i
LỜI CẢM ƠN

Khoá luận tốt nghiệp là bước cuối cùng đánh dấu sự trưởng thành của một sinh
viên ở giảng đường Đại học để đóng góp những gì mình đã học được cho sự phát triển
đất nước.
Trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Th.S Nguyễn Thị Kim Cúc và Th.S
Ngô Thị Hoài Dương đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy và truyền đạt kinh nghiệm và giúp
đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô giáo trong Viện Công Nghệ sinh học &
Môi trường. Thầy cô đã tận tình giúp đỡ, giảng dạy và truyền đạt kiến thức quý báu để
em có được nền tảng kiến thức vững chắc.
Con xin gửi tới bố mẹ sự biết ơn sâu sắc. Bố mẹ luôn bên cạnh động viên, ủng hộ
và yêu thương con nhất. Con sẽ luôn cố gắng sống tốt, xứng đáng với niềm tin yêu của
bố mẹ. Con xin cảm ơn bố mẹ!
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến chị Nguyễn Thị Minh Nhật – cán bộ quản lý
Phòng thí nghiệm Viện CNSH&MT, các bạn trong lớp 50CNSH đã quan tâm và nhiệt
tình giúp đỡ để bài luận văn được hoàn thành.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn.
Chúc tất cả mọi người sức khỏe và thành công!
Nha Trang, tháng 7 năm 2012
Sinh viên
Nguyễn Thị Chính

ii


1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân 18
1.3.3 Ứng dụng của enzyme protease 20
1.4 Tổng quan về enzyme Alcalase 21
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.1 Đối tượng nghiên cứu 22
2.1.1 Nguyên liệu đầu tôm 22
2.1.2 Hóa chất 22
2.2 Phương pháp nghiên cứu và xử lý số liệu 22
2.2.1 Phương pháp nghiên cứu 22
2.2.1.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 22
2.2.1.2 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu 23
2.2.2 Phương pháp xử lí số liệu 27
2.3 Bố trí thí nghiệm 27
2.3.1 Quy trình nghiên cứu ảnh hưởng của việc xử lí nhiệt đối với nguyên liệu
trước khi thủy phân 27
2.3.2 Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố thủy phân 29
2.3.3 Tối ưu hóa quá trình thủy phân protein đầu tôm bằng enzyme Alcalase 33
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35
3.1 Ảnh hưởng của xử lí nhiệt trước khi thủy phân và bổ sung enzyme alcalase
đến hàm lượng protein hòa tan của dịch thủy phân 35
3.2 Ảnh hưởng của xử lí nhiệt trước khi thủy phân đến khả năng chống oxi hóa
của dịch thủy phân 36
3.3 Ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng protein hòa tan của dịch thủy
phân protein đầu tôm 37
3.4 Ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân
protein đầu tôm 41
iv
Bảng 3.7 Kết quả phân tích sự tương thích của mô hình bậc hai đối với hàm lượng
DDPH bị khử 46
Bảng 3.8 Một số chỉ tiêu phân tích của dịch thủy phân protein từ phế liệu đầu tôm 48
Bảng 3.9 Thành phần acid amin của dịch thủy phân protein từ phế liệu đầu tôm
bằng enzyme Alcalase 49
vi
DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cơ chế hoạt động của chất chống oxi hóa [22] 11
Hình 1.3 Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein 16
Hình 1.4 Phân loại enzyme protease [8] 16
Hình 2.1 Sơ đồ bố trí trí thí nghiệm tổng quát 23
Hình 2.3 Sự bắt màu của phản ứng Biuret 24
Hình 2.5 Quy trình nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý nhiệt trước thủy phân 27
Hình 2.6 Quy trình xem xét ảnh hưởng của các yếu tố thủy phân 30
Hình 2.7 Quy trình thí nghiệm tối ưu 33
Hình 3.2 Ảnh hưởng của xử lí nhiệt ban đầu đến hàm lượng DDPH bị khử 36
Hình 3.3 Kết quả phân tích ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng protein hòa
tan của dịch thủy phân protein đầu tôm trên đồ thị Half-Normal 38
Hình 3.4 Phân tích ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng protein hòa tan trên
phần mềm DX8 39
Hình 3.5 Phân tích ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng protein hòa tan trên
phần mềm DX8 40
Hình 3.6 Kết quả phân tích Half-Normal đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến
khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân protein đầu tôm trên phần mềm DX8 41
Hình 3.7 Phân tích ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính chống oxi hóa của dịch
thủy phân bằng phần mềm DX8 42

Việt Nam. Đi đôi với việc tăng sản lượng tôm xuất khẩu là lượng phế liệu tôm thải
ra cũng tăng lên. Tuy nhiên, việc khai thác các sản phẩm có giá trị sinh học từ
protein đầu tôm chưa được đầu tư nghiên cứu nhiều ở nước ta, protein chủ yếu mới
chỉ được tận thu như một dạng sản phẩm phụ của quá trình sản xuất chitin để làm
thức ăn gia súc. Điều này không những gây lãng phí tài nguyên mà còn ảnh hưởng
lớn đến môi trường.
Min – Soo Heu và cộng sự (2003); Seymour & Li (1996) đã chỉ ra rằng dịch
thủy phân protein từ phế liệu đầu tôm có chứa thành phần acid amin khá cao và có
giá trị về mặt sinh học. Vì vậy, việc nghiên cứu tối ưu quá trình thu hồi các sản
phẩm có hoạt tính sinh học từ protein đầu tôm là rất cần thiết, vì không những vừa
nâng cao hiệu quả sử dụng tài nguyên mà còn góp phần khuyến khích cải tiến công
nghệ sản xuất chitin ở Việt Nam theo hướng thân thiện với môi trường.
Xuất phát từ những vấn đề trên đề tài “Tối ưu quá trình thuỷ phân protein
trên đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme Alcalase và đặc trưng tính chất của
dịch thuỷ phân” được thực hiện nhằm xác định chế độ thu hồi và đánh giá hoạt
tính sinh học của dịch thu được khi thủy phân đầu tôm bằng enzyme Alcalase, một
enzyme vẫn thường được dùng để thủy phân đầu tôm hiện nay, từ đó mở ra hướng
ứng dụng sản phẩm thủy phân này vào trong thực phẩm và thực phẩm chức năng. 2
Nội dung của đề tài:
 Đánh giá ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu trước thủy phân.
 Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng protein hòa tan và khả
năng chống oxi hóa của dịch thủy phân đầu tôm.
 Tối ưu quá trình thuỷ phân protein bằng enzyme Alcalase để thu dịch có
hoạt tính chống oxi hóa cao trên đầu tôm thẻ chân trắng.

4
Bảng 1.1 Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu tôm thẻ chân trắng
STT Thành phần Hàm lượng
1 Độ ẩm (%) 77,5 ± 1,2

2 Hàm lượng tro tổng số
a
(%) 24,6 ± 0,8

3 Hàm lượng chitin
a
(%) 18,3 ± 0,9

4 Hàm lượng protein
a
(%) 47,4 ± 1,8

5 Hàm lượng lipid
a
(%) 4,7 ± 0,3

6 Hàm lượng asthaxanthin
a
(ppm) 130 ± 13,9

a
: Tính theo chất khô tuyệt đối

chung và ở tôm nói riêng khá giống với enzyme có trong dạ dày của cá. Protease
của tôm không có dạng pepsin, chủ yếu ở dạng trypsin hoặc protease serin dạng
trypsin và có khả năng hoạt động rất cao. Ngoài ra còn có enzyme chymotrypsin,
astacine, collagenase…
Protease của tôm cũng như các loài động vật thủy sinh khác là các protease nội
bào, nó tập trung nhiều nhất ở cơ quan tiêu hóa, sau đó đến nội tạng và cơ thịt. Đặc
biệt ở tôm do đặc điểm hệ tiêu hóa nội tạng nằm ở phần đầu nên hệ enzyme sẽ tập
trung nhiều nhất ở phần đầu sau đó đến các cơ quan khác. Các enzyme có tác dụng
thủy phân protein, tính đặc hiệu rộng rãi, không chỉ thủy phân các liên kết peptide
mà còn thủy phân cả liên kết este, liên kết amin…. Phần lớn các enzyme thuộc
protease của tôm thường có tính chất chung của một protease:
- Hòa tan được trong nước, dung dịch nước muối sinh lý đệm phosphate
trung tính, đệm Tris-HCl và một số dung môi hữu cơ khác, nên dựa vào những đặc
tính này để tách chiết chúng.
- Bị kết tủa thuận nghịch bởi một số muối trung hòa (sulfate amonium),
ethanol, acetone…để thu nhận chế phẩm enzyme.
- Hoạt tính của enzyme có thể tăng hoặc giảm dưới tác dụng của các chất
hoạt hóa hay ức chế.
- Độ hoạt động của enzyme chịu ảnh hưởng rất lớn bởi các yếu tố: Nhiệt độ,
pH môi trường.
Trypsin: Có nhiều trong dịch vị tụy tạng, có tác dụng mạnh với các loại
protid có phân tử lượng thấp ở các mối liên kết peptide, amit, este. Trypsin từ ruột
tôm có pH thích hợp là 7,8 ở 38
o
C.

6

62
o
C, pH hoạt động tối ưu là 7,5 với nồng độ muối ăn NaCl thích hợp cho hoạt
động là 1%. Hoạt động của protease gan tụy và đầu tôm giảm khi có mặt của một số
ion kim loại, đặc biệt là Hg
2+
. Ion Mn
2+
làm tăng hoạt tính của protease tôm sú [2].
Trên thế giới, các nhà nghiên cứu cũng dành sự quan tâm đến khía cạnh này.
Doek S.N và các cộng sự cho biết protease của thịt tôm he Ấn Ðộ (P.inducus) là

7
một protease kiềm, hoạt động cực đại ở pH 8,0 bền với nhiệt, hoạt động phụ thuộc
vào ion kim loại [11].
Shann Tzong Jiang và cộng sự đã tách chiết được Cathepsin D từ một loài tôm
nuôi ở Ðài loan, đồng thời cũng xác định được nhiệt độ, pH tối thích cho enzyme
này hoạt động, cũng như các yếu tố hoạt hóa và ức chế [17], [18].
1.1.4 Các phương pháp thu nhận protein từ phế liệu tôm
Để tách protein hiện nay người ta dùng các phương pháp sau:
 Phương pháp cơ học
Sử dụng lực cơ học để tách một phần protein ra khỏi nguyên liệu vỏ, đầu tôm.
Đầu tôm còn tươi được rửa sạch, sau đó đem ép bằng trục lăn hoặc trục vít, thu hồi
dịch protein và bảo quản. Phương pháp này cho hiệu quả thu hồi không cao và
thường được dùng kết hợp với phương pháp khác.
 Phương pháp hóa học
Phương pháp này sử dụng NaOH với các nồng độ khác nhau để khử protein

dung dịch chứa protein về điểm đẳng điện của protein (pH = 4 – 5,5), sau đó dùng
các phương pháp lắng, lọc để thu hồi protein. Ưu điểm của phương pháp là đơn
giản, dễ tiến hành, có thể thu hồi với hiệu suất cao, có thể ứng dụng thu hồi protein
trong nước thải của các nhà máy chế biến thực phẩm và chế biến thủy sản.
1.1.5 Các nghiên cứu về việc thu hồi protein bằng enzyme
 Trên thế giới
Trên thế giới, vấn đề thu hồi protein từ phế liệu tôm bằng enzyme thủy phân
đã được nghiên cứu từ lâu (Simpson và Haard, 1985; Synowiecki và Al-Khateeb,
2000; Mizani và cộng sự, 2005). Các enzyme như Alcalase đã được sử dụng để thủy
phân protein từ phế liệu tôm (Chabeaud, Guerard, Laroque & Dufosse, 2007;
Mizani, Aminlari, 2005) và trypsin, papain, pepsin (Synowwiecki & Al-Khateeb,
2000; Chakrabarty, 2002), neutrase và protease (Rutanapornvareeskul, 2006).
Gildberg và Stenberg, 2001 thu được 68,5% protein từ phế liệu tôm Pandalus
borealis sau 2 giờ thủy phân với enzyme Alcalase.
Whenhong Cao và cộng sự, 2008 đã nghiên cứu thu hồi protein từ phế liệu đầu
tôm thẻ chân trắng bằng cách cho đầu tôm tự thủy phân, điều chỉnh nhiệt độ bằng
cách nâng nhiệt từ 40 – 70
o
C, cứ sau 30 phút thì tăng lên 5
o
C, giữ ở pH tự nhiên.
Kết quả cho thấy tại điều kiện nhiệt độ 40
o
C, 50
o
C, 60
o
C thì hàm lượng protein thu

9

chitin – chitosan người ta còn nghiên cứu thu hồi lượng protein có giá trị trong các
quy trình sản xuất chitin – chitosan.
Đặng Thị Hiền (2008) đã sử dụng enzyme Alcalase để thủy phân phế liệu tôm
và tận thu protein, asthaxanthin trong công nghệ sản xuất chitin – chitosan. Quá
trình được tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 54
o
C, 8 giờ, tỉ lệ enzyme bổ sung 0,22%,
pH 8, tỷ lệ nước/ nguyên liệu là 1/1. Kết quả thu được 52,7% protein.
Trang Sĩ Trung (2009) đã sử dụng enzyme Flavourzyme trong quy trình sản
xuất chitin nhằm tận thu hỗn hợp protein và asthaxanthin có tỷ lệ thu hồi hàm lượng
chất khô cao, tăng hơn 20%, chất lượng chitin, chitosan cao hơn so với phương
pháp hóa học truyền thống. Hỗn hợp protein và asthaxanthin thu được có chất lượng
cao thể hiện qua hàm lượng protein và thành phần acid amin, có thể ứng dụng trong

10
chế biến thức ăn gia súc. Ngoài ra còn giảm ô nhiễm môi trường so với phương
pháp hóa học.
Vũ Ngọc Bội, Vũ Thị Hoan (2004), đã sử dụng protease đầu tôm sú để cải
thiện khả năng chiết tách chất mùi từ phế liệu tôm và ghẹ.
Trần Lê Minh (2010), nghiên cứu sử dụng 3 loại enzyme Alcalase,
Flavourzyme và Protamex trong quá trình thu nhận phức hợp carotenoprotein từ phế
liệu đầu tôm.
Trần Thị Luyến và Đỗ Thị Bích Thủy (2006), cũng đã nghiên cứu sử dụng
Lactobacillus plantarum lên men đầu tôm sú để thu hồi chitin.
1.2 Tổng quan về chất chống oxi hóa
1.2.1 Khái quát chung về gốc tự do và chất chống oxi hóa
1.2.1.1 Gốc tự do, và sự oxy hoá.

đối với sức khỏe nói chung. Ngày nay có đến hàng nghìn nhà khoa học nghiên cứu
về vấn đề này.
Cơ chế hoạt động của chất chống oxi hóa như sau:

Hình 1.1 Cơ chế hoạt động của chất chống oxi hóa [22]
Chất chống oxi hóa liên quan đến công nghệ thực phẩm, ngoài ra còn liên
quan đến sinh học và y học bởi vì nó bảo vệ con người trước những tác hại của phản
ứng oxi hóa. Trong thực phẩm, chất chống oxi hóa thường được hiểu là chất ngăn
chặn các gốc tự do gây ra phản ứng oxi hóa lipid. Tuy nhiên trên thực tế gốc tự do
không những chỉ gây tác hại đến lipid mà còn cả protein, DNA, và các chất khác. Vì

12
vậy, chất chống oxi hóa được định nghĩa rộng hơn là tất cả những chất mà khi ta bổ
sung với một hàm lượng nhất định vào đối tượng dễ bị oxi hóa thì sẽ ngăn chặn
đáng kể phản ứng oxi hóa xảy ra [10]. Những đối tượng dễ bị oxi hóa ở đây bao
gồm thực phẩm, các tế bào sống, protein, lipid, DNA… Định nghĩa này nhấn mạnh
hơn tầm quan trọng của các chất chống oxi hóa.
Một số chất chống oxi hóa tự nhiên được kể đến như: acid ascorbic,
tocopherol, carotene, Flavanone và flavonol. Ngoài ra còn có các chất chống oxy
hóa tổng hợp thường được sử dụng là: BHT (Butylated hydroxytoluen), BHA
(Butylate hydroxyanisole), tocopherol tổng hợp, TBHQ (Tertbutyl hydroquinone),
dodecyl gallate, propyl gallate, ascorbyl palmitate…
1.2.2 Các phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa
Để xác định hoạt tính chống oxi hóa của một chất có nhiều phương pháp khác
nhau như: phương pháp dựa trên các phản ứng phức tạp, phương pháp dựa trên cơ
chất, phương pháp dựa trên những phân tử dò, hay dựa trên các điều kiện phản
ứng… Tuy nhiên, chúng có thể được chia thành 2 nhóm là HAT (Hydrogen Atom

động của thuốc thử đối với tyrosine (có chứa một nhóm phenol). Nhiều năm sau,
Singleton và đồng nghiệp mở rộng xét nghiệm này để phân tích tổng số phenol
trong rượu vang, kể từ sau đó người ta đã ứng dụng rộng rãi phương pháp này.
Phương pháp này được tiến hành bằng cách đun sôi trong 10 giờ hỗn hợp
sodium tungstate (NaWO
4
.2H
2
O, 100g), sodium molybdate (Na
2
Mo
4
.2H
2
O, 25g),
HCl (100ml), H
3
PO
4

85% (50ml), và H
2
O (700ml). Sau khi sôi, cho thêm vào hỗn
hợp lithium sulfate (Li
2
SO
4
.4H
2
O, 150g) tạo thành dung dịch thuốc thử FC có màu

vỏ tôm là các protein mà đơn phân là các acid amin chứa gốc phenol trong đó các
acid amin sắp xếp theo một qui tắc nhất định [19].
Năm 2007, bằng các test thử về khả năng chống oxi hóa, một nhóm các nhà
nghiên cứu đã phát hiện ra chất chống oxi hóa có trong Mungoong, một món ăn
truyền thống của người Thái được làm từ dịch chiết phế liệu tôm. Qua nghiên cứu
người ta nhận thấy rằng Mungoong chứa chất chống oxi hóa. Dịch hòa tan từ sản
phẩm này có hoạt tính chống oxi hóa cao nhờ các test thử DDPH, khả năng bắt giữ
các gốc tự do ABTS và FRAP. Hoạt tính chống oxi hóa phụ thuộc vào nồng độ dịch
hòa tan từ sản phẩm này [20].
Năm 2008, S.J.Li, T.A. Seymour đã nghiên cứu ứng dụng chất chống oxi hóa
được chiết từ vỏ tôm vào việc bảo quản một loại cá mú (thường sống ở các rặng san
hô) nhằm chống sự mất màu và oxi hóa lipid của loài cá này. Kết quả cho thấy rằng
dịch chiết bằng dung môi ethanol từ phế liệu tôm khi được bổ sung vào mẫu bảo
quản lạnh sẽ có khả năng ngăn chặn sự biến màu của cá và phản ứng oxi hóa lipid
cũng xảy ra ít hơn so với các mẫu đối chứng. Tuy nhiên, các dịch chiết này thể hiện
khả năng chống oxi hóa thấp hơn so với các chất chống oxi hóa tổng hợp.

15
Năm 2009, nhóm các nhà khoa học người Thái Lan đã nghiên cứu sản phẩm
lên men truyền thống tôm và giáp xác (Kapi, Koong – Som and Jaloo). Kết quả
nghiên cứu chỉ ra rằng sản phẩm lên men này có hàm lượng protein cao và hầu hết
các sản phẩm có hoạt tính sinh học, đặc biệt là khả năng chống oxi hóa tự nhiên và
rất tốt cho sức khỏe [14].
 Ở Việt Nam
Từ trước đến nay, ở Việt Nam đã có nhiều đề tài nghiên cứu thu hồi các sản
phẩm trên phế liệu tôm. Tuy nhiên hầu hết các nghiên cứu mới chỉ tập trung thu hồi
chitin – chitosan, chưa chú trọng đến việc tận thu các sản phẩm khác của phế liệu

chuyển axit amin.

Hình 1.2 Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein
Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4).

Hình 1.3 Phân loại enzyme protease [8]
Theo Barret và Donald (1956), Protease được phân chia thành hai nhóm lớn là
nhóm endopeptidase và nhóm exopeptidase.
Peptidase (Protease)
(E.C.3.4)
Exopeptidase
(E.C. 3.4.11-17)
Endopeptidase
(E.C. 3.4.21-99)
Aminopeptidase

thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của
EDTA.
 Nhóm 2: Exopeptidase. Các enzyme thuộc nhóm này có khả năng thủy
phân liên kết peptide ngoài cùng của chuỗi polypeptide hoặc đầu acid amin, hoặc
đầu cacboxyl, tuần tự tách acid amin ra khỏi chuỗi polypeptide. Dựa vào vị trí tác
động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại:
+ Aminopeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một
tripeptide.

18
+ Carboxypeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi
polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
- Protease acid: pH 2 – 4
- Protease trung tính: pH 7 – 8
- Protease kiềm: pH 9 – 11
1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân
Quá trình thủy phân protein tùy theo mức độ thủy phân, thời gian thủy phân
mà thu được peptide hay acid amin. Quá trình thủy phân phế liệu tôm bằng
protease có nhiều yếu tố ảnh hưởng:
 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Do bản chất của enzyme là protein nên sự thay đổi về nhiệt độ thường ảnh
hưởng tới hoạt tính enzyme và enzyme chỉ thể hiện hoạt tính cao nhất ở một giới
hạn nhiệt độ nhất định. Thông thường đối với đa số enzyme thì nhiệt độ thích hợp
nằm trong khoảng 40
o