1









TRƢƠ
̀
NG ĐA
̣
I HO
̣
C KHOA HO
̣
C TƢ
̣
NHIÊN

Nguyễn Thị Hồng Loan


Trong chu trình sng ca HIV-1, 3 enzyme reverse transriptase, integrase và
protease có vai trò quan trng không th thi       
thành virus hoàn chnh. Vì vy, các cht c ch cc nghiên
cu, sn xu u tr cho bnh nhân nhiu tr c
gi là liu pháp dùng thuc chng retrovirus (antiretroviral drug therapy, gi tt là
ART). Trong s 3 enzyme nói trên, protc mã hóa bi gen pol ca virus có
cht các -
              
-
t sinh sn nhanh ca HIV  1, có
khong 10 triu ht virus m c to ra mi ngày và t l sai sót rt cao ca
enzyme reverse transriptase (1/10.000 base) 
  thu tr. Khi có ART, các chng
t bin kháng thuc chn lc và tr thành ch (Hoffmann và
tp th, 2007),  (PI) 

                 

3
-

Hin nay, trên th gi   u công trình nghiên c  sn xut
protease ca HIV-1 (c gi tt là protease HIV-1)  c t cho thy
protease HIV-1 không d c biu hin trong t bào vt ch c tính gây
c t c sau biu hing thp, trong mt
s ng hp ch có th phát hic bn dch vi các quy
trình biu hin, tinh sch gm nhic rt phc tp. Mt khác, các nghiên cu
u sn xut protease HIV-1 phân lp t phân nhóm B là phân nhóm HIV ph bin
gây bnh  M, Australia c Tây Âu. Trong khi, phn lng hp
nhim HIV-1 trên th gii và  Vit Nam không thuc phân nhóm B. Nhng nghiên

3. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài
Đối tượng nghiên cứu của đề tài:
Gen mã hóa protease HIV-1 t huyt thanh các bnh nhân nhim HIV-1 ti
Bnh vin Bnh Nhi
Nội dung nghiên cứu của đề tài:
- Tinh sch RNA ca HIV-1 và tng hp cDNA ca mt s mu HIV-1 t
các bnh nhân nhim HIV-1 ti Vit Nam.
- Nhân bc trình t gen mã hóa protease HIV-1 ca các mu
virus phân l sai khác v trình t gen mã hóa protease HIV-1 gia các
ng bnh nhân nhim HIV-1 so vi trình t ng trên th gii.
- Thit k h thu kin biu hin gen mã hóa cho
protease HIV-1  E. coli.
- Xây dng quy trình tinh sch protease HIV-1 tái t hp.
- Nghiên cu mt s a protease HIV-1 tái t hc.
- Tìm hiu tác dng c ch ca mt s hp cht tng hp và t nhiên lên
protease HIV-1 tái t hp.
4. Địa điểm thực hiện đề tài
Các nghiên cu ca luc thc hin ch yu ti Phòng Thí nghim
trm Công ngh i hc Khoa hc T i
hc Quc gia Hà Ni.
5. Đóng góp mới của đề tài

5
- Công trình nghiên cu có tính h thng t vic nhân bn, nhân dòng và
biu hin  E. coli gen mã hóa protease HIV-1 tái t hp thuc chng CRF01_AE
ca Vit Nam; thit l tinh sch protease HIV-1
vi hiu sut thu nhi các nghiên cu trên th gii.
- u tiên phát hin thy tác dng c ch protease HIV-1 bi
axit asiatic, 8-hydroxyquinoline và menadione.
6. Ứng dụng thực tiễn của đề tài

HIV thuc h retrovirus, là h ng vt. HIV-1 có
3 nhóm chính là M (main), N (new), và O (outlier). Có ti 90% s lây nhim HIV
trên toàn th gii thuc ký hiu bng các
ch cái A-D, F-H, J, K và nhiu dng tái t hp khác c gi tt là các phân nhóm
CRF (circulating recombinant forms). S khác nhau gia phân nhóm này vi phân
nhóm khác là  trình t axit amin ca protein v và có th t quá 30%. Phân
nhóm B ph bin  M, Tây Âu và Australia; trong khi các phân nhóm không phi
nhóm B li phân b  n c
phn ln nhi b nhing. S ng ca virus có th thy 
vùng Sahara (châu Phi).  Vi-1
phân lp t các bnh nhân nhim HIV-1 ch yu thuc nhóm CRF01_AE, bên cnh
t s ít các phân nhóm B, C và các dng tái t hp khác (UNAIDS, 2010;
Nguyen và tp th, 2003; Ishizaki và tp th, 2009; Phan và tp th, 2010).
Phn ln vic nghiên c tìm ra thuu tr bu
da trên phân nhóm B. Tuy nhiên g ng v trình t axit amin gia các
ng nghiên cu quan trng kháng
thuc PI (Bandaranayake và tp th, 2008).
1.1.2.Tình hình nhiễm HIV-1
i dt thách thc to li vi tin trình
phát trin xã hi. Sau 3 thp k phát hi  u tiên là   c phát trin,
ng trên toàn th gic bit  khu vc
châu n nay va HIV hay thuc cha tr c hiu.
Theo   HIV/AIDS     (UNAIDS, 2010), n
cu i nhing trên th gii
 l hin nhim HIV/AIDc tính cao gp 3 l
c tính khong 33,3 tri

7
b ng nhim mi là 2,6 trii và có khong
1,8 triu b

8
Lõi có dng hình tr c bao bc bi lp capsid to thành t 2.000 bn sao ca
protein p24 (Hare, 2006; Hoffmann và tp th, 2007).

Hình 1.1. Cấu trúc của một hạt HIV-1 (Hoffmann và tp th, 2007)
1.1.3.2. Tổ chức hệ gen của virus
H gen ca HIV-1 nm trong phn lõi ca virus và bao gm hai si RNA (+)
i si có chiu dài khong 9,8 kb và có 9 gen mã hóa cho 15 protein khác
nhau (hình 1.2). So vi các virus khác thuc h retrovirus thì h gen ca HIV-1
phc ti si RNA có 3 gen cu trúc là gag, pol và env;  gag
  group-antig    pol  pol  env là
env). C a b gen retrovirus -gag-pol-env-
long terminal rn lu cùng) là
u ca b gen virus, ni vi DNA t bào vt ch sau khi tích hp và không mã
hóa cho bt c protein nào ca virus. Các gen gag và env mã hóa cho nucleocapsid
và glycoprotein ca màng virus; gen pol mã hóa cho 3 enzyme: reverse
transcriptase, integrase và protease. Ngoài ra, HIV-1 còn có 6 gen (vif, vpu, vpr, tat,
rev và nef)  vùng RNA 9 kb (Hoffmann và tp th, 2007). 9

virus nh c nhân lên, các protein ca
c tng hp nh ribosome ca t bào vt ch, chúng di chuyn ra
mi ni cht hoc màng t bào, tip theo là quá trình ny chi to thành các
virion nm trên màng hoc tách ra khi t bào chi gn vào các
t bào lympho T khác. S vn chuyn RNA cc sao chép ra khi
nhân ph thuc vào mt s nhân t ca virus và vt ch 
c vn chuyi dng vt liu di truyn cho các virion mi
hay có th c ni tng phn hoc toàn b nhm tng hp nên nhng protein
khác nhau ca virus (Hare, 2006; Hoffmann và tp th, 2007).
Hình 1.3. Chu kỳ sống của HIV-1 (Weiss, 2001)
Các t bào lympho T CD4
+
b nhim có th b git trc tip khi mng
lc sn sinh và ny chi t b mt, phá v màng t bào hoc khi các
protein và axit amin ca virus có mt bên trong t bào, cn tr s hong ca b
máy t bào. Mt khác, các t bào lympho T CD4
+
b nhim có th ng

CD4
+
n ti các hong ca h min dch, kh 
virus ci bi bnh l
này virus vn có kh n bnh. Kho virus trong
 cho ti lúc cht, các kháng th kháng virus gim dn, giai
n này gi ln cui bnh thy m
nhim khui gy yu, các vi sinh vu kin tn công.
c bit, mt s b b, lao, tiêu chy kéo dài, sút cân, dùng kháng
sinh không khi, chân tay xut hin các nt nhim, da và niêm mc bu xut
hin bi bnh cht dn (





, 2001; Hoffmann và tp th, 2007).

12
1.1.4. Phƣơng pháp điều trị HIV/AIDS
Trong phòng chng nhim HIV-1, phát tri    
truyn thng gp rt nhit s i gian  bnh
ca HIV-ng xuyên xt bin  vùng gen mã hóa cho kháng nguyên,
m HIV-ng vt và tn sum HIV-1 cao.
Ngui nhim HIV-1 mun kéo dài cuc sng ch ng duy nht là ung
thuc c ch s sao chép và nhân lên ca HIV-1.
n nay, viiu tr HIV/AIDS phc tp, tn kém và ch giúp kéo dài
s sng mà không cha khc bnh. Các thuu tr HIV/AIDS có th ng
 hiu bit v quá trình nhim và nhân lên ca
HIV trong t bào (hình 1.4)  c ch quá trình ny chi, c ch quá trình hòa

v chuy  c bit là teo m) hi     c tính ca thuc
nucleoside. Có l n c ch hot ng ca ty th do hong
cha ty th cn nucleoside. Quá trình chuyn hoá c
trng này b ri lon do vic s dng phn s thoái hoá ca
ty th. Các thuc khác nhau có th c vi ty th  m khác nhau (Gal






, 2002).
Thuốc ức chế virus xâm nhập: Các thuc này c ch hay cn tr s xâm nhp
ca HIV vào t bào vt ch. c ch yu giúp HIV-1 xâm nhp vào t bào
CD4: HIV-1 gn vào th th ca t bào CD4, gn vng th th và hòa nhp
virus vi t bào. Mc này u có th b c ch. Tt c các nhóm thuc c th
c c ch gng th th và c ch hòa màng hin nay
c gi chung là thuc c ch xâm nhp. Thuc
clà enfuvirtide (T-20) t ra c ch ngay c nhng chng HIV-1
kháng thuc mnh nht. Tuy nhiên, bu tr T-20 có s  l v
bnh lý hch và viêm phi do vi khun (Trottier và tp th, 2005).
HIV/AIDS còn có th  u tr bng thu u hòa min d 
Alpha-interferon, interleukin 2, loprinasine vi tác dng kh o
v các h min dch. Ngoài ra, bnh nhân HIV/AIDS còn có th u tr vi
mt s thuc phòng nga bi.
Du vy, bc tranh phòng chn ht sc m
m, nhiu bnh nhân nhim bnh t gia nh vong. Chính vì vy,
s  i ca các thuc c ch protease và thuc c ch enzyme reverse
transcriptase không phi nucleosu k nguyên
tr liu kháng retrovirus hiu lc cao (Highly Active Anti-Retroviral Therapy-

anh tranh v dành v c kê nhiu nht.
Lopinavir c cu tiên và duy nht có
mt li     lopinavir lên trên 100 ln. Lopinavir/r có
hàng rào kháng thuc rt cao, ct 6-t bin kháng thuc thì mi
 gây tht bi trong u tr (





, 2002).
Các chất ức chế reverse transcriptase không nucleoside (NNRTI): ging vi
các NRTI   ng ca chúng là enzyme reverse transcriptase. Tuy vy,
NNRTI gn trc tip và không cnh tranh vi enzyme  v trí gn sát vn
các nucleoside. Kt qu là làm phong b hoàn toàn v trí gn các cht hot hóa

15
enzyme reverse transcriptase, làm gi   quá trình tng hp axit nucleic.
Nhóm thuc này gm: nevirapine (viramuneTM), efavirenz (sustiva 
. Tuy nhiên, bu tr bng NNRTI
có c không ch rt cao mà còn có th xut hin khá nhanh. Mt
khi y ra kháng thuc thì h kháng vi c nhóm thuc này. Ch cn mt
t bin  v trí gn k t bi loi b toàn b c nhóm thuc.
Nt biu tr tip tc bng NNRTI, bi l kh
t bin kháng NNRTI li không b ging
ng ht bin kháng PI hay NRTI. Mc dù có nhng v n
c, rt nhiu nghiên cu cho thy NNRTI có hiu qu rt tt
nu phi hp cùng vi các thuc NRTI. Các d liu v min dch h
virus hc  nhng b     u tr ART cho thy các thuc
u lu không mut tri


16
d ng rut, ri loi lipid máu, lon nhp tim ). V này có
th c gii quyt bng cách s dng n cht c ch protease cao hoc to ra
các cht c ch mi có hiu lc cao. Mt khác, HIV-1 nhân lên nhanh và enzyme
reverse transcriptase phiên mã vi t l sai sót khá cao nên t t bin HIV-1
ln và HIV-1 luôn to ra các chng mi dn s i trong cu trúc và giúp
cho HIV có kh c và dn tht bu
tr HIV-1 bng ART.
Du vy, dù HIV-1 là mt tác nhân gây bnh truyn nhim rt nguy him vi
nhng bii phc tp, các nhà khoa hc vng nghiên c
tìm ra thuc mi, hiu qu chng HIV và hi vng ra hiu qu
u tr bng ART và HAART s khác hoàn toàn.
1.2. PROTEASE HIV-1 VÀ ỨNG DỤNG
Trong chu trình tái bn ca HIV-1, protease là enzyme có tác dng phân ct
các polyprotein tin thân gag và gag-pol thành nhng protein cu trúc và ch
ng thành ca virus. Khi c ch hot tính ca protease hoc gây
t bin trên gen mã hóa cho protease, các ht virus v
 to thành virus hoàn chnh nên chúng không có kh 
xâm nhim vào t bào vt ch (





, 1989). Vi vai trò c bit quan
try, protease HIV-c nhiu nhóm các nhà khoa hc trên th gii
quan tâm nghiên cu.
1.2.1. Cấu tạo protease HIV-1
Có nhiu cách phân loi protease, da vào v trí ct trên chui polypeptide,

 c to ra khi HIV nhim vào t bào ch. Protease HIV-1 là
mt dimer, mi monomer ging ht nhau có khng phân t (KLPT) 11 kDa
gm 99 axit amin  c sp xp g    i xng. Mi mt
monomer to thành cu trúc các phin gp np vi m n xon ngn
gu C (Tie, 2006).
c ch ra  hình 1.5u N ca protease HIV-1 vi các axit amin 1-4
hình thành nên chua là phn bên ngoài ca b mt phin g
9-15 hình thành chub qua mt vòng quay, tip tn chuc t thúc
v trí b ba hong (Asp25-Thr26-Gly27). Tip theo cu trúc vòng ca v trí hot
ng là chud gm các axit amin t 3035. Mt cu trúc vòng rng (axit amin
3642) liên kt vi chua’ hình thành bi các axit amin 4349. Các axit amin
5266 và 69-78 lt hình thành nên chub’ và chuc’. Sau mt cu trúc
vòng to ra bi các axit amin 7982, mt chui ngn d’ (các axit amin 8385) dn
trc tin mn xoh (các axit amin 86n xon h theo sau bi
mt chui q thng tn cùng bu C (các axit amin 9599) hình thành nên phn
bên trong ca b mt nh phân. Bn chu lõi t chc thành phi
a tt c các protease aspartyl. Các axit amin 44-57 trong mi tiu
phn hình thành nên mm mt cp chuc nhau (a’ và
mt phn ca b’) (

, 1998; Tie, 2006).
Cu to protease HIV-1 còn có th c chia thành ba vùng (domain) chính:
vùng cui hom 4
phn cui ca phic axit amin 1-4 và 95-99 ca mi monomer), vòng
quay quanh axit amin 4-9 và chui xon (axit amin 86-94 ca mi monomer). Vùng
này có vai trò thit yu trong hình thành cu trúc dimer và  nh hot tính
protease HIV-1. Cu trúc dimer s c hình thành nh n

18
gia 4 si ca phin  t các gc axit amin 1-4 (vùng N u cùng N), 96-99 (vùng

mt phân gii cc làm nh nh mi các liên kt hydro ging
vi các enzyme  sinh vt nhân chun. Mi liên kt hydro này khá vng chc 19
(hình 1.6) to nên s  nh ca trung tâm ho ng c   i
u có mt b ba Asp-Thr-Gly vi v 
   Asp cn thit cho c cu trúc và hot tính xúc
tác ca protease. Hình 1.6. Cấu trúc kẹp trong trung tâm hoạt động của protease HIV-1
(

, 1998)
Nhóm cacboxyl ca Asp25 to liên kt hydro vi NH ca Gly27. Nhóm 
OH ca Thr to liên kt hydro vi din, liên kt gia NH ca
Thr (màu xanh) vi gc ) ca gc Asp
Bên c   ba Gly86-Arg87-Asn88 ca protease HIV-   t
vùng bo th c hình thành cu trúc dimer. Các v trí
liên kt gm S3  yu hình thành bi các axit amin 8, 23-30, 32,
45-50, 53, 56, 76, 80-82 và 84. Các v trí 1-3, 5-9, 23-27, 29, 47-52, 54, 67, 81, 87
và 90-99 góp phn liên h gia b mt dimer. Các cht c ch hot liên kt
gia hai tiu phn bng liên kt hydro i v trí hot



(2008) thì s khác nhau v
trình t axit amin gia các phân nhóm HIV-1 g
quan tr kháng thuc  protease HIV-1. Các tác gi này 
nh cu trúc ca protease HIV-1 phân nhóm CRF01_AE và so sánh vi phân nhóm
B. Bng cách sp xp các nguyên t C chng lên nhau, các tác gi cho thy có s
 ng cao gia cu trúc ca protease HIV-1 phân nhóm B vi phân nhóm
 lch ch có 0,37 A
o
. Tuy nhiên, trong cu trúc ca protease HIV-1
phân nhóm CRF01_AE có s sp xp li t gc axit amin 33-39 và gn vùng lõi
(gc axit amin 16-22). S khác nhau v cu trúc  c trên hai monomer. Chui bên
ngc i chui bên ca
n li g
sánh vi chui bên Met36 trong cu trúc protease phân nhóm B. Phn cong ca
ng v  y s hình thành liên kt hydro gia C0 ca
Asp35 và NH
2
- c        ng vào

21
vùng lõi. So vi chung ra ngoài vùng
hòa tan, cho phép oxy ca H
2
O hình thành liên kt hydro vi NH- ca Arg57. V trí
chui bên Arg57 cho phép hydro ca NH
2
to liên kt hydro vi CO- ca Met36.
Chui bên Arg57 cn to bt c i

protease HIV-1 vn còn là v gây nhiu tranh cãi. Các protease c
các protease HIV-1 rt khác nhau v cu trúc bc ba và bc bn khi so sánh vi
protease ca t bào hay các protease ging pepsin khác. Protease HIV-1 có hot tính

22
xúc tác khi  dng dimer vi mt phn Asp xúc tác và mt ph mi ti
v, còn protease ging pepsin hoi mt phn Asp xúc
tác t mt trong hai khu vc ca mt. Nhìn chung, phn ng là
xúc tác axit-m c i v to np gp c
cht) và hóa hc (hình thành và tách ra cu trúc t din trung gian). Không ging
    protease cysteine, protease HIV-1 không có liên k ng
hóa tr gia acyl-c hình thành trong sut quá trình này. Hiu
qu ca quá trình ct ph thuc vào trình t axit amin ccht (Tie, 2006).
Trình t các v trí ct ca protease HIV-1 trên protein gag và gag-c
th hin  bng 1.1. Ti v c k c ln chi
th ng xut hin t
  yu xut hin  P1. Các gc phân c  c nh
ng xut hin   P3 tr ng là glutamine
hoc các gng là axit amin nh. V trí ca
protease HIV-1 là liên kt Aro-Proc Trp.

Bảng 1.1. Trình tự các vị trí cắt của protease HIV-1 trên protein gag và gag-pol
(Tie, 2006)
Các v trí ct
P4
P3
P2
P1



Asn
Phe
Leu
Gly
p1-p6
Pro
Gln
Asn
Phe
Leu
Gln
Ser
Trên p6
Lys
Glu
Leu
Tyr
Pro
Leu
Thr
Trên protein pol
TFP-p6
pol

Asp
Leu
Ala
Phe
Leu
Gln

Arg
Lys
Ile
Leu
Phe
Leu
Asp
p th u hic  vi khun E. coli gen
protease HIV-1 to ra protease có hot tính t ct. Kt qu gii trình t axit amin
cho thy trình t u N ca protease hoàn toàn trùng vi trình t phân cc gi
nh Pro-Gln-Ile-Thr-Leu. Quá trình t ct t polyprotein ti to protease
 trong các t bào nhim HIV-1.
1.2.3. Các phƣơng pháp xác định hoa
̣
t độ protease HIV-1
Vì protease HIV-1 không thng nên vic xác
nh ho ca protease phi da trên các trình t ct ca protease HIV- tng
ht phù hp. Tùy vào cht hóa hc khác nhau gn vi chu
cht s  thích hp, mt s k thum:
i) c ký lng cao áp (HPLC) vt sinh màu tng hp
có v trí c c hiu cho protease HIV-1, sn phm c   ng bng
n nhiu thi gian, không thích hp khi làm vi nhiu
mu và không liên tc (

, 1993).
h k vt peptide có liên kc hiu ca
protease HIV-1 và hp th c i tc sóng nhnh trong vùng t ngoi.
i tác dng ca protease, liên kt b c  hp th gim dn tc
i gian (


pháp này tin hành nhanh, d  nh c hiu 
dng quang ph ng vt tng hp 
hii nht hi nh ho protease HIV-1.
Hin nay, trên th ng có rt nhit tng hp sn c
 nh hot tính ca protease HIV-1 bng quang ph k và HPLC. Hãng
Anaspec (M) có kit protease HIV-      nh ho 
protease HIV-1 bng quang ph hunh quang. Ngoài ra, hãng còn có hai loi kit
c sóng kích thích và phát ra trong vùng nhìn thy thun tin cho xác
nh ho protease HIV-1.
1.2.4. Chức năng sinh học của protease HIV-1
Protease có vai trò quan trng trong quá trình nhân lên ca HIV-1. Protease
HIV-1 ct các chui polyprotein (gag, gag-pol) thành các protein cu trúc và chc
n thit cho virus hoàn chnh. C th, protease HIV-1 nhn bit và ct các
liên kt khác nhau trên polypeptide gag  to thành các protein cu trúc: matrix
P17 (MA), capsid p24 (CA), nucleocapsid p7 (NC) có vai trò trong quá trình lp ráp
nh hình thái ca lp v ng thành cùng vi 3 protein nh (p6, p2
     ; thy phân polypeptide gag-pol to thành 3 enzyme:
protease, reverse transcriptase và integrase cn thit cho quá trình sao chép ca HIV
(





, 1989; 

 , 1998). Các thí nghim in vitro vi
protease HIV-1 tinh snh enzyme có kh t polypeptide gag
tin thân. Hình 1.7 th hin các v trí ct ca protease HIV-1 trên các polyprotein
gag và gag-pol.






, 1989).
Ngoài quá trình lây nhim, protease HIV-      
trình phát sinh bnh. Khi vào t i, protease HIV-c và ct nhiu
protein ca vt ch. C th, protease HIV-1 ct procaspase 8 không hot hóa
thành caspase 8 hot hóa dn ct Bid thành tBid làm ri lon quá trình thy
phân, to ra nhng ri lon trong ty th và kích thích kh m qua màng ty
th ph thuc Bax/Bak. Kt qu làm ty th gii phóng cytochrome c và phân
mnh nhân. Hing này ch phát hin thy  các t bào lympho T CD4 và
dn ch thuc vào kích thích ca caspase
8. Các nghiên cnh rng s dng các cht c ch protease có th
 n hi ng ch     protease HIV-1 gây nên
(



 

, 2008).
1.2.5. Nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch protease HIV-1
Do kháng nguyên HIV-1 bii liên tc dn tht bi trong sn xut
vaccine nên bnh nhân nhim HIV-1 mun duy trì cuc sng ch ng duy
nht là dùng thuc. Protease có vai trò không th thiu trong chu trình sng ca
Hình 1.7. Các vị trí cắt của protease HIV-1 trên polyprotein gag và gag-pol
(
