Nhóm:1 GVHD:Cô Trần Thị Mai Anh
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HỒ CHÍ MINH
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM
Bộ môn Vệ sinh an toàn thực phẩm
Tiểu luận:
BACILLUS CEREUS
Nhóm thực hiện: 1
Lớp học phần:2105016
GVHD: Cô Trần Thị Mai Anh
 Thành phố Hồ Chí Minh – 10 / 2011 
1
1
Nhóm:1 GVHD:Cô Trần Thị Mai Anh

- Mục lục.
- Nhận xét của giáo viên hướng dẫn và danh sách nhóm.
PHẦN 1: LỜI MỞ ĐẦU
.PHẦN 2: NỘI DUNG
I.Giới thiệu chung về BACILLUS CEREUS.
1.Đặc điểm cấu tạo.
2.Đặc điểm nuôi cấy.
3.Tính chất sinh hóa.
4.Nguồn lây nhiễm.
5.Tính chất gây bệnh.
5.1.Độc tố.
5.2.Triệu chứng ngộ độc.
6.Cách phòng ngừa.
II.Tác hại khi nhiễm BACILLUS CEREUS.
1.Cơ chế sản sinh độc tố và các loại độc tố.
2.Cơ chế gây bệnh.
2.1.Triệu chứng nôn mửa.

ĐIỂM CHO TỪNG SINH VIÊN
STT MSSV HỌ TÊN NHIỆM VỤ ĐIỂM GHI CHÚ
1. 10264641 Trần Đông Phương Phần 1
2. 10259831 Đặng Trần Thị Trúc
Tiên
Phần 2/I/1,2,3,4
3. 10067621 Nguyễn Nhân Tín Phần 2/I/5,6
4. 10217411 Nguyễn Thị Kim
Ngân
Phần 2/II
5. 10283711 Phạm Thị Nguyệt Nhi Phần 2/II
3
3
Nhóm:1 GVHD:Cô Trần Thị Mai Anh
6. 10078591 Nguyễn Tuấn Huy Phần 2/III/1,2
7. 10205111 Lê Xuân Thanh Loan Phần 2/III/3+
Powerpoint+presentatio
n
8. 10274011 Trần Minh Thuận Phần 2/III/4
9. 10249121 Trần Thị Ý Yên Phần 3+Phụ lục
10. Powerpoint+presentatio
n
CAC BAN TIM HIEU VE NHUNG VAN DE SAU DE TRA LOI CAU HOI CUA LOP
1.VK KHONG TAO GIAP MO
2.VK DE MOC
3.MOI TRUONG NA, TSA, BA, MYP, MOSSEL, NB, TSB.
4.PHAN UNG VP (+)
5.PHOSPHOLIPID LA GI
6.AP XE
7.TRYPSIN, PEPSIN

khuẩn này rất dễ dính lên các nhóm thực phẩm như thịt, sữa, rau và cá. Triệu chứng
chính củaloại ngộ độc này là đại tiện ra nước và cơ bụng bị chuột rút khoảng sau 6-
15 tiếng kể từ lúc ăn phải. Triệu chứng này kéo dài khoảng 24tiếng. Nôn mửa cũng có
thể đi kèm nhưng thường hiếm gặp đối với loại ngộ độc gây tiêu chảy bởi Bacillus
cereus trọng lượng phân tử lớn.
Các bác sỹ đã ghi nhận được các biểu hiện lâm sàng đáng chú ý khác với những
người bị ngộ độc bởi loại vi khuẩn Bacillus cereus một khi không được chữa trị kịp
thời và triệt để. Đó là biểu hiện viêm vú, chứng viêm nhiễm nặng, hoại tử, viêm màng
não, nhiễmtrùng, viêm mô tế bào, viêm toàn mắt, áp xe phổi, viêm màng trong tim.
Đối với trẻ sơ sinh, thậm chí có nguy cơ gây tử vong.
Cách phòng cơ bản để khỏi nhiễm loại vi khuẩn Bacillus cereus là cần thận trọng khâu
chế biến thực phẩm và nấu nướng.
Về khả năng kiểm tra vi sinh vật Bacillus cereus ở Việt Nam, theo Cục An toàn thực
phẩm (Bộ Y tế), cả nước chỉ có 38 trung tâm y tế dự phòng tỉnh, chiếm 60% tỉnh
thành, có năng lực kiểm nghiệm. Viện ở 4 vùng miền đều đủ năng lực xét nghiệm loại
vi khuẩn này.
Từ 2001-2006, cả nước ghi nhận được hơn 5.600.000 ca tiêu chảy do nhiễm trùng
qua thực phẩm, trong đó có 84 ca tử vong. Riêng 9 tháng đầu năm ngoái ghi nhận
được hơn 750.000 ca tiêu chảy trong đó có 12 ca tử vong. Thựctế, theo các chuyên
gia, phải gấp ít nhất 10 lần con số được công bố.
Vì vậy, việc nghiên cứu các đặc điểm, cấu trúc của Bacillus cereus mang ý nghĩa đặc
biệt quan trọng trong việc phòng chống và chữa trị những trường hợp bị ngộ độc do
nhiễm Bacillus cereus.
Với phạm vi là một đề tài tiểu luận, nhóm chúng em chỉ đề cập đến Bacillus cereus
trong Bacillus nhóm 1.
PHẦN 2:NỘI DUNG
I .Giới thiệu chung về BACILLUS CEREUS.
5
5
Nhóm:1 GVHD:Cô Trần Thị Mai Anh

