ của vùng
Châu á.
4.4.2. So sánh kiểu gen với một số yếu tố nguy cơ có liên quan:
Kiểu gen nào của HBV cũng có nguy cơ gây HCC, tuy nhiên kiểu gen B
và C thờng gây biến chứng nhiều hơn và đây cũng chính là các kiểu gen
đang lu hành chủ yếu ở Việt Nam.
Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.9 cho thấy không có sự khác biệt về phân
bố kiểu gen B và C của HBV giữa nhóm HCC và nhóm chứng. Do vậy,
kiểu gen có thể mang ý nghĩa về dịch tễ nhiều hơn, hoặc vai trò của kiểu
gen B và C ở Việt Nam có thể tác động nh nhau về cơ chế bệnh sinh tới
các bệnh lý về gan do nhiễm virut viêm gan B ở nớc ta.
Bệnh nhân HCC, kiểu gen C có tỷ lệ antiHBe(-) chiếm 27,2% nhiều hơn
so với kiểu gen B (9,1%). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với
p<0,001(bảng 3.14). Điều này cũng cho thấy ở kiểu gen C có thể chuyển
đảo huyết thanh muộn hơn kiểu gen B. Tuy nhiên, mức độ gây tổn thơng
tế bào, biểu hiện qua chỉ số enzym gan của hai kiểu gen còn cha rõ ràng,
không có sự khác biệt giữa kiểu gen và kết quả AST, ALT trong nghiên
cứu. Số bệnh nhân chuyển đảo ở kiểu gen B trong nhóm HCC nhiều hơn
trong nhóm chứng. Nhng kiểu gen C thì ngợc lại, chuyển đảo xuất hiện ở
nhóm chứng nhiều hơn. Phải chăng cơ chế HCC khác nhau giữa hai kiểu gen.
Kiểu gen B trong nhóm HCC có tăng AFP (Bảng 3.15) chiếm tỷ lệ cao
hơn so với kiểu gen C, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,01.
Nh vậy, kiểu gen B trên bệnh nhân HCC có thể có tiên lợng không tốt
bằng kiểu gen C.

4.5. Đánh giá kết quả ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu:
4.5.1. Đánh giá kết quả Nested- PCR:
Các mẫu ADN đều đợc kiểm tra chất lợng ADN trớc khi thực hiện
kỹ thuật. Đánh giá kết quả Nested- PCR với vùng gen X (Bảng 3.10), cho
thấy có nhiều sản phẩm PCR trên cùng một mẫu bệnh nhân, đợc đánh giá