Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
Chương 1. TỔNG QUAN VỀ CHITIN VÀ CHITOSAN
1. Lịch sử phát triển [16]
Danh từ chitin theo tiếng Hi Lạp nghĩa là lớp áo vỏ ngoài hay sự bao bọc,
được đề nghị bởi Odier vào năm 1832 khi tác giả tách được một polysaccharide từ
cánh cứng của bọ da. Tuy nhiên, polysaccharide này được phát hiện bởi Braconnot
(một giáo sư về lịch sử tự nhiên, giám đốc vườn Bách thảo và là thành viên của
Viện Hàn lâm Khoa học Nancy, Pháp) vào năm 1811 với tên gọi là “Fungi”.
Chitin rất phổ biến trong tự nhiên, nó được phát hiện ở trong động vật lẫn thực vật,
tham gia vào thành phần cấu tạo thành tế bào nấm (chiếm 3 - 5% trọng lượng
tươi), cấu tạo bộ khung xương của vỏ tôm, sam, cua, côn trùng, … Chitosan được
tổng hợp ngoài nguồn nguyên liệu chính từ chitin trong tự nhiên còn được tổng
hợp bằng cách nuôi cấy vi sinh vật.
Tới năm 1859, Rouget lần đầu tiên phát hiện ra chitosan (dẫn xuất của
chitin) khi ông đun sôi chitin trong KOH đậm đặc.
Năm 1878, Ledderhose đã viết nên phương trình phản ứng thuỷ phân giữa
glucosamine với acetic acid hình thành chitin.
Năm 1894, Gilson đã xác định sự hiện diện của glusosamine.
Năm 1989, Van Wisseling lần đầu tiên viết một cách tổng quan về chitin.
Năm 1906, Von Furth và Russo đã chỉ ra rằng chitosan hình thành muối
tinh thể với acid và bị kết tủa từ dung dịch acid bởi những tác nhân kết tủa là
kiềm.
Quá trình nghiên cứu về chitin, chitosan thực sự bắt đầu có hệ thống vào
năm đầu của thế kỉ XX. Vào năm 1950, chitosan được mô tả một cách rõ ràng như
một polymer của glucosamine và cấu trúc của chitin cũng được nghiên cứu, những
cuốn sách đầu tiên về chitin được xuất bản trong thập kỉ 50. Và cho đến nay,
chitin, chitosan là tên gọi quen thuộc với hầu hết các nhà hoá, sinh, … Hội nghị
khoa học đầu tiên ở vùng Châu Á Thái Bình Dương đã được tổ chức tại trường
Đại học Kebangsaan vào năm 1994 rất quan tâm đến tiềm năng sản xuất và ứng
dụng của chitin và chitosan của các nước Đông Nam Á.
Động lực chính cho sự phát triển và ứng dụng chitosan là nó được điều chế
Hình 1: Cấu trúc của chitin
Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
Cấu trúc mạng tinh thể của chitin:
Chitin tồn tại ở 3 dạng polymorphic. Hướng sắp xếp của các mạch thay đổi
hình thành 3 dạng cấu trúc , , .
- chitin:
- chitin:
- chitin:
Dạng - chitin là bền nhất và phổ biến nhất. Từ , - chitin có thể chuyển
hóa về dạng - chitin.
a. fomic
- chitin - chitin
Dd HCl 6M nguội
Dd LiSCN bão hòa
- chitin - chitin
Dạng , đều bền trong NaOH 1,25M; HCl 1,25M.
- chitin có nhiều ở phần cứng vỏ động vật.
, - chitin có nhiều ở vùng mềm và dai của động vật.
Trong tự nhiên, dạng liên kết của chitin thường là phức với protein và
polysaccharide. Liên kết protein- chitin được gọi là “Coralent”.
Chitin thường không tồn tại trong thiên nhiên như một chất riêng biệt mà
xuất hiện dưới dạng phức chất với nhiều chất khác như protein, polysaccharide (kể
cả cellulose). Chitin tinh khiết chỉ có trong vỏ gai (extracellular spine) của những
loài khúc tảo và trong phòng thí nghiệm sau quá trình xử lý để lọai các thành phần
khác. Thực tế ta chỉ khảo sát được chitin dưới dạng hợp chất có chứa chitin. Ngay
cả khi dùng chitin đã được làm sạch người ta vẫn không xem nó là một đơn chất vì
các mạch polime sẽ chứa một phần 2-amino-2-deoxy-D-glycopyranose và một
lượng đáng kể 2-acetamido-2-deoxy-D-glycopyranose.