• Là loại vi khuẩn dễ mộc
• Hiếu khí và kị khí tùy nghi.
• Nhiệt độ 5-50oC, tối ưu 35-40oC.
• pH 4,5-9,3, thích hợp 7-7,2
• Trên môi trường NA hay TSA sau 24 giờ tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì.
• Trên môi trường BA tạo dung huyết rộng.
• Trên môi trường MYP (Mannitol Egg Yolk Polymixin): khóm hồng chung
quanh có vòng sáng.
• Trên môi trường Mossel (thạch cereus selective agar): khóm to hồng chung
quanh
• có vòng sáng.
• Trên môi trường canh NB, TSB: đục tạo váng, sau cặn lợn cợn
•
•
• Khuẩn lạc B.cereus trên
Khuẩn lạc B.cereus trên môi trường MYP
• môi trường Mossel
•
• 3. Tính chất sinh hóa.
• Trên môi trường đường: lên men
glucose trong điều kiện hiếu khí và kị
khí, không lên
• men mannitol.
• Khử nitrat thành nitrit.
• Phản ứng VP (+) .
• Phân giải Tyroxin .
• Catalase (+), Citrate (+) .
• Mọc trên NB + 0,001% lyzozym .
•
• 4.Nguồn lây nhiễm.

• Độc tố gây nôn mửa (Type 2): Emetic toxin. Vi khuẩn nhiễm trong gạo, cơm
nguội, đậu các loại. Bản chất độc tố là phospholipid có tính ổn định cao không
bị phân hủy ở nhiệt độ cao và dịch dạ dày.
• Ngoài ra vi khuẩn còn có enzyme hemolyzin là một protein gây độc mạnh có
thể gây chết người. Độc tố này có thể trung hòa bởi cholesterol trong huyết
thanh nhưng nó đã góp phần cho sự phát triển của vi khuẩn.
• Bacillus cereus có thể gây ra sự nhiễm trùng và nhiễm độc khác nhau như:
nhiễm trùng máu, viêm màng não và nhiễm trùng mắt.
• 5.2. Triệu chứng trúng độc.
• Thức ăn chứa mật độ vi khuẩn 10
5
vi khuẩn/g thực phẩm đủ gây ngộ độc.
• Biểu hiện: đau bụng, buồn nôn và nôn sau 1-5 giờ ăn phải thực phẩm nhiễm vi
khuẩn. Bệnh có thể kéo dài 24 giờ. Nếu ngộ độc do độc tố vi khuẩn, dấu hiệu
ngộ độc rõ hơn: nôn, mệt mỏi, nhức đầu, mạch nhanh…nếu không điều trị kịp
thời bệnh sẽ tiến triển nặng. Có 2 triệu chứng lâm sàng ngộ độc do Bacillus
cereus gây ra:
• Trường hợp nhiễm type 1 có triệu chứng đau bụng tiêu chảy nhưng
không sốt. Bắt đầu sau 4-16 giờ sau khi ăn thực phẩm nhiễm khuẩn và kéo dài
12-24 giờ. Tiêu chảy có thể là một khối lượng nhỏ hoặc dồi dào và chảy
nước. Loại này được gọi là "ủ bệnh dài" hay hình thức của bệnh tiêu chảy, và
nó tương tự như ngộ độc thực phẩm gây ra bởi Clostridium perfringens
• Trường hợp nhiễm type 2: Loại này được đặc trưng bởi buồn nôn và
nôn mửa và đau bụng và có một khoảng thời gian ủ bệnh là từ 1 đến 6 giờ, thời gian
kéo dài bệnh là 8 đến 10 giờ và trung bình là 9 giờ. Nó giống như Staphylococcus
aureus (tụ cầu khuẩn) gây ngộ độc thực phẩm trong các biểu hiện triệu chứng của nó
và thời gian ủ bệnh. Đây là "hình thức ủ bệnh ngắn" hoặc hình thức nôn của bệnh.
•
•
• Bảng so sánh độc tố type 1 và type 2

