ĐAMH: “Tổng quan về cellulose vi khuẩn và các ứng dụng của nó trong ngành CNTP”
MỤC LỤC
Danh mục các bảng
4
Danh mục các hình
5
Lời mở đầu

7
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ CELLULOSE VI KHUẨN
(BACTERIAL CELLULOSE – BC)

8
1.1. CELLULOSE VI KHUẨN
8
1.1.1. Nguồn gốc
8
1.1.2. Đònh nghóa
8
1.1.3. Cấu trúc
8
1.1.4. Phân loại
11
1.1.4.1. BC I
11
1.1.4.2. BC II
12
1.1.5. Đặc điểm
13
1.1.5.1. Tính tinh khiết
13

24
1.2.1.3. Đặc điểm hình thái của loài Acetobacter xylinum
25
1.2.1.4. Đặc điểm sinh lý của A. Xylinum
27
1.2.1.5. Đặc điểm sinh trưởng
27
1.2.1.6. Những đột biến trên Acetobacter xylinum
28
- Trang 2 -
ĐAMH: “Tổng quan về cellulose vi khuẩn và các ứng dụng của nó trong ngành CNTP”
1.2.2. Môi trường
28
1.2.2.1. Môi trường nước dừa
28
1.2.2.2. Môi trường rỉ đường
29
1.2.2.3. Môi trường nhân giống và lên men
31
1.2.3. Quy trình công nghệ sản xuất BC
32
1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng
33
1.2.4.1. Thành phần môi trường
33
1.2.4.2. Điều kiện lên men
39
1.2.4.3. Phương pháp lên men
41
1.2.5. Phương pháp thực hiện

2.3.1. Dạng chất mang dùng để cố đònh enzyme – Ứng dụng của BC
trong cố đònh enzyme glucoamylase
52
2.3.2. Dạng chất mang dùng để cố đònh vi sinh vật
57
2.3.2.1. Thuận lợi và khó khăn của tế bào cố đònh trên BC so với tế
bào tự do
57
2.3.2.2. Cố đònh Lactococcus lactis trên chất mang BC để thu nhận và
cố đònh bacteriocin
58
2.3.2.3. Cố đònh vi khuẩn Acetobacter xylinum trên BC để ứng dụng
sinh tổng hợp ra chính BC
59
2.3.2.4. Cố đònh tế bào vi khuẩn trên BC để loại acid trong rượu vang
bằng quá trình lên men malolactic
60
2.3.2.5. Cố đònh nấm men trên chất mang BC ở quá trình lên men
chính trong sản xuất rượu vang nho
62
Tài liệu tham khảo 67
- Trang 5 -
ĐAMH: “Tổng quan về cellulose vi khuẩn và các ứng dụng của nó trong ngành CNTP”
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. Đặc tính cơ học của BC và một số vật liệu hữu cơ khác 14
Bảng 2. Một số giống vi khuẩn có khả năng tổng hợp cellulose 23
Bảng 3. Đặc điểm sinh lý của A. Xylinum 26
Bảng 4. Thành phần nước dừa già 29
Bảng 5. Hàm lượng vitamin có trong nước dừa 29
Bảng 6. Thành phần rỉ đường ở nước ta 30


11
Hình 6. Phổ hấp thu
13
C-NMR của hai loại cellulose I
α
và I
β

11
Hình 7. Cấu trúc BC trong điều kiện nuôi cấy bề mặt

12
Hình 8. Mô hình cấu trúc cellulose II

12
Hình 9. Cấu trúc BC trong điều kiện nuôi cấy bề sâu

13
Hình 10. Găng tay bằng BC

15
Hình 11. Cellulose được hình thành trong lên men tónh

16
- Trang 7 -
ĐAMH: “Tổng quan về cellulose vi khuẩn và các ứng dụng của nó trong ngành CNTP”
Hình 12. Con đường tổng hợp cellulose trong A. xylinum

17

41
Hình 23. BC tạo ra trong điều kiện lên men tónh

43
- Trang 8 -
ĐAMH: “Tổng quan về cellulose vi khuẩn và các ứng dụng của nó trong ngành CNTP”
Hình 24. Cellulose được tạo thành trong điều kiện nuôi cấy tónh và có khuấy
đảo

45
Hình 25. Quá trình Ajinomoto

46
Hình 26. Trục quay dạng hình trụ và dạng đóa trong RBC

48
Hình 27. Thạch dừa

50
Hình 28. Kombucha

50
Hình 29. nh hưởng của thời gian cố đònh đến hoạt tính tương đối của enzyme
glucoamylase cố đònh.

55
Hình 30. nh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme glucoamylase cố đònh
và tự do.

56

Hình 38. Kết quả chụp SEM của mẫu chất mang BC sau khi cố đònh bằng
phương pháp hấp phụ- ủ, thời gian ủ 2 ngày.

65
Hình 39. Kết quả chụp SEM của mẫu chất mang BC sau quá trình lên men sử
dụng chất mang cố đònh bằng phương pháp hấp phụ- ủ, thời gian ủ 2
ngày

66
- Trang 10 -
ĐAMH: “Tổng quan về cellulose vi khuẩn và các ứng dụng của nó trong ngành CNTP”
LỜI MỞ ĐẦU
Cellulose là vật liệu sinh học rộng rãi nhất trên trái đất, có nhiều ứng dụng
quan trọng và có mặt khắp nơi phục vụ cho nhu cầu của con người hàng ngàn năm
qua. Cellulose được tổng hợp bởi rất nhiều sinh vật. Nó hình thành cấu trúc cơ bản
của vách tế bào hầu hết thực vật, nhiều loài nấm và một số loài tảo. Tuy nhiên,
các chủng vi khuẩn bao gồm Agrobacterium, Rhizobium, Pseudomonas, Sarcina và
Acetobacter [21] cũng có khả năng sinh tổng hợp cellulose nhằm mục đích tạo
màng bảo vệ tế bào.
Khác với bông vải và giấy, khi tinh chế sẽ làm giảm chiều dài của các chuỗi
cellulose, cellulose vi khuẩn không đòi hỏi quá trình xử lý để loại bỏ các polymer
không mong muốn và các tạp chất khác nên do đó giữ lại độ trùng hợp lớn hơn
(Nishi và cộng sự. 1990). Ở trạng thái tự nhiên, cellulose vi khuẩn có khả năng giữ
nước khá tốt, có khả năng giữ được hơn 100 lần trọng lượng của nó khi ở trong môi
trường nước. Thêm vào đó, cellulose vi khuẩn còn có độ bền cơ học cao và có thể
bò phân huỷ bởi một số nhóm vi sinh vật.
Ban đầu, quá trình sinh tổng hợp cellulose ngoại bào bởi vi khuẩn
Acetobacter xylinum được quan sát và nghiên cứu để làm sáng tỏ con đường sinh
tổng hợp cellulose, tuy nhiên sau này người ta chủ yếu tập trung vào nghiên cứu
những ứng dụng của cellulose vi khuẩn vào trong những lónh vực cụ thể như: thực