Việc nghiên cứu thành phần của chitin được tiến hành dựa trên sự thuỷ
n
với n nằm trong khoảng 700 ÷ 4500.
Trọng lượng phân tử trung bình: 10000 – 50000 dalton.
Hình 2: Cấu trúc của Chitosan
Chitosan là sản phẩm biến tính của chitin, được tạo thành bằng cách loại
các nhóm acetyl từ phân tử chitin (quá trình deacetyl).
SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 4
Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
Trên mỗi mắc xích của phân tử chitosan có 3 loại nhóm chức, các nhóm
chức này có khả năng kết hợp với chất khác để tạo ra các dẫn xuất có lợi khác
nhau của chitosan. Bản chất điện ly được thể hiện khi các nhóm amin của chitosan
bị proton hoá trong dung dịch acid. Trong dung dịch acid loãng không có chất điện
ly, độ nhớt cũng tăng theo nồng độ của chitosan và kích thước của mạch phụ thuộc
vào sức căng ionic của chất trung gian và mức độ ion hoá. Tính mềm dẻo của
mạch tăng theo mức độ deacetyl hoá vì khi đó giảm liên kết hydrogen trong phân
tử chitosan.
Chitosan có tác dụng kháng vi khuẩn khá tốt, nhất là trên các vi khuẩn gây
bệnh như E. coli, Staphylococus aureus, Pseudomonas aeruginosa và tác dụng
diệt nấm nhất là nấm Candida albicans. Ngoài các tính năng trên của chitosan, các
dẫn xuất chitosan rất hấp dẫn trong các lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, sinh học
và bảo vệ môi trường.
Chitosan có khả năng hấp thu đáng kể một lượng lớn nước. Có 2 chỉ số
quan trọng nhất của chitosan là mức độ deacetyl hoá (DD) và trọng lượng phân tử
trung bình. Độ deacetyl hoá (DD) là độ chuyển hoá chitin thành chitosan. Thông
thường các chitosan có độ deacetyl hoá 85 – 95%, đặc biệt sản phẩm chitosan có
độ deacetyl hoá khoảng 45 - 55% tan tốt trong nước nên được gọi là chitin tan.
SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 5
Tách nhóm acetyl
trong chitin và
chitosan. Nếu sản phẩm có độ DA lớn hơn 50% (DD nhỏ hơn 50%) là sản phẩm
chitin còn nếu ngược lại là chitosan.
SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 6
Chitosan
Hình 3: Chitosan thương phẩm
Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
Chương 2. TÍNH CHẤT CỦA CHITOSAN [6, 11, 22, 23, 27]
Những tính chất chung của chitosan thương phẩm:
+ Kích thước hạt: 1 - 3 mm
+ Trọng lượng riêng biểu kiến: 0,15 – 0,05
+ Độ ẩm: 10%
+ Phần hòa tan trong kiềm và tro: 5%
+ Màu dung dịch: trắng hơi
vàng
+ Trọng lượng phân tử: 1,6.10
5
– 3.10
5
g/mol
+ Hàm lượng amin: 7 - 10%
1. Tính chất vật lý
Chitosan thương phẩm có dạng
vảy rắn, màu trắng hay vàng nhạt, không mùi vị.
Nhiệt độ nóng chảy: 309 - 311
o
C.
Cấu trúc vật lý:
Cấu trúc của chitosan thay đổi tùy thuộc cấu trúc của chitin nguyên liệu và
H
2
SO
4
đậm đặc, sự hòa tan xảy ra song song với sự sulphat hóa và thủy phân
chitin.
+ Trong các acid hữu cơ:
Chitosan hình thành muối tan được trong nước với một nhóm acid hữu cơ.
Những muối monocarboxylic acid lên đến hecxanoic dễ dàng hòa tan trong nước
khi hình thành với maloic acid đến nonane dioic acid đều hòa tan được trong
nước. Những nghiên cứu về muối của chitosan và các acid aromatic carboxylic
cũng cho thấy khả năng tan được trong nước như chitosan benzoate, chitosan o-
amino benzoate (chitosan anthranilate), chitosan p- amino benzoate và cũng có
một số muối không tan hoặc ít tan trong nước như chitosan phenylacetate … Còn
muối của chitosan và acid formic, acid acetic tan rất tốt trong nước.
+ Trong những dung môi hữu cơ:
Chitosan hòa tan một cách dễ dàng trong hỗn hợp DMF - N
2
O
4
với tỷ lệ
N
2
O
4
: chitosan = 3 : 1 cho những dung dịch có độ nhớt thấp và không xảy ra một
biến đổi hóa học nào của chitosan. Đây là dung môi hữu cơ được nghiên cứu đến.
Tính tương hợp với các dung môi:
Dung dịch chitosan trong dung dịch acid acetic có thể tạo một thể thống
nhất với các dung môi phân cực mà không gây ra sự tạo tủa chitosan. Dung dịch
Bảng 3: Kích thước phân tử chitosan trong dung dịch acid
Dung dịch acid Độ dài (A
o
)
CH
3
COOH 0,33M – NaCl 0,3M 30 - 230
CH
3
COOH 0,167M – NaCl 0,46M 73
CH
3
COOH 0,2M – NaCl 0,1M – Ure 4M 122
2. Tính chất hóa học
Trong phân tử chitosan có chứa các nhóm chức -OH, nhóm -NH
2
trong các
mắt xích D- glucozamin, do đó nó có thể tham gia các phản ứng hóa học đặc trưng
cho từng nhóm chức, tạo ra các dẫn xuất thế.
Mặt khác chitosan là một polime mà các monome được nối với nhau bởi
các liên kết -(1-4)-glucoside; các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất hoá
học như: axit, bazơ, tác nhân oxy - hóa và các enzim thuỷ phân.
Hình 4: Cấu trúc của Chitosan
Tính acid bazơ:
Chitosan là một bazơ.
Hằng số K
b
của nhóm amin thu được từ phương trình:
-NH
2
-NH
3
+
+ H
2
O
⇔
-NH
2
+ H
3
O
+
K
a
=
[ ] [ ]
[ ]
+
++
−
−
3
32
.
NH
OHNH
Và pK
a
= -logK
chitosan có mức độ deacetyl hóa khác nhau sẽ khác nhau như sau:
SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 10
Trong đó là mạng polime.
Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
Bảng 4: Mức độ hấp thu kim loại của chitosan
Chất nền Mức độ hấp phụ của ion kim loại x 10
3
mol.g
-1
Ni (II) Cu (II) Zn (II) Cd (II)
Chitosan
[0.55]
3,5 5,3 5,5 6,5
Chitosan
[0.03]
2,3 4,8 3,2 4,9
Kết quả cho thấy dung dịch chitosan có mức độ deacetyl hóa cao ([0,55])
thì mức độ hấp phụ các ion kim loại sẽ cao và mức độ này tùy thuộc vào từng loại
kim loại.
Phản ứng thủy phân trong môi trường acid:
Trong môi trường acid chitosan bị thủy phân nhưng mức độ thủy phân phụ
thuộc vào loại acid, nồng độ acid và một số các yếu tố khác như nhiệt độ, thời gian
phản ứng. Những kết quả cho thấy :
−Trong môi trường H
2
SO
4
, sự thủy phân chitosan kèm theo quá trình N-
nhiệt độ 5
o
C, sau đó trung hòa bằng dung dịch kiềm loãng. Sản phẩm thu được là
muối acid của chitosan nitrat.
SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 11
Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
O
O
O
2
NO
CH
2
ONO
2
O
3
N NH
3
NH
2
CH
2
ONO
2
O
O
O
2
2
O
O
CH
2
OSO
3
NH
3
NH
3
Phản ứng N-acyl hóa:
Ta có thể acyl hóa chitosan bằng các carboxylic acid, chẳng hạn như formyl
hóa chitosan bằng cách đun chitosan trong HCHO 100% ở 90
o
C.
Trong những trường hợp khác người ta thường cho chitosan phản ứng với
các carboxylic anhydric trong môi trường là hệ dung môi đồng tướng: CH
3
COOH
10% vol – Methanol; hoặc hệ: acid acetic : H
2
O : Methanol tỉ lệ 1 : 9 : 40.
Chitosan phản ứng với RCOOH tạo:
O
O
CH
2
OH
NH
Có 2 phương pháp để sản xuất chitosan là sử dụng hóa chất và enzym.
Phương pháp dùng hóa chất rất đơn giản, ít chi phí đầu tư nhưng ảnh hưởng không
tốt đến môi trường xung quanh. Ngược lại, phương pháp sử dụng enzym không
làm ô nhiễm môi trường, song phức tạp và đòi hỏi chi phí đầu tư cao. Hiện nay
trên thế giới, chitosan phần lớn được sản xuất bằng hóa chất, phương pháp dùng
enzym mới bước đầu đi vào ứng dụng ở một số nước. Theo thực tế nghiên cứu
điều chế cho thấy ở nước ta chưa thể điều chế chitin- chitosan theo phương pháp
sinh học, do các lý do sau:
+ Hiệu suất thu sản phẩm chitosan rất thấp, mặc dù hoạt tính enzym cao
nhưng chỉ có một phần nhỏ chitin tham gia phản ứng do độ tinh thể của vỏ cao, chỉ
có những nhóm acetyl của chitin nằm bên ngoài mới tiếp xúc được với enzym.
+ Việc sản xuất chitosan bằng enzym sẽ thành công khi và chỉ khi enzym
được phá tinh thể trước khi cho phản ứng deacetyl hóa. Mà thực tế, vấn đề các
phòng thí nghiệm trong nước chưa thực hiện được điều này do thiếu thiết bị máy
móc.
+ Điều chế chitosan theo phương pháp sinh học bằng cách sử dụng enzym
đòi hỏi phải có một nguồn cung cấp enzym thường xuyên và ổn định hay một môi
trường nuôi cấy enzym thích hợp. Điều này trong nước vẫn chưa thực hiện được.
Bên cạnh những bất lợi của phương pháp sinh học thì phương pháp hóa học
lại tỏ ra có nhiều lợi điểm hơn:
+ Quy trình sản xuất đơn giản, thiết bị rẻ tiền.
+ Hoá chất sử dụng rẻ tiền.
+ Chất lượng sản phẩm cao hơn do có thể thực hiện phản ứng ở nhiệt độ
cao hơn.
+ Hiệu suất thu hồi sản phẩm khá cao.
Tuy nhiên phương pháp hoá học cũng có những bất lợi cần quan tâm:
+ Vấn đề xử lý nước thải: phải xử lý nước thải trước khi thải ra môi trường.
SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 14
Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
40%
t=60-120
o
C
Chitin
Nước
Rửa
Deacetyl
hóa
Làm
nguội
Rửa
Nghiề
n
Bột
Chitosa
n
Hòa tan trong HCl
Kết tủa
chậm
Kết tủa nhanh
Vẩy Chitosan
50-60%
Chitosan
kết tủa
mịn
Chitosa
n
dd keo
Sấy
C trong 48h để phá vỡ cấu
trúc tinh thể của chitin, nhằm chuyển hầu hết chitin
trong vỏ thành dạng vô định hình. Sau 48h, vỏ được
lấy ra khỏi lò và đổ nhanh vào bể chứa nitơ lỏng
(-196
o
C) để làm nguội. Việc làm nguội nhanh sẽ hạn
chế được sự tái hình thành tinh thể chitin, làm chúng
trở nên vô định hình hơn. Ngoài ra trong quá trình làm
nguội, nhiệt độ của nitơ lỏng còn làm cho vỏ trở nên
rất giòn, dễ vỡ, giúp quá trình nghiền sau đó sẻ dễ
dàng hơn. Sau khoảng thời gian nhất định, lấy vỏ ra
khỏi dung dịch nitơ lỏng, nghiền bằng cối và chày. Có
thể thay dung dịch nitơ lỏng bằng hỗn hợp
methanol- nước đá khô.
2. Loại Protein:
Protein được loại bằng cách nấu với NaOH, nhiệt độ 60-100
o
C. Gần đây
các nghiên cứu mới được thực hiện với một khoảng rộng với các tác nhân như
NaOH, NaHCO
3
, KOH, K
2
CO
3
, Ca(OH)
2
, Na
2
SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 19
Hình 10: Nghiền vỏ bằng cối và chày
Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
Tiến hành: Cho hỗn hợp vỏ đã làm nguội vào dd NaOH 3,5% (tỉ lệ 1:10
w/v) ở 65
o
C. Sau 2h lấy phần nổi lên trên, rửa bằng nước cất và sấy khô ở 90
o
C.
Người ta có thể định lượng xác định lượng protein tách ra từ vỏ tôm.
Hình 11: Loại protein bằng cách đun với dung dịch NaOH
3. Loại muối khoáng:
Để khử khoáng có thể dùng các tác nhân acid như HCl, HNO
3
, H
2
SO
4
,
CH
3
COOH, HCOOH,… song người ta thường dùng HCl ở nhiệt độ phòng. Tùy
tính chất nguyên liệu mà thay đổi nồng độ acid và thời gian xử lý cần thiết. Ngoài
ra người ta cũng nghiên cứu quá trình khử EDTA ở pH kiềm. Nguyên liệu được
xử lý bằng EDTA ở pH9 hoặc pH10, sau đó xử lý ở pH3 sẽ cho sản phẩm có
khoảng 15% chất vô cơ chủ yếu là silicat.
Tiến hành: Vỏ tôm đã loại protein được cho vào dd HCl 1N (tỉ lệ 1:15
w/v) ở 25
o
SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 21
Hình 13: Thực hiện phản ứng deacetyl hóa chitin
Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
Bảng 6: Sự giảm khối lượng vỏ tôm qua từng công đoạn
Khối lượng
vỏ tôm ban
% so với ban đầu
Sau khi lọai
protein
Sau khi lọai
muối khóang
Sau khi lọai
nhóm acetyl
Sau khi thẩm
tích
1 g 67,53 40,46 33,38 19,85
10 g 69,58 33,55 29,78 15,08
Hình 14: Chitosan thu được từ một số loại vỏ giáp xác
Các yếu tố ảnh hưởng đến mức độ deacetyl hóa:
• Nhiệt độ
• Nồng độ dd NaOH
• Thời gian phản ứng
Tiến hành thí nghiệm khảo sát mức độ deacetyl hóa dung dịch chitosan ở
hai chế độ nhiệt độ 100
0
C và 120
0
C, hai nồng độ dung dịch NaOH 40% và 50%.
Kết quả thu được biểu diễn bằng đồ thị như sau:
C – dung dịch NaOH 40%, khối lượng phân tử trung bình của dung dịch
chitosan giảm chậm nhất. Điều này được giải thích là do nhiệt độ cao, nồng độ
NaOH lớn, mức độ deacetyl hóa càng lớn làm khối lượng phân tử trung bình của
dung dịch giảm và ngược lại. Ngoài ra, sự giảm nhanh khối lượng phân tử trung
bình được giải thích là do có sự cắt mạch phân tử chitosan khi phản ứng với dung
dịch NaOH ở nồng độ cao và nhiệt độ cao.
II. Phương pháp đánh giá chất lượng của chitosan [7, 11, 13, 16,
17]
1. Thử độ tinh khiết
Giới hạn polypeptide và acidamin:
Cân chính xác 1g chitosan nghiền mịn với 50ml nước cất. Đun sôi 10ph,
lấy dịch lọc trong (A). Lấy 5ml dịch lọc A thêm 3 giọt NaOH 10% và 1 giọt
CuSO
4
1% lắc đều. Không có màu xanh tím của phản ứng ure.
Lặp lại thí nghiệm để có dịch lọc A, cho vào A vài giọt dung dịch ninhydrin
0.1%, lắc đều. Dung dịch không có màu xanh tím.
Độ tro:
Cân chính xác 1g chitosan trong chén sứ (đã được nung đến khối lượng
không đổi). Nung trong lò ở 650
o
C đến khi được tro trắng và khối lượng không
đổi. Cân và xác định độ tro.
2. Xác định pH
Cân 10g chitosan nghiền mịn trong 100ml nước cất đun sôi, để nguội. Lọc
lấy nước trong, đem đi xác định pH bằng máy đo pH.
3. Xác định độ deacetyl hoá của chitosan
Có 4 phương pháp nhằm để xác định độ deacetyl hoá của chitosan đó là
phương pháp dựa vào phản ứng với phosphoric acid, phản ứng ninhydrin, phương
pháp dựa vào hàm lượng % đạm tổng số và phương pháp đo phổ hồng ngoại.
độ hấp thu của dung dịch thử.
3.3. Phương pháp dựa vào hàm lượng nitơ tổng số
Nguyên lý: Khi chitin chuyển hoá thành chitosan, gốc acetyl chuyển thành
gốc amin làm ảnh hưởng đến % nitơ tổng số. Dựa vào sự thay đổi % nitơ tổng số,
ta tính được DD (%).
SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 25
Copyright: Tài liệu đại học ©