(2.2%). Ở Anh và xứ Wales, có đến 468 trường hợp từ 1990 đến 1995. Bacillus
cereus là một thực vật hoại sinh trong đất rất phổ biến. Nó được phân lập từ
nhiều nguồn thực phẩm đa dạng, đặc biệt là thực phẩm có nguồn gốc từ thực
vật, từ thịt, các và các sản phẩm từ thịt cá cũng vậy. Phát hiện đầu tiên các về
các mầm bệnh gây ngộ độc thực phẩm là từ năm 1949 khi Hauge đã phân lập
mẫu từ xốt vani sau khi có một ca ngộ độc thực phẩm gây tiêu chảy tại bệnh
viện ở Oslo, Norway. Xốt vani được nấu trước khi tiêu thụ và bảo quản ở nhiệt
độ phòng cho đến khi sử dụng. Để khẳng định Bacillus cerus là nguyên nhân
gây ngộ độc, Hauge đã phát triển mẫu phân lập đến nồng độ khoảng 4x106ml-1
và uống 200ml cocktail. Sau 13h, ông cảm thấy đau bụng và đi tiêu ra nhiều
nước, triệu chứng này dai dẳng khoảng 8h. Hơn 20 năm sau, một triệu chứng
gây ngộ độc thực phẩm khác do chủng Bacillus cereus gây ra lại xuất hiện ở
các công nhân người Anh. Triệu chứng này nặng hơn triệu chứng nôn mửa và
kéo dài một thời gian ngắn (chưa đến 5h), điều này cho thấy rằng đây là một sự
nhiễm độc. Ngày nay, bệnh này liên quan đến triệu chứng gây nôn mửa do
Bacillus cereus.
• Bacillus cereus có thể gây ra sự nhiễm trùng và nhiễm độc khác nhau, thêm
vào đó, những ngộ độc khác do Bacillus cereus gây ra là sự nhiễm trùng máu,
viêm màng não, và nhiễm trùng mắt. Hai loại ngộ độc thực phẩm là nguyên
nhân bởi rất nhiều nhấn tố gây độc hại khác nhau.
• 2. Cơ chế gây bệnh.
• 2.1 Triệu chứng nôn mửa.
• Đặc điểm của bệnh nôn mửa và tính chất của độc tố gây nôn mửa được thể hiện
ở bảng 1-1. Sự giải thích về cấu trúc của độc tố emetic đã đưa đến những hiểu
biết sâu sắc hơn về triệu chứng này. Độc tố emetic có tên là cereulide và là một
chuỗi polypeptide ba lần lặp lại của bốn amino và/hoặc oxy-acid (bảng 1-1)
•
• Cereulide (polypeptide) là tên của một độc tố quan trọng gây ra triệu chứng
nôn mửa do Bacillus cereus sản sinh ra. Bài báo này giải quyết được nghiên
cứu về quá trình sinh tổng hợp độc tố này dựa trên sự bất thường của độc tố


Khoảng thời gian mang bệnh 6-24h

Sinh kháng thể Không (none)

Hoạt động sinh học trên người Gây nôn

Cơ quan nhận cảm 5-HT3

Cytotoxic No

Hoạt động trên tế bào HEp-2 Hoạt động không bào

Khả năng chịu nhiệt 90 phút ở 121
0
C

Ảnh hưởng của sự phân giải protein Không

Việc sản sinh ra độc tố như thế nào (not known, but probably enzymatically)
và sự tính toán cơ học các phân tử được biểu thị ở hình 1. Độc tố này là nguyên
nhân dẫn đến sự hình thành các ty lạp thể có chứa ATP và các enzyme lien
quan đến hoạt động chuyển hóa tế bào trong các mô khác nhau. Chúng ta bắt
đầu quan tâm đến con đường sinh tổng hợp của độc tố này cho các chương
trình phòng chống ngộ độc thực phẩm trong tương lai. Nghiên cứu quá trình
sinh tổng hợp tương tự như dodecadepsipeptide, valinomycin. Agata – một
trong nhiều tác giả đã nghiên cứu quá trình phát triển và sinh độc tố của
Bacillus cereus trong quá trình tổng hợp trung gian một cách đầy đủ từ CADM
(hỗn hợp các amino acid) và đường sucrose (đường mía). Người ta nhận thấy
rằng, Bacillus cereus cho phép (chấp nhận) việc sản sinh ra cereulide cấu trúc