1.1.3. Cấu trúc:
BC là chuỗi polymer của các nhóm glucose liên kết với nhau qua các nối β-
1,4-glucan. Các chuỗi đơn phân tử glucan liên kết với nhau bằng liên kết Van der
Waals. Qua liên kết hydro, các lớp đơn phân tử này sẽ kết hợp với nhau tạo nên
cấu trúc tiền sợi có chiều rộng 1,5nm. Những tiền sợi này kết tinh lại tạo thành sợi.
Các sợi kết hợp với nhau tạo thành bó. Các bó sau đó kết hợp với nhau tạo thành
dải. Theo Zaar (1977) các dải này có bề dày từ 3 đến 4 nm, bề rộng từ 70 đến
80 nm. Theo Brown và cộng sự (1976) các dải này có kích thước là 3,2 x 133 nm,
còn theo Yamanaka và cộng sự (2000) là 4,1 x 177 nm, trong khi chiều rộng của sợi
- Trang 12 -
ĐAMH: “Tổng quan về cellulose vi khuẩn và các ứng dụng của nó trong ngành CNTP”
cellulose được tạo thành bằng phương pháp nghiền nhão gỗ của cây phong hoặc
cây thông thì lớn hơn theo thứ tự lần lượt là 1,4 - 4,0 x 10
-2
và 3,0 -7,5 x10
-2
mm.
- Trang 13 -
ĐAMH: “Tổng quan về cellulose vi khuẩn và các ứng dụng của nó trong ngành CNTP”
Nhiều dải cellulose có chiều dài từ 1 đến 9 nm tạo thành mạng lưới dày đặc
và ổn đònh nhờ những nối hydro bao quanh. [6, 7, 31, 50, 86, 77, 29]
Hình 1. Cấu trúc BC [31]
Hình 2. Liên kết hydro được hình thành giữa các đơn phân trong chuỗi BC
(Bielecki và cộng sự)
Hình 3. Liên kết hydro hình thành giữa các chuỗi BC (Bielecki và cộng sự)
- Trang 14 -
ĐAMH: “Tổng quan về cellulose vi khuẩn và các ứng dụng của nó trong ngành CNTP”
Những dãi siêu nhỏ của BC có chiều dài nằm trong khoảng 1-9 μm có chứa
từ 2000 đến 18 000 đơn phân glucose (Ross và cộng sự., 1991) hình thành nên một
mạng lưới cấu trúc dày đặc được giữ ổn đònh bằng những liên kết hydro. BC được

tinh khiết từ nguồn này. Cấu trúc của cellulose được tổng
hợp từ vi khuẩn A. xylinum chứa nhiều tinh thể I
α
hơn cellulose thực vật, hàm lượng
loại tinh thể này có thể lên đến hơn 60%. Tỉ lệ này có thể dao động trong khoảng
64% đến 71% tuỳ vào chủng vi sinh vật và nhiệt độ môi trường (Yamamoto &
Horii, 1994). Ngược lại I
β
chủ yếu có trong thành phần cellulose hình thành nên
thành tế bào của một số loài thực vật bậc cao như cotton và gai. Ở đó, cellulose I
α
chỉ chiếm khoảng 20%. Hai dạng thù hình này có thể được phân biệt dựa vào phổ
13
C-NMR.
- Trang 16 -
ĐAMH: “Tổng quan về cellulose vi khuẩn và các ứng dụng của nó trong ngành CNTP”
Hình 6. Phổ hấp thu
13
C-NMR của hai loại cellulose Iα và Iβ
Trong môi trường nuôi cấy tónh thường xuất hiện dạng BC I này [63], chúng
có đường kính từ 0,05-0,1
µ
m. Dù vẫn thường được sử dụng song phương pháp nuôi
cấy tónh thường cho sản lượng thấp và mang tính thủ công. BC tạo ra từ nuôi cấy
tónh thường có dạng màng dày trên bề mặt môi trường. BC tổng hợp theo phương
pháp nuôi cấy bề mặt thường có ưu thế ở việc dễ tạo màng và có độ chòu lực cao
[6, 7, 31, 36, 50].
Hình 7. Cấu trúc BC trong điều kiện nuôi cấy bề mặt
1.1.4.2. BC II:
Hình 8. Mô hình cấu trúc cellulose II [29]

700 lần trọng lượng của nó, trong khi gỗ hoặc bông về mặt vật lý phải được nghiền
nhỏ ra để làm cho chúng có khả năng giữ được nước [17], quá trình này ảnh hưởng
đến độ bền của cellulose. Một khi BC được hình thành trong một mạng lưới hút
nước và không cần xử lý, nó sẽ giữ những sợi nhỏ dài và độ bền cao của nó. Ngoài
ra có thể điều chỉnh độ xốp cũng như có khả năng chứa dung tích bề mặt cao. [31,
77].
 Khi thêm những cơ chất nhất đònh hoặc thêm một số chất phụ trong quá
trình tổng hợp BC có thể thay đổi những thuộc tính của BC. Ví dụ, sự thêm
Carboxymethyl cellulose (CMC) trong thời gian sự hình thành BC làm tăng thêm
khả năng giữ nước tới 1000 lần so với trọng lượng khô của nó [56].
1.1.5.3. Tính bền cơ học [31, 77].
Cellulose I có độ bền cơ học cao, sức căng lớn, trọng lượng nhẹ, kích thước
ổn đònh. Giá trò Young’s modulus của BC khoảng 30GPa, xấp xỉ 4 lần so với sợò
hữu cơ khác.
Bảng 1. Đặc tính cơ học của BC và một số vật liệu hữu cơ khác
Loại vật liệu Young’s modulus
(GPa)
Sức căng
(MPa)
Độ giãn
(%)
Bacterial cellulose 15-35 200-300 1.5-2.0
Polypropylene 1-1.5 30-40 100-600
PE-teraphthalate 3-4 50-70 50-300
Cellophane 2-3 20-100 15-40
1.1.5.4. Một số tính chất nổi bật khác:
 Màng BC được tổng hợp một cách trực tiếp vì vậy không cần qua các bứơc
trung gian trong quá trình sản xuất các sản phẩm ứng dụng BC ( sản xuất giấy từ
bột giấy, quá trình dệt không cần se chỉ…). Đặc biệt vi khuẩn có thể tổng hợp được
các loại màng siêu mỏng và các sợi siêu nhỏ. [6].

màng cellulose được hình thành ở bề mặt phân cách của dòch môi trường lỏng [16].
Khi màng cellulose được hình thành và được đẩy xuống phía dưới môi trường,
cellulose mới kết tinh sẽ nằm phía trên bề mặt của môi trường. Vì lý do này nên
lượng oxy ở phía trên rất hạn chế và chất dinh dưỡng khó khuếch tán lên phía trên
do màng càng lúc càng dày [84].
- Trang 20 -
ĐAMH: “Tổng quan về cellulose vi khuẩn và các ứng dụng của nó trong ngành CNTP”
1.1.7. Quá trình sinh tổng hợp cellulose ở A. xylinum :
 Để khẳng đònh tuyên bố rằng chỉ những tế bào gần bề mặt của môi trường
mới phát triển [16], Borzani và Souza (1995) đặt một sợi tóc lên trên bề mặt của
một màng cellulose đang được tổng hợp và theo dõi vò trí của sợi tóc khi màng
cellulose tiếp tục được tổng hợp. Những kết quả cho thấy rằng rõ ràng khoảng cách
giữa sợi tóc và đáy của màng mỏng không thay đổi, và cellulose được tổng hợp
thêm và vượt qua phía trên của sợi tóc. Điều này chứng minh rằng cellulose được
hình thành từ phần phía trên của màng cellulose, và vi khuẩn ở phần đáy của màng
thì không hoạt động [16,68].
 Ishikawa và cộng sự (1995) khảo sát mối quan hệ giữa sự tăng trưởng và
quá trình tạo thành cellulose bên trong môi trường nuôi cấy lắc. Một thí nghiệm
cho thấy rằng khả năng tạo thành cellulose tăng khi mật độ tế bào ngày càng tăng,
điều này dẫn đến kết luậân là sự tổng hợp cellulose có liên quan đến sự phát triển.
Sau đóù họ cố gắng thúc đẩy sự tăng trưởng và như vậy tăng thêm số lượng của BC
sản sinh ra.
Hình 11. Cellulose được hình thành trong lên men tónh
 Người ta cho rằng quá trình hình thành cellulose không bò chi phối bởi thời
gian của quá trình lên men nên những phân tử cellulose được tổng hợp có cùng
những thuộc tính như nhau. Ngược lại, độ trùng hợp trong BC gia tăng tỉ lệ thuận
với thời gian, và đã có những báo cáo về sự khác nhau về thuộc tính phân tử của
PC và BC (Marx-Figini, 1982). Người ta kết luận rằng quá trình sinh tổng hợp BC
chỉ xảy ra khi vi khuẩn tăng mật độ quần thể.
 Ross (1991) cho rằng các con đường biến dưỡng trong quá trình tạo thành

Quá trình sinh tổng hợp cellulose từ A. xylinum trên được chia thành hai giai
đoạn chính: giai đoạn polymer hóa và giai đoạn kết tinh.
1.1.8.1. Giai đoạn polymer hóa:
 Đầu tiên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hóa
chuyển glucose thành glucose-6-phosphate (Glc-6-P). Sau đó enzyme
phosphoglucomutase (PGM) tiếp tục chuyển hóa glucose-6-phosphate thành
glucose-1-phosphate (Glc-1-P) thông qua phản ứng đồng phân hóa. Glucose-1-
phosphate được enzyme UDP-Glucose pyrophospholyase chuyển hóa thành UDP-
Glucose. Cuối cùng, UDP-Glucose được polymer hóa thành cellulose và cellulose
được tiết ra môi trường ngoại bào nhờ một phức hợp protein màng là cellulose
synthase (Iguchi et al., 2000).
 Qua nghiên cứu các dạng vi khuẩn không có khả năng tổng hợp cellulose
cho thấy enzyme chủ yếu trong quá trình tổng hợp BC là UDP-Glc
pyrophosphorylase. Hoạt tính của enzyme này thay đổi giữa các chủng Acetobacter
xylinum. Acetobacter xylinum spp. sucrofermentans BPR2001, enzyme này có
hoạt tính cao.
 Một số vi khuẩn có khả năng sử dụng đường fructose hiệu quả hơn sẽ tạo
cellulose theo con đường sau: lúc này hệ thống enzyme phosphotransferase sẽ
chuyển fructose thành fructose–1-phosphate. Sau đó fructose-1-phosphate sẽ được
chuyển hóa thành fructose-1,6-biphosphate nhờ enzyme fructose–1-
phosphatekinase. Sau đó, enzyme phosphoglucose isomerase có hoạt tính cao, sẽ
giúp chuyển hóa fructose-6-phosphate thành glucose-6-phosphate. Tiếp theo
glucose-6-phosphate lại tham gia vào quá trình chuyển hóa tương tự như trên để
tạo ra cellulose (Iguchi et al., 2000).
- Trang 23 -
ĐAMH: “Tổng quan về cellulose vi khuẩn và các ứng dụng của nó trong ngành CNTP”
Hình 14. Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn (Iguchi et al.,
2000) [15]
Các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn:
• CS : cellulose synthase (EC 2.4.2.12).

sắp xếp thành hàng dọc chiều dài của tế bào (Ross et al., 1991). Các lỗ này chính
là các vò trí sinh tổng hợp cellulose trên bề mặt tế bào. Đây là những lỗ có đường
kính khoảng 3,5 nm sắp xếp song song theo đường thẳng dọc trục vi khuẩn. Mỗi lỗ
bao phủ một tiểu phần 10 nm chứa enzym tổng hợp cellulose. Mỗi tiểu phần 10 nm
tạo ra các chuỗi glucan hình thành vi sợi 1.5 nm.
Hình 15. Sự giải phóng cellulose ra môi trường ngoài từ A.
xylinum (Iguchi et al., 2000) [35, 11]
- Trang 25 -