BỘ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ
HỌC VIỆN QUÂN Y
BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU HỢP TÁC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH
TẠO KHỐI TẾ BÀO SÂM NGỌC LINH LÀM
NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PHỤC VỤ
SỨC KHỎE CỘNG ĐỒNG
CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI
PGS,TS. Nguyễn Văn Minh
HỌC VIỆN QUÂN Y
Đại tá, GS.TS. Hoàng Văn Lương
2. Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương
3. Viện Dược liệu
4. Trung tâm NCƯD Sinh – Y – Dược học – HVQY.
5. Trung tâm Đào tạo, nghiên cứu Dược – HVQY.
6. Bộ môn khoa Giải phẫu bệnh lý – Bệnh viên 103 – HVQY
MỤC LỤC
Trang
MỤC LỤC
CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1. CÔNG NGHỆ SINH KHỐI TẾ BÀO THỰC VẬT 3
1.1.1. Khái niệm 3
1.1.2. Ưu và nhược điểm của công nghệ sinh khối tế bào thực vật 4
1.1.3. Qui trình lý thuyết tạo sinh khối tế bào thực vật 4
1.1.4. Yế
u tố ảnh hưởng tới sự phát triển tế bào, hàm lượng hoạt chất 5
1.1.5. Thành tựu của công nghệ sinh khối tế bào 13
1.1.6. Tình hình ứng dụng công nghệ sinh khối tế bào thực vật cho các loài
sâm
16
1.2. SÂM NGỌC LINH 17
1.2.1. Đặc điểm thực vật 17
1.2.2. Thành phần hóa học 18
1.2.3. Tác dụng dược lý 19
1.2.4. Nuôi trồng 20
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠ
3.2.3. Kết quả xây dựng tiêu chuẩn cơ sở 101
3.3. TÍNH AN TOÀN VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG CỦA SÂM NGỌC LINH
SINH KHỐI
122
3.3.1. Kết quả đánh giá tính an toàn của sâm Ngọ
c Linh sinh khối 122
3.3.2. Một số tác dụng dược lý của sâm Ngọc Linh sinh khối 137
KẾT LUẬN 166
KIẾN NGHỊ 169
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG ĐỀ TÀI
BC Bạch cầu
CNT Chuột nhắt trắng
CCT Chuột cống trắng
DĐVN Dược điển Việt Nam
2.5 Sơ đồ phản ứng xác định GPx 59
2.6 Sơ đồ phản ứng xác định TAS 61
3.1 Kết quả tạo thành callus sau 35 ngày nuôi cấy 66
3.2 Khối lượng callus trong các môi trường khác nhau 67
3.3 Tốc độ tăng trưởng callus sâm theo thời gian 67
3.4 Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến sự hình thành
callus
68
3.5 Đặc tính tế bào sau các lần cấy chuyển 69
3.6 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến tốc độ phát triển tế bào 71
3.7 Ảnh hưởng của pH môi trường tới sự sinh trưởng tế bào sâm 72
3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ phòng nuôi cấy đến tốc độ phát triển tế
bào
73
3.9 Tốc độ phát triển tế bào sâm Ngọc Linh trên môi trường lỏng 74
3.10 Tốc độ phát triển tế bào sau các lần cấy chuyển 75
3.11 Ảnh hưởng của pH môi trường 76
3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 77
3.13 Ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng 77
3.14 Kết quả nuôi cấy tế bào sâm theo thiết kế phần mềm 79
3.15 Ảnh hưởng của biến đầu vào với biến đầu ra 80
3.16 Kết quả nuôi cấy tế bào SNL trên môi trường tối ưu 83
3.17 Kết quả lựa chọn loại elicitor 84
3.18 Kết quả lựa chọn nồng độ acid jasmonic 85
3.19 Thời điểm tiếp xúc với elicitor 86
3.20 Kết quả lựa chọn thời gian tiếp xúc của elicitor với tế bào 86
3.21 Kết quả nuôi cấy trên hệ thống Bioreactor 5lit 87
3.22 Kết quả nuôi cấy trên hệ thống Bioreactor 15 lit 88
3.23 Hàm lượng 1-NAA tồn dư và hoạt chất trong SNL sinh khối. 89
3.24 Hàm lượng 1-NAA tồn dư và hoạt chất trong SNL sinh khối 89
3.51 Kt qu nghiờn cu v mụ bnh hc ca gan th 133
3.52
Kết quả nghiên cứu về mô bệnh học của thận thỏ
134
3.53
Kết quả nghiên cứu về mô bệnh học của lách thỏ
134
3.54 Thi gian bi ca chut thớ nghim 137
3.55 Thi gian bỏm rotarod ca chut sau 60 phỳt th thuc 138
3.56 Thi gian bỏm rotarod ca chut sau 2 tun th thuc 139
3.57 Sc c chõn chut cỏc lụ nghiờn cu 140
3.58 nh hng ca SNL sinh khi n trng lng chut 140
3.59 Tc hỡnh thnh phn x cú iu kin tỡm thc n trong mờ l
ca cỏc lụ chut nghiờn cu (n = 8)
142
3.60 Tc dp tt phn x cú iu kin tỡm thc n trong mờ l ca
chut nht trng cỏc lụ nghiờn cu (n=8)
142
3.61 Tỏc dng ca trờn kh nng hc tp, nhn thc chut nht
trng
143
3.62 Tỏc dng trờn kh nng ghi nh chut nht trng 144
3.63 ỏp ng ca chut vi mụi trng l 145
3.64 Tỏc dng ca SNL sinh khi trờn năng lực thần kinh 145
3.65 Nng MDA cỏc mu gan chut nghiờn cu. 147
3.66 Nng GSH cỏc lụ chut nghiờn cu 148
3.67 nh hng ca SNL sinh khi liu 1,2g/kg n nng MDA 149
3.68 nh hng ca sinh khi sõm liu 1,2g/kg n nng GSH 150
3.69 Nng GSH /mỏu cỏc lụ chut nghiờn cu 151
3.70 Hot SOD trong mỏu cỏc lụ nghiờn cu 152
2.4
Mê cung nớc (Morris water maze)
47
2.5
Bảng đục lỗ Hole Board Cat. No. 6650, Ugo Basile
48
2.6
Máy đo phản xạ tự động có điều kiện Automatic Reflex
Conditioner. Cat. No. 7530, Ugo Basile
49
2.7 Hỡnh 2.7. Plethysmometer Cat. No.7140, Ugo Basile 63
2.8 Paw Pressure Analgesy Meter Cat. No. 37215 , Ugo Basile 65
3.1 R v callus sõm Ngc Linh 66
3.2 Callus SNL sau cỏc ln cy chuyn trờn mụi trng thch 70
3.3
T boSNL trờn mụi trng thch (A); trong mụi trng lng (B)
74
3.4 Sc ký mu trng (a), mu th 5 ng/ml (b). 96
3.5 Sc ký ca mu SNL t nhiờn (a) v SNL sinh khi (b) 97
3.6
Sc ký HPLC ca cỏc ginsenosid chun (a) v SNL sinh khi (b)
97
3.7 Hỡnh nh vi phu r SNL t nhiờn 101
3.8 Hình ảnh soi bột rễ SNL tự nhiên 101
3.9
Sắc ký đồ chuẩn (a) và SNL tự nhiên (HPLC-b), sắc ký lớp
mỏng (c)
102
3.10
Sắc ký đồ của mẫu SNL tự nhiên (b) và cao đặc SNL sinh khối (a)
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ Tên sơ đồ Trang
3.1 Sơ đồ quy trình thu hoạch SNL sinh khối 90
3.2 Quy trình chiết xuất siêu âm cao SNL sinh khối 92
3.3 Sơ đồ xử lý dịch chiết và hoàn thiện cao SNL sinh khối 931
ĐẶT VẤN ĐỀ
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv) là dược liệu đặc hữu
thuộc họ nhân sâm (Araliaceae), bộ Hoa tán, được phát hiện đầu tiên vào năm
1973 tại núi Ngọc Linh, hiện nay được đưa vào Sách đỏ Việt Nam. Sâm Ngọc
Linh chỉ mọc ở độ cao trên 1.500 mét, chủ yếu mọc tập trung ở vùng núi
Ngọc Linh thuộc hai huyện Đắc Tô, tỉnh Kon Tum và huyện Trà My, tỉnh
Quảng Nam.
Trải qua nhiều năm ph
ối hợp nghiên cứu cả ở trong nước và ngoài nước,
Sâm Ngọc Linh đã được xác định tương đối toàn diện về thành phần hoá học
và dược học. Theo Nguyễn Minh Đức và cộng sự, Sâm Ngọc Linh có 52 hoạt
chất saponin được, trong đó có 26 loại saponin mới không có ở các loài sâm
khác cùng chi. Sâm Ngọc Linh có nhiều tác dụng dược lý: tác dụng bổ dưỡng,
tăng lực, cải thiện trí nhớ, cải thiện năng lực tâm thần kinh, t
ăng cường hưng
phấn vỏ đại não, cải thiện tính linh hoạt của hoạt động thần kinh, kích thích
miễn dịch, chống stress và chống trầm cảm, chống stress oxy hóa và lão hóa,
bảo vệ gan, tác dụng chống viêm, điều hòa huyết áp, hạ lipid máu, dự phòng
xơ vữa động mạch, thu nhỏ ổ loét dạ dày tá tràng, tăng cường chức năng sinh
và bảo tồn Sâm Ngọc Linh, một vấn đề cấp thiết đặt ra, cần phải phát triển
công nghệ sinh khối tế bào Sâm Ngọc Linh tạo nguồn hoạt chất ổn định, đáp
ứng nhu cầu làm thuốc, mỹ phẩm, Đây là một hướng đi c
ấp bách và phù hợp
với xu hướng phát triển công nghệ sinh khối tế bào thực vật của nhiều nước
trên thế giới để sản xuất hoạt chất nguồn gốc thực vật.
Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Sinh - Y - Dược học, Học viện Quân y
đang hợp tác với Trung tâm Nghiên cứu Tài nguyên Sinh học, Trường Đại
học Tổng hợp Ajou, Hàn Quốc đang triển khai nghiên cứu công nghệ sinh
khối tế bào Sâm Ng
ọc Linh. Trong quá trình tiến hành đề tài này, việc đánh
giá tác dụng dược lý của Sâm Ngọc Linh sinh khối có so sánh với Sâm Ngọc
Linh tự nhiên là nhiệm vụ quan trọng.
Mục tiêu:
1. Xây dựng quy trình công nghệ sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh
quy mô phòng thí nghiệm.
2. Nghiên cứu phương pháp kiểm nghiệm, tiêu chuẩn cơ sở của sâm
Ngọc Linh sinh khối và cao đặc sâm Ngọc Linh sinh khối.
3. Đánh giá tính an toàn, một số tác dụng dược lý của sâm Ngọc
Linh sinh khố
i.
3
Ch−¬ng 1. TỔNG QUAN
1.1. CÔNG NGHỆ SINH KHỐI TẾ BÀO THỰC VẬT
1.1.1. Khái niệm
Sinh khối tế bào (SKTB) thực vật là kỹ thuật nuôi cấy, duy trì, tạo khối
lượng lớn tế bào thực vật trong môi trường dinh dưỡng phù hợp và điều kiện
nuôi cấy vô khuẩn mà không thâm canh gieo trồng. Các tế bào khi nuôi cấy
vẫn giữ nguyên được các đặc tính vốn có ban đầu, đặc biệt là các hoạt chất
phẩm có thể sự dụng cho chiết tách các hoạt chất. Quá trình này cũng bắt đầu
từ việc tạo ra callus từ những tế bào, mô khác nhau của thực vật, sau đó chúng
được làm giảm hoặc mất tính biệt hóa [
36] và được thuần hóa trên môi trường
4
dinh dưỡng nhất định, cuối cùng là tăng khối lượng trên hệ thống các bình
nuôi cấy lớn (các Bioreactor). Trong qúa trình đó đặc tính của tế bào được giữ
nguyên như ban đầu, các quá trình sinh học của tế bào vẫn xảy ra như đối với
tế bào khi còn tồn tại trong cây tự nhiên. Trong đó có việc tổng hợp và tích
lũy hoạt chất [41].
1.1.2. Ưu và nhược điểm của công nghệ SKTB thực vật
1.1.2.1.
Ưu điểm
So với nuôi trồng tự nhiên, công nghệ SKTB thực vật có những ưu
điểm vượt trội sau:
- Công nghệ SKTB thực vật không chịu tác động của các yếu tố tự
nhiên như địa lý, khí hậu, thổ nhưỡng, bệnh dịch, thiên tai…do toàn bộ qui
trình sinh khối được tiến hành trong phòng thí nghiệm, nhà máy. Điều này
giúp khắc phục được ảnh hưởng bất lợi của điều ki
ện tự nhiên tới năng suất
và chất lượng sản phẩm. Ngoài ra, còn loại bỏ được yếu tố thời vụ như khi
gieo trồng nên giúp chủ động được nguồn nguyên liệu phục vụ sản xuất.
- Thời gian sản xuất nguyên liệu theo công nghệ SKTB rút ngắn hơn
nhiều so với gieo trồng tự nhiên. Giai đoạn nghiên cứu từ khi tiến hành tạo
callus (giai đoạn đầu tiên của quy trình)
đến việc nuôi cấy trên môi trường lỏng
phải mất khá nhiều thời gian. Tuy nhiên sau khi đã lựa chọn được điệu kiện,
môi trường nuôi cấy thì thời gian cho sản xuất 1 mẻ sinh khối thường khoảng
từ 15 – 50 ngày. Như vậy nó đã rút ngắn rất nhiều về thời gian so với trồng cây
cs (1987) đã thông báo sự tạo thành anthraquinone trong các nuôi cấy tế bào
các chi Asperula, Galium, Rubia và Sherardia (được tối ưu các điều kiện)
cao hơn trong cây tự nhiên từ 4-6 lần. Đặc biệt hàm lượng anthraquinone cao
nhất ở loài Rubia fruticosa lên t
ới 20% trọng lượng khô cao gấp 20 lần [71].
- Đối với các dược liệu qú y hiếm sản xuất theo công nghệ này thì giá
thành sản xuất sẽ thấp hơn. Lí do là trong thời gian ngắn có thể tạo ra một
khối lượng lớn sản phẩm trong khi chi phí nguyên liệu cho nuôi cấy thấp.
1.1.2.2. Nhược điểm
Tuy nhiên công nghệ SKTB thực vật cũng có những hạn chế mà các
nhà khoa học đang tập trung giải quyết:
- Hàm lượng các hoạt chất trong SKTB còn thấp, đặc biệt là với các tế
bào có cùng nhiều nhóm hoạt chất tồn tại thì việc kích thích tăng hàm lượng
đồng thời các chất vẫn chưa khắc phục được.
- Chi phí đầu tư dây truyền sản xuất tốn kém do đặc thù của nuôi cấy tế
bào thực vậ
t khác với nuôi cấy nấm và vi khuẩn nên hệ thống các bình nuôi
cấy (bioreactor) cần phải thiết kế riêng đối với từng loại tế bào. Tuy nhiên,
hiện nay ở Nhật Bản, Mỹ, Hàn Quốc các nhà khoa học đã thiết kế được các hệ
thống Bioreactor từ 10.000 – 50.000 lít dùng cho sản xuất các sản phẩm bằng
công nghệ SKTB thực vật.
1.1.3. Quy trình lý thuyết tạo sinh khối tế bào thực vật
Quá trình tạo SKTB thực vật th
ường được tiến hành theo năm giai đoạn
kế tiếp nhau [
36],[51] (hình 1.1).
Đây là bước rất quan trọng, quyết định tốc độ phát triển cũng như hàm
lượng hoạt chất của sinh khối. Trong giai đoạn này phải khảo sát đầy đủ các yếu
tố ảnh hưởng như: điều kiện nuôi cấy, thành phần môi trường nhằm mục đích cho
sinh khối phát triển nhanh nhất, hàm lượ
ng hoạt chất trong sinh khối cao nhất.
B
D
A
C
E
7
Giai đoạn 4: Khuyếch đại quy mô nuôi cấy (scale-up)
Sau khi đã tìm được các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp, để
tăng khối lượng sản phẩm, các tế bào phải được nuôi cấy trong hệ thống các
bình nuôi cấy (bioreactor) thể tích khác nhau tùy theo quy mô. Ở giai đoạn
này các yếu tố về điều kiện sản xuất như loại bioreactor, kiểu cánh khuấy,
phân áp oxy hòa tan là những yếu tố cần phải kh
ảo sát. Hiện nay, sản xuất
taxol và shikonin người ta đã sử dụng các bioreactor 10000 và 50000 lít.
Giai đoạn 5: Thu hoạch khối tế bào
Thu hoạch SKTB là bước cuối cùng trong quy trình nuôi cấy. Thông
thường các hoạt chất được tích lũy chủ yếu trong tế bào, vì vậy phương pháp lọc
lấy tế bào là cách phổ biến để thu sản phẩm. Tuy nhiên, có một số trường hợp hoạt
chất lại được giải phóng ra ngoài môi trường trong quá trình phát triển. Vì vậ
y
việc thu hồi các hoạt chất mất nhiều công sức và chi phí tốn kém. Các hoạt chất
sau khi tách chiết sẽ được nghiên cứu tác dụng dược lí và bào chế các sản phẩm.
1.1.4. Yếu tố ảnh hưởng tới sự phát triển tế bào, hàm lượng hoạt chất
1.1.4.1. Thành phần môi trường nuôi cấy
hoạt chất acid rosmarinic. Kết quả cho thấy khi dùng với nồng độ 7,5% trong
môi trường nuôi cấy thì hàm lượng hoạt chất đạt 3,3 g/l. Trong khi nếu dùng
2,5% đường thì hàm lượng hoạt chất chỉ là 0,8%. Đối với SKTB rễ dừa cạn
(Catharanthus roseus) Knobloch and Berlin, 1980 cho thấy hàm lượng các
alkaloid nhân indole cao nhất khi nồng độ đường nuôi cấy nằm trong khoảng
từ 4 -12%.
Ngoài ra hàm lượng đường trong môi trường nuôi cấy còn gây ra áp
suất thẩ
m thấu, khi áp suât thẩm thấu tăng tác động vào tế bào sẽ kích làm
tăng tổng hợp các phytoalexin, những chất này sẽ kích thích sản xuất các sản
phẩm thứ cấp. Do và Cormier, 1990 [42] đã tạo tress áp suất thẩm thấu bằng
cách sử dụng đường và một số chất khác để làm tăng hàm lượng
anthocyanindin trong SKTB cây Vitis vinifera. Theo lí thuyết đó, Sakamoto et
al., 1993 khi nuôi cấy tế bào Aralia cordata nếu sử dụng nồng độ đường 3%
thì kích thích làm tăng hàm l
ượng hoạt chất. Tuy nhiên, nếu tăng nồng độ
đường tới 5% thì hàm lượng hoạt chất giảm. Vì vậy trong thực nghiệm phải
tối ưu hóa loại đường và nồng độ đường sử dụng nhằm đảm bảo cho tế bào
phát triển tốt nhất, hàm lượng hoạt chất cao nhất.
b/ Nguồn nitơ và các ion vô cơ
Nếu cây trồng tự nhiên cần các muối vô cơ như một yế
u tố thiết yếu để
sinh trưởng và phát triển thì để nuôi cấy thành công những tế bào chưa biệt
hóa ở một miếng mô được cắt ra từ cây, trong môi trường nuôi cấy cũng cần
phải có các muối vô cơ. Nuôi cấy tế bào thực vật đòi hỏi phải cung cấp đầy đủ
nguồn ni tơ và các ion vô cơ như phospho, kali, canxi, magnesi, mangan,
sulfua. Trong đó nguồn Ni tơ yêu cầu cung cấp với hàm lượng rất cao, b
ởi
đây là nguồn năng lượng thích hợp và có hiệu quả cho tế bào phát triển.
Nguồn ni tơ được đưa vào dưới dạng các muối amoni hoặc nitrat như
3
-
giảm.
9
Tuy nhiên nếu tăng lượng amoni quá cao có thể gây một số độc tính
cho tế bào và khi đó thí hàm lượng saponin lại giảm. Ngoài ra, các vi khoáng
chất như: Cu
2+
; Zn
2+
; Co
2+
; Mo
2+
; I
-
…. là những thành phần không thể thiếu
đối với tế bào thực vật. Các chất này đóng vài trò như là các coenzym tham
gia vào các quá trính sinh lí, sinh hóa của tế bào. Đặc biệt chúng tham gia vào
kích hoạt các enzym của quá trình sinh tổng hợp các hoạt chất.
c/ Vitamin
Những môi trường cơ bản mô tả ở trên gồm myo-inositol; acid
nicotinic; thiamin hydroclorid; pyroxin…. Vitamin đóng vai trò là các
coenzym tham gia các quá trình chuyển hóa của tế bào nên có tác dụng kích
thích sự phát triển của các tế bào. Nồng độ của myo-inositol trong môi trường
này là 100mg/l. Trong sự tăng trưởng củ
a các tế bào thực vật, các chất hữu cơ
đôi khi được thêm vào môi trường. Những phần phụ này bao gồm: acid amin,
Syschemic acquired resistance; ISR – Induced systemic resistance) tế bào để
chống đỡ lại các mầm bệnh (pathogens), khi các mầm bệnh tác động vào tế
bào, hệ thống tự bảo vệ này được khởi động. Những chất có khả năng kích
thích khởi động hệ thống tự bảo vệ này gọi là các elicitor. Tuy nhiên, trong
nhiều trường hợp elicitor là chấ
t không độc cho tế bào nó vẫn có thể tồn tại
cùng với tế bào. Vì vậy người ta có thể định nghĩa elicitor như sau: Elicitor là
những các chất có bản chất hoá học khác nhau từ nhiều nguồn gốc, có tác
dụng kích thích tạo các sản phẩm chuyển hoá thứ cấp để chống đỡ lại các
mầm bệnh khi xâm nhập vào tế bào thực vật, trong đó có việc kích thích làm
tăng tổng hợp các sản phẩm thứ
cấp.
Cơ chế hoạt động của elicitor là kích hoạt hệ thống tự bảo vệ theo cách
thức truyền tín hiệu: Elicitor gắn kết với receptor trên màng tế bào, các tín
hiệu của elicitor được truyền đi thông qua các chất truyền tín hiệu thứ cấp:
kênh ion, GTP-Protein; các phân tử oxy hoạt động, Inositol 1,4,5-
trisphosphates các enzym, các chất trung gian dẫn truyền kết qủa cuối cùng
kích thích sinh tổng hợp các sản phẩm chuyển hoá thứ cấp.
Sơ đồ
cơ chế tác dụng của elicitor
Elicitor được chia làm 2 loại
- Elicitor hữu sinh (biotic elicitor): Gồm các chất (nội sinh, hay ngoại
sinh) thu được có nguồn từ thực vật, vi sinh vật: nấm, dịch chiết các thực vật
+ Elicitor ngoại sinh (exogenous elicitors): bản chất là những thành
phần đã có hoạt tính elicitor.
+ Elicitor nội sinh (endogenous elicitors) là sản phẩm tương tác của chính
các yếu tố gây bệnh với tế bào thực vật sinh ra: đây thực chất là các elicitor thực
sự.
- Elicitor vô sinh:
+ Gồm các chất hoá học tổng hợp: Acid salicylic, acid Benzoic, acid
C.
b/ Thời gian nuôi cấy
Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng lớn tới lượng tế bào thu được và sự sinh
tổng hợp các chất chuyển hoá thứ cấp. Các tế bào sinh vật nói chung và tế bào
thực vật nói riêng trong công nghệ sinh khối đều có một đường cong phát
triển, đường cong này được chia thành 4 pha:
- Pha tiềm tàng hay còn gọi là pha thích nghi (lag phase) tại pha này,
các tế bào thực vật gần như không phát triển, nó chỉ thích nghi với điều kiện
và môi trường nuôi c
ấy mới.
- Pha phát triển (logarit phase or exponent phase) pha này các tế bào đã
trải qua thời gian thích nghi và bắt đầu phát triển với tốc độ theo hàm luỹ
thừa. Trong pha này, khối tế bào phát triển nhanh tạo ra một lượng lớn. Trong
giai đoạn này nếu cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng tế bào có thể phát triển
cực đại.
- Pha dừng (stationary phase): trong pha này các tế bào gần như không
phát triển và nhân lên nữa. Lượng tế bào trong môi trường tiến dần tớ
i hằng
định. Trong pha này các tế bào thực vật bắt đầu tổng hợp các chất chuyển hoá
thứ cấp, pha này càng dài, lượng hoạt chất trong khối tế bào càng cao. Vì vậy
cần phải cung cấp dinh dưỡng để duy trì sự tồn tại của tế bào trong pha này
nhằm kéo dài thời gian sinh tích lũy các sản phẩm thứ cấp.
12
A. Yari Khosroushahi và cs, 2005. khi khảo sát tối ưu hóa môi trường
nuôi cấy tế bào thông đỏ
(Taxus baccata) thấy rằng ngoài sử dụng các elicitor,
khi bổ sung 1% saccarose vào môi trường khi kết thúc pha phát triển thì hàm
lượng Taxol tăng gấp 16 lần so với nhóm chứng [80].
thích nghi lớn với sự thay đổi của pH. Trong môi trường nuôi cấy, pH có thể
được thay đổi bằng chính các tế bào thực vật để tối ưu hoá môi trường nuôi
cấy. pH có ảnh hưởng tới sự phát triển của tế bào và sự tổng h
ợp các chất
chuyển hoá thứ cấp. Theo W. M. van Gulik và cs trong nghiên cứu nuôi cấy tế
bào Nicotiana tabacum cho thấy khoảng pH thích hợp để nuôi cấy là 5,4-5,6
trong khi đó đối với Catharanthus roseus thì pH = 5,8 là tối ưu [
45].
d/ Nồng độ oxy hoà tan.
Sự phát triển của tất cả các tế bào hiếu khí nói chung đều cần sự có mặt
của oxy. Oxy cần thiết cho quá trình hô hấp của tế bào, phân cắt các phân tử
hữu cơ tạo năng lượng cho các quá trình phát triển của cơ thể sinh vật. Tốc độ
phát triển của tế bào thực vật càng cao càng cần nhiều oxy. Trong thực tế, các
tế bào thực vật phát triển tương
đối chậm, chính vì vậy nồng độ oxy cung cấp
cho tế bào không cần cao. Thông thường nồng độ oxy hòa tan thích hợp trong
môi trường nuôi cấy tế bào thực vật khoảng 20-40% [
36].
Nồng độ oxy quá cao cũng không ảnh hưởng nhiều tới tốc độ phát triển
của tế bào. Tuy nhiên khi nồng độ oxy quá thấp có thể gây chết tế bào. Trong
quy trinh sinh khối, giai đoạn nuôi cấy tế bào trên hệ thống các bioreactor nồng
độ oxy hòa tan đóng vai trò quan trọng. Theo Nguyễn Thành Trung và cs, 2006
khi nghiên cứu nuôi cấy tế bào sâm Triều tiên (Panax ginseng) cho thấy nồng
độ oxy hòa tan trong hệ thống bioreactor 15 lít phù cho tế bào phát triển tốt
nhất là 35- 40% [
63], [50].
Trong thí nghiệm nuôi cấy tế bào Lithospermum erythrorhizon của
Yasuhiro F
và cs (1985) mức nồng độ oxy hòa tan đã được sử dụng là 50% thì
scopolamine lên gấp hàng ngàn lần. Sikuli và cộng sự (1997) sau khi gây
nhiễm cây Datura stramonium với Agrobacterium rhizogenes đã nhận thấy
hàm lượng hyoscyamine ở rễ đạt c
ực đại 100 mg/l sau 6 tuần nuôi cấy .
Nhiều nghiên cứu cho thấy nuôi cấy callus và tế bào của cây
Catharanthus roseus có hàm lượng serpentin ngang với cây dược liệu bình
thường. Một số nghiên cứu đã phân lập được các dòng tế bào Cantharanthus
sản xuất serpentin và ajmalacine từ nuôi cấy in vitro. Bằng loại môi trường
sản xuất đặc biệt người ta đã đưa được sản lượng alkaloid của hai dòng tế bào
tốt nhất lên một mức cao hơn n
ữa, trong đó một dòng tạo được 162 mg/L
serpentin, còn dòng kia tạo được 72 mg/L serpentin cùng với 264 mg/L
ajmalacine. Mới đây, người ta đã hoàn thiện được công nghệ nuôi cấy tế bào
của cây C. roseus để sản xuất viblastine và vincristine là hai chất chống ung
thư rất mạnh, hiện đang để chữa ung thư máu.
Các steroid
Các Steroid là những hợp chất sử dụng nhiều trong ngành dược làm
nguyên liệu để bán tổng hợp các thuốc trợ tim, thuốc chống viêm gi
ảm đau,
các hormon tuyến thượng thận…Năm 1969 Kaul và cs đã nuôi cấy thành
công tế bào của cây Dioscorea deltoidea để sản xuất diosgenin 15
Một số chất khác
Thí dụ điển hình nhất là công nghệ sản xuất shikonin, một loại sắc tố đỏ
có khả năng diệt khuẩn, có trong rễ của cây Lithospermum erythrorhizon.
Bình thường shikonin tích lũy không nhiều trong rễ. Tuy nhiên, các nhà khoa
học Nhật đã tạo được dòng tế bào rễ cây Lithospermum có khả năng tích lũy
đến 15% shikonin và đã hoàn chỉnh công nghệ nuôi cấy tế bào sản xuất
nhụy nghệ tây (một loại gia vị có giá trị) cần phải có khoảng 150.000 hoa.
Hiện nay, người ta đã phát triển các phương pháp nuôi cấy tế bào của đầu
nhụy cây nghệ tây trong điều kiện in vitro để sản xuấ
t các callus có màu chứa
crocin và các crocetin.
Copyright: Tài liệu đại học ©