(J=5 Hz). Cả hai kết quả trên đều chỉ ra được sự kết hợp cao cacbonyl cacbon
của13C tiền thân của các amino acid đối với L-O-Val và cả L-Val. Chưa có kết
quả chính xác nào về sự kết hợp của13C, tuy nhiên trường hợp này lại đúng đối
với Ala và O- Leu. Sự chiếu xạ gốc metyl của Ala ở 1.47 ppm gây ra α-H của
nó (4.27 ppm) giống như sự pha trộn của bộ ba và bộ kép biểu kiến với J=4 và
5 Hz, theo thứ tự định sẵn (tách biệt ra) có nghĩa là tỷ lệ sát nhập lại để tạo
thành cacbonyl cacbon là không quá cao (không đạt đến 100%). Sự chiếu xạ
của β-Hs của O-Leu trong khoảng 1.84 ppm là không đạt kết quả bởi vì dải
sóng tự nhiên của nó quá rộng. Tuy nhiên, quang phổ NMR của13C và những
thí nghiệm riêng lẻ là những minh chứng gần như 100% của sự kết hợp13C tiền
amino acid với 3 hợp phần (O-Leu, Val và O-Val) của cereulide.
•
• Figure 5.Decoupling experiments of a protons of the four components by irradiating b
protons.
• Một phần trăm sự kết hợp của13C là được xác định bởi phép đo phổ từ các sản
phẩm thủy phân cereulide, vì vậy hai dipeptide thu được từ sự thủy phân bằng
kiềm cereulide (1) với 0.1N KOH (hoặc 1N NH4OH) ở rt trong 30 phút. Các
sản phẩm thủy phân dipeptide là D-O-Leu-D- Ala và L-O-Val-L-Val, được
phân tích bằng phương tiện ESI (electrospray ionization)- thước MS/MS ở trên
Q-TOF của phép đo phổ (Mcro Mass Co.,Ltd, Manchester, UK). Để làm được
điều này các chất đồng vị thừa và13C kết hợp lại với nhau thành mẫu, pha
loãng mẫu đó đến độ hòa tan 10-100 pmol/μL trong 99,8% methanol: 0.2%
acid formic trước khi bị electrospray ở 5μL/phút.
• Ngày nay, L-Leu và L-Ala đã được chứng minh để xác định rõ là có được từ
quá trình sinh tổng hợp cereulide, vì hai acid amin này là cần thiêt cho B.
cereus. Một trong những khả năng có thể được nghiên cứu là cả ba L-amino
acid sẽ ít nhất một lần được biến đổi thành các α- keto acid và sau đó biến đổi
thành D-O-Leu và L-O-Val hoặc là sự chuyển hóa amin để tạo thành D-Ala.
Trong trường hợp này chỉ có acid pyruvic sẽ bị pha loãng bởi vì số gốc cao vì
L- Ala là không cần thiết cho B. cereus. Nghiên cứu này có thể giải thích đến

Liều gây nhiễm 105/g hoặc /ml
Độc tố được sản sinh ra Trong ruột non
Loại độc tố Protein
Thời kỳ ủ bệnh 8 – 16h
Khoảng thời gian mang bệnh 12 – 24h
Triệu chứng Đau bụng dai dẳng, đi êu nhiều nước, thỉnh thoảng
buồn nôn
• Bào tử của Bacillus cereus từ mô tả đầu tiên ở trên (phần giới thiệu chung) là
được phân biệt để cho thấy rằng chúng có khả năng bám vào các tế bào Caco-2
(trên các tế bào biểu mô của người). Sau khi bám vào, các bào tử này nảy mầm
một cách nhanh chóng (trong vòng 1h), hình thành tế bào Bacillus cereus sinh
dưỡng trên đỉnh của các tế bào biểu mô, tiếp đó là sản sinh ra độc tố, nếu độc tố
này xuất hiện trong đường ruột, độc tố đường ruột sẽ tập trung khoanh vùng ở
vùng ngoại biên của ống ruột sẽ tăng cao hơn trong lumen và vì vậy gây nên
mối nguy lớn hơn và gây bệnh một cách trầm trọng. Một điều có thể xảy ra đối
với cơ chế này là thời gian ủ bệnh sẽ lâu hơn như đã quan sát.
• Số lượng và loại độc tố liên quan đến triệu chứng tiêu chảy do ngộ độc thực
phẩm từ Bacillus cereus là đề tài tranh cải từ nhiều năm qua và cho đến nay
vẫn còn đang tranh luận. Cả dạng đơn và dạng phức của độc tố đường ruột
được xác định là nguyê nhân gây ra bệnh tiêu chảy. Có hai sự khác biệt trong
ba hợp phần của độc tố đường ruột được sản sinh bởi các thực phẩm nhiễm
Bacillus cereus, một số nