i
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN iii
DANH MỤC BẢNG iv
DANH MỤC HÌNH v
MỞ ĐẦU 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 Tổng quan phế liệu tôm 3
1.1.1 Thành phần, tính chất phế liệu tôm 3
1.1.2 Sản lượng phế liệu tôm 5
1.2 Hiện trạng công nghệ sản xuất Chitin – Chitosan từ phế liệu tôm 5
1.2.1 Tình hình nghiên cứu 5
1.2.2 Tình hình sản xuất thực tế ở Việt Nam 14
1.3 Tính chất của Chitin, Chitosan và ứng dụng 15
1.3.1 Khái quát chung về Chitin – Chitosan 15
1.3.2 Cấu tạo và tính chất của Chitin – Chitosan 16
1.4 Enzyme và ứng dụng trong công nghệ sản xuất Chitin – Chitosan 18
1.4.1 Khái niệm enzyme 18
1.4.2 Các enzyme được dùng để sản xuất Chitin – Chitosan 18
1.4.3 Các nghiên cứu ứng dụng enzyme trong sản xuất Chitin – Chitosan 18
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.1 Vật liệu 22
2.1.1 Nguyên liệu đầu tôm 22
2.1.2 Dụng cụ, hóa chất, enzyme protease 22
2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

3.7 Đề xuất quy trình sản xuất 45
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48
4.1 Kết luận 48
4.2 Kiến nghị 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 iii
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp của mình, trong thời gian qua cùng với sự nỗ
lực và phấn đấu không ngừng của bản thân em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ,
động viên và khích lệ của quý thầy cô, gia đình và bạn bè. Qua đây em xin chân
thành bày tỏ lòng biết ơn tới:
Toàn thể thầy cô, cán bộ thuộc Viện Công nghệ Sinh học & Môi trường,
Trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình thực
tập.
Thầy TS. Trang Sĩ Trung, trưởng Bộ môn Hóa - vi sinh, Khoa chế biến -
Trường Đại học Nha Trang đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn em trong suốt quá
trình thực hiện đề tài.
Thầy ThS. Nguyễn Công Minh, Bộ môn Hóa - vi sinh, Khoa chế biến -
Trường Đại học Nha Trang đã tận tình giúp đỡ em trong suốt thời gian làm đề tài.
Ban quản lý phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, phòng thực hành Hóa
Sinh – Vi Sinh, khoa Chế biến, trường Đại Học Nha Trang.
Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới tất cả người thân trong gia


thích hợp
25
2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ ủ thích hợp 26
2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian ủ thích hợp 27
2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH ủ thích hợp 28
2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ NaOH thích
hợp
29
2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian xử lý bằng
NaOH thích hợp
30 vi
2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khử khoáng bằng HCl 4% 31
2.9 Sơ đồ bố trí thí nghiệm deacetyl Chitin 32
2.10 Quy trình đối chứng theo phương pháp hóa học 32
3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Neutrase tới hiệu suất
thủy phân protein đầu tôm
35
3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ enzyme Neutrase tới hiệu
suất thủy phân protein ở đầu tôm
37
3.3 Ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất thủy phân
protein đầu tôm bằng enzyme Neutrase
38
3.4 Ảnh hưởng của pH tới hiệu suất thủy phân protein đầu

Chitin thu được từ quy trình hóa học có chất lượng kém do ảnh hưởng bởi nồng độ
hóa chất cao gây cắt mạch Chitin.
Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Nghiên cứu kết hợp quá trình ép và khử
protein bằng enzyme Neutrase trong công nghệ sản xuất Chitin – Chitosan từ
nguyên liệu đầu tôm thẻ chân trắng” được tiến hành nhằm nâng cao hiệu quả quy
trình sản xuất, khắc phục một số nhược điểm của phương pháp hóa học hiện nay.
2 Nội dung nghiên cứu của đề tài
- Phân tích thành phần cơ bản của nguyên liệu đầu tôm thẻ chân trắng trước
và sau khi ép.
- Xác định điều kiện thích hợp để thủy phân protein trong nguyên liệu đầu
tôm (ép) bằng enzyme Neutrase.
- Xác định chế độ khử protein còn lại bằng NaOH.
- Đánh giá chất lượng Chitin và Chitosan thu được. 2
3 Tính khoa học và thực tiễn của đề tài
Thành công của đề tài sẽ được áp dụng tại các cơ sở sản xuất Chitin với mục
đích tận dụng nguồn protein, astaxanthin từ đầu tôm, hạn chế sử dụng hóa chất
nhằm giảm ô nhiễm môi trường và sản xuất ra Chitin – Chitosan có chất lượng cao
ứng dụng trong các lĩnh vực quan trọng như y học, mỹ phẩm, thực phẩm,…. Đề tài
cũng là nguồn tài liệu hữu ích cho các nghiên cứu chuyên sâu về công nghệ sản xuất
Chitin – Chitosan.


Phế liệu tôm chủ yếu là đầu, vỏ và đuôi tôm, ngoài ra còn phần thịt vụn do
bóc nõn không đúng quy trình kỹ thuật. Tùy thuộc vào từng loài, sản phẩm chế biến
khác nhau mà lượng phế liệu tôm thu được khác nhau.
Trong phế liệu tôm, phần đầu thường chiếm khoảng 3545%, phần vỏ chiếm
1015% trọng lượng của tôm nguyên liệu. Tuy vậy tỷ lệ này còn phụ thuộc vào
giống, loài và giai đoạn sinh trưởng.
Thành phần chiếm tỉ lệ đáng kể trong đầu, vỏ tôm là Chitin, protein, canxi
cacbonat, sắc tố,… tỷ lệ giữa các thành phần này là không ổn định, chúng thay đổi
theo đặc điểm sinh thái, sinh lý, loài,…. Thành phần Chitin và protein trong vỏ tôm
khô chiếm khoảng 1127,5% và 23,353%.
Hàm lượng Chitin, protein, khoáng và carotenoid trong phế liệu vỏ tôm thay
đổi rất rộng, phụ thuộc vào điều kiện bảo quản cũng như phụ thuộc vào loài, trạng
thái dinh dưỡng, chu kỳ sinh sản. Vỏ giáp xác chứa chủ yếu là protein (30÷40%),
khoáng (30÷50%), Chitin (13÷42%). Theo Mayer (1986), thành phần hóa học của
phế liệu tôm được thể hiện trong Bảng 1.1
Bảng 1.1 Thành phần đầu và vỏ phế liệu tôm (%)
Phế liệu Protein Chitin Lipid Tro Calci Phospho
Đầu 53,5 11,1 8,9 22,6 7,2 1,68
Vỏ 22,8 27,2 0,4 11,7 11,1 3,16
- Protein: Trong phế liệu tôm thường là loại protein không hòa tan, do đó khó
trích ly khỏi vỏ, nó tồn tại dưới hai dạng:
+ Dạng tự do: Tồn tại trong các cơ quan nội tạng và các cơ gắn ở phần vỏ.
+ Dạng phức tạp: Liên kết với Chitin, CaCO
3
như một phần thống nhất của
vỏ tôm. 4


Từ đó, cần có chế độ xử lý thích hợp đối với nguồn phế liệu đầu, vỏ tôm để
thu được thành phẩm có chất lượng cao, như việc tách phần lớn protein trước khi
sản xuất Chitin – Chitosan bằng enzyme protease. Bên cạnh đó, còn có thể tận dụng
làm thức ăn cho chăn nuôi. Từ đó, vừa góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế, vừa
giảm thiểu ô nhiễm môi trường, đưa ngành thủy sản phát triển một cách bền vững. 5
1.1.2 Sản lượng phế liệu tôm [13]
Năm 2009, sản lượng tôm nuôi của châu Á đạt 2,83 triệu tấn, trong đó có
2,307 triệu tấn tôm chân trắng (Penaeus vannamei) và 522.000 tấn tôm sú
(P.monodon). Sản lượng tôm nuôi năm 2009 và triển vọng của năm 2010 tại một số
quốc gia nuôi tôm chủ yếu ở châu Á:
Trung Quốc, năm 2009 ước tính đạt sản lượng 1,2 triệu tấn tôm chân trắng,
trong đó có 560.000 tấn nuôi trong các ao ven bờ. Sản lượng nuôi tôm sú và các loài
khác trong họ tôm He (Penaeidae) như P.chinensis và P. japonicus là 150.000 tấn.
Năm 2010, ước tính tổng sản lượng tôm nuôi sẽ đạt 1,45 triệu tấn.
Thái Lan, năm 2009 sản lượng tôm nuôi ước tính của Thái Lan nằm trong
khoảng từ 520.000 đến 537.000 tấn. Từ năm 2010 đến 2012, ước tính sản lượng đạt
525.000 tấn năm 2010, tăng lên 551.000 tấn năm 2011 và 578.000 tấn năm 2012.
Việt Nam, từ cuối năm 2008 tới năm 2009 sản lượng tôm sú ước tính giảm
khoảng 40%.
Inđônêxia sản lượng tôm nuôi giảm, ước tính chỉ đạt 345.000 tấn. Năm 2010,
với việc khôi phục lại sản xuất từ các vùng nuôi tôm bị dịch bệnh ở Lampung,
Medan và Đông Java, dự tính sản lượng sẽ tăng lên 265.000 tấn tôm chân trắng và
120.000 tấn tôm sú.
Căn cứ vào tình hình trên cho thấy, năm 2009 sản lượng tôm trên thế giới và

một hoặc hai lần NaOH mà ta thực hiện như sau:
+ Đối với quy trình xử lý NaOH một công đoạn: Nồng độ NaOH cũng tùy
theo nhiệt độ và thời gian mà có thể thay đổi từ 35÷70%. Tỷ lệ hóa chất/nguyên liệu
thay đổi từ 5÷10 lần (v/w).
+ Đối với quy trình xử lý NaOH hai công đoạn thì vỏ tôm sau khi khử
khoáng, rửa sạch đem xử lý NaOH ở nồng độ 2÷5% sau khi rửa sạch, phơi tẩy màu
thu được Chitin. Chitin thu được có thể đem bảo quản hay sử dụng để sản xuất
Chitosan bằng cách xử lý với NaOH đặc ở nồng độ 35÷70% tùy thuộc vào nhiệt độ
và thời gian xử lý. Sản phẩm thu được có các chỉ tiêu cơ bản sau:
Độ ẩm : < 10%
Hàm lượng tro : 1 ÷ 1,5%
Chất không hòa tan : 20%
Độ nhớt : 200 ÷ 2.000 pcs
Độ deacetyl : 50 ÷ 95%
Hàm lượng protein : âm tính. 7
* Ưu điểm:
Thời gian xử lý vỏ tôm để thu Chitin nhanh: Theo tính toán để thu được
Chitin thường mất khoảng 36÷40 giờ, so với phương pháp sinh học thì phương pháp
hóa học nhanh hơn nhiều (thường xử lý bằng phương pháp sinh học mất khoảng
192÷360 giờ).
* Nhược điểm:
Sử dụng HCl và NaOH ở nồng độ cao sẽ ảnh hưởng đến độ nhớt của
Chitosan sau này, cụ thể hơn là gây cắt mạch Chitosan.
Lượng dịch thải ra trong quá trình sản xuất có tính acid hoặc kiềm, khả năng

Nhận xét:
Phương pháp xử lý kiềm một giai đoạn cho sản phẩm Chitosan có chất lượng
không kém so với quy trình thông thường với hai giai đoạn xử lý kiềm. Tổng thời
gian xử lý giảm nhiều, như vậy nếu so về mặt kinh tế thì đây là phương pháp tốt
hơn hẳn. Tuy nhiên phương pháp này vẫn còn nhược điểm là dung dịch NaOH đặc
sau khi deacetyl có màu sẫm gây khó khăn cho việc tái sử dụng.

V
ỏ tôm khô

V
ỏ tôm t
ươi

Ngâm HCl Ngâm HCl
Rửa trung tính
Khử protein, lipid
HCl 10%
t
o
phòng
t =5h
w/v = 1/10

HCl 10%
t
o

Rửa trung tính

Tẩy màu (KMnO
4
1%; Na
2
S
2
O
3
1,5% trong môi trường H
2
SO
4
10%)
Chitin

Ngâm NaOH 40% (tỷ lệ 1W : 1V; 24h; 80C)

Chitosan

Hình 1.2 Quy trình sản xuất Chitin – Chitosan, Trường Đại Học Nha
Trang
Nhận xét:
Quy trình tương đối đơn giản, cho chất lượng sản phẩm khá tốt, Chitin có
màu sắc đẹp.
Tuy nhiên, thời gian xử lý còn dài, nồng độ hóa chất còn cao, sử dụng nhiều
các chất oxy hóa, do đó dễ ảnh hưởng đến chất lượng và độ nhớt của sản phẩm sau
này.


C, tỷ lệ 1/5 (w/v)
NaOH 6%, 24h, 30

C,
t
ỷ lệ 1/5(w/v)

NaOH 70%, 72h, 30

C,
t
ỷ lệ 1/5(w/v)

Deacetyl 11
Nguyên liệu  khử khoáng, khử protein và deacetyl  sản phẩm Chitosan.
Trong phương pháp sinh học, các công đoạn khử khoáng, khử protein và
deacetyl không sử dụng hóa chất mà sử dụng hệ vi khuẩn, nấm men hoặc các
enzyme để loại bỏ protein, khoáng. Quá trình deacetyl được thực hiện bởi enzyme
deacetylase. Sản phẩm Chitosan thu được có chất lượng cao do không ảnh hưởng
nhiều bởi hóa chất.
* Ưu điểm:
Chất lượng sản phẩm thu được tốt do quá trình xử lý chỉ dùng acid và kiềm
nhẹ nên ít ảnh hưởng xấu tới chất lượng và môi trường. Ngoài ra, protein sau quá
trình ủ có thể thu hồi làm bột dinh dưỡng, thức ăn cho gia súc, các chất khác như

+ Theo Simpson và cộng sự (1994) [25] thì Chitosan cũng có thể được tạo ra
từ Chitin bằng cách sử dụng những enzyme vi sinh vật. Có thể khử gốc acetyl trong
Chitin bằng cách ủ xi lô Phycomyces blakesleeanus và Mucor rouxii, Absidia
coerulea. Những vi sinh vật có khả năng sinh ra enzyme deacetylase như:
Aspergillus niger, Mucor meehei, Phycomycetes nitens, Rhizopus acetoinus,
Rhizopus microsporus,…
1.2.1.3 Sản xuất Chitin – Chitosan bằng cách kết hợp phương pháp sinh học
với phương pháp hóa học
Quy trình sản xuất diễn ra theo các bước sau:
Nguyên liệu → xử lý lần I (phương pháp sinh học) → xử lý lần II (phương
pháp hóa học) → Chitin → deactyl → Chitosan.
Trong quy trình, nguyên liệu sau khi được loại bỏ các tạp chất sẽ được xử lý
lần I (khử khoáng và protein hoặc chỉ khử khoáng hay protein) bằng phương pháp
sinh học (như sử dụng enzyme hay vi sinh vật), tiếp đó là quá trình xử lý lần II, khử
phần protein và khoáng còn lại trong nguyên liệu bằng hóa chất (NaOH và HCl).
Sau quá trình trên thu được Chitin, tiếp tục deacetyl thu được Chitosan.
* Ưu điểm:
Chất lượng sản phẩm thu được tốt do quá trình xử lý chỉ dùng acid và kiềm
nhẹ trong thời gian ngắn nên ít ảnh hưởng xấu tới chất lượng của sản phẩm, đồng
thời giảm ô nhiễm môi trường do giảm lượng hóa chất sử dụng.
Giá thành rẻ do tận thu được chất có giá trị kinh tế như thu hồi protein làm
bột dinh dưỡng, thức ăn cho gia súc, các chất khác như lipid, các sắc tố cũng được
thu hồi trong quá trình sản xuất, giảm lượng hóa chất sử dụng và đặc biệt giảm
lượng chi phí lớn cho công tác xử lý ô nhiễm môi trường. 13

- Thời gian 12 giờ
- Nhiệt độ phòng
- NaOH 2%
- Thời gian 6 giờ
- Nhiệt độ phòng
- HCl 4% 14
Nhận xét:
Từ quy trình sản xuất cho thấy, thời gian để cho ra sản phẩm ngắn (khoảng
30 giờ), nồng độ hóa chất sử dụng thấp (NaOH 2%, HCl 4%), nhiệt độ thấp (50
o
C
trong quá trình thủy phân bằng enzyme và ở nhiệt độ thường với việc sử dụng hóa
chất). Bên cạnh đó lại có thể tận thu protein và astaxanthin góp phần làm tăng hiệu
quả kinh tế và giảm tác nhân gây ô nhiễm môi trường cùng với giảm một lượng
đáng kể nồng độ của những hóa chất độc hại gây tác động xấu cho Chitin và môi
trường. Do đó, chất lượng Chitin thu được rất cao và hiệu quả kinh tế thu được cũng
cao. Từ đây, mở ra một hướng nghiên cứu cho các nhà khoa học để có thể sản xuất
ra Chitin chất lượng cao và thân thiện với môi trường có thể ứng dụng trong sản
xuất ở quy mô công nghiệp.
1.2.2 Tình hình sản xuất thực tế ở Việt Nam
Mặc dù có nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước về phương pháp sản xuất
Chitin như hóa học, sinh học hoặc kết hợp hóa học và sinh học. Tuy nhiên cho đến
nay việc áp dụng các công nghệ sản xuất cải tiến gặp rất nhiều khó khăn, qua khảo
sát thực tế và các hội thảo về môi trường do các Bộ, Ngành tổ chức (sản xuất Chitin

phương pháp hóa học, các hóa chất sử dụng như HCl, NaOH, rất độc hại và được
sử dụng ở nồng độ cao, không những ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm mà còn
ảnh hưởng nhiều đến sức khỏe cộng đồng.
Vì vậy, nếu có thể kết hợp với phương pháp sinh học để tách bớt protein,
khoáng trước khi sản xuất Chitin thì có thể giảm đi một lượng lớn hóa chất sử dụng cần
thiết, đồng thời tận thu các chất có giá trị trong dịch thải như protein, astaxanthin,….Từ
đó cho ra sản phẩm Chitin – Chitosan có chất lượng cao, ngoài ra còn tận thu được
nguồn dịch thải có giá trị kinh tế và góp phần làm giảm tác nhân gây ô nhiễm môi
trường.
Tình hình trên cho thấy còn tồn tại nhiều bất cập trong việc sản xuất Chitin
hiện nay. Cần phải có các giải pháp cải thiện công nghệ, áp dụng sản xuất sạch
hơn, để giảm thiểu những tác động xấu, đồng thời cũng đem đến lợi ích cho doanh
nghiệp và cộng đồng.
1.3 Tính chất của Chitin, Chitosan và ứng dụng
1.3.1 Khái quát chung về Chitin – Chitosan
Chitin – Chitosan là polyme hữu cơ phổ biến trong tự nhiên, sau cellulose.
Trong tự nhiên Chitin tồn tại ở cả động vật và thực vật. Trong giới động vật, Chitin
là một thành phần cấu trúc quan trọng của vỏ một số động vật không xương sống 16
như côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn. Đặc biệt đối với động vật thủy
sản, nhất là trong vỏ tôm, cua, ghẹ hàm lượng Chitin chiếm tỷ lệ khá cao từ
1435% so với trọng lượng khô. Trong thực vật, Chitin có ở thành tế bào của nấm
Zygemycethers và một số tảo Chlorophiceae. Chitosan là sản phẩm biến tính của
Chitin, sau khi xử lý Chitin trong kiềm đặc nóng.
1.3.2 Cấu tạo và tính chất của Chitin – Chitosan

O
4
)
n

* Một số tính chất của Chitosan
Chitosan có dạng bột hoặc dạng vảy, màu trắng – vàng nhạt hoặc không
màu, có tính kiềm nhẹ.
Không hòa tan trong nước, trong dung dịch có tính kiềm, hòa tan được trong
dung dịch acid acetic loãng tạo thành dung dịch keo dương, nhờ có tính điện dương
mà nó không kết tủa khi có mặt của ion kim loại nặng. Chitosan còn được xem như
một polymecationic có khả năng bám dính vào bề mặt tích điện âm.
Phản ứng với acid đậm đặc tạo thành muối khó tan, Chitosan có tác dụng với
iod trong môi trường H
2
SO
4
cho phản ứng lên màu tím.
Không tác dụng với enzyme lyozyme, mà chỉ bị các enzyme của động vật
như bovin, canin phân giải thành D – Glucosamine.
1.3.2.3 Ứng dụng Chitosan
- Trong mỹ phẩm: Dùng làm phụ gia để tăng độ bám dính, tăng độ hòa hợp
sinh học với da, chống tia cực tím, làm mềm da, làm kem lột mặt,…
- Trong công nghiệp: Các kỹ nghệ làm giấy, chế biến gỗ, điện tử, mực in,
phim ảnh, Chitosan dùng làm phụ gia để tăng cường chất lượng sản phẩm.
- Trong xử lý nước thải: Chitosan dùng để xử lý nước thải trong công nghiệp
(tạo phức với các kim loại nặng độc hại) để lọc trong nước phục vụ tiêu dùng.
- Trong nông nghiệp: Chitosan chống lại các vi nấm và vi khuẩn gây bệnh
của môi trường xung quanh để bảo vệ thực vật, Chitosan còn dùng làm chất kích
thích sinh trưởng cây trồng, thuốc chống bệnh đạo ôn, khô vằn cho lúa.

1.4.3 Các nghiên cứu ứng dụng enzyme trong sản xuất Chitin – Chitosan
1.4.3.1 Nghiên cứu trong nước
* Nghiên cứu sử dụng enzyme Flavourzyme, Trang Sĩ Trung [15]
Phế liệu tôm được xay nhỏ đến kích cỡ 5 tới 6mm sau đó được đưa đi khử
protein bằng enzyme Flavourzyme ở điều kiện nhiệt độ 50
o
C, pH 6,5, tỷ lệ
enzyme/nguyên liệu 0,1% và thời gian thủy phân là 6 giờ. Sau khi thủy phân đem
lọc tách phần bã chứa Chitin, phần dịch chứa protein và astaxanthin. Phần dịch
được tận thu để thu hồi astaxanthin và protein. Phần bã được đưa đi xử lý và tách 19
phần protein còn lại bằng NaOH loãng (nồng độ 2%, thời gian 12 giờ, nhiệt độ
phòng) và tiếp tục khử khoáng bằng HCl (nồng độ 4%, thời gian 6 giờ, nhiệt độ
phòng), rửa trung tính, sấy thu được Chitin. Tiếp tục deacetyl Chitin bằng NaOH
(nồng độ 70%, thời gian 8 giờ, nhiệt độ 80
o
C) thu được Chitosan. Sơ đồ quy trình
sản xuất được mô tả trong Hình 1.6

Hình 1.6 Quy trình sản xuất Chitin – Chitosan kết hợp xử lý enzyme
Flavourzyme (Trang Sĩ Trung 1/2009)
* Nghiên cứu sử dụng enzyme Papain, Trần Thị Luyến [9]
Quy trình sử dụng enzyme papain cho sản phẩm có độ nhớt cao hơn các quy
trình khác. Đặc biệt độ deacetyl, độ tan và hiệu suất của quy trình có ưu thế hơn
hẳn. Nhưng để nâng cao chất lượng của Chitosan có thể sử dụng enzyme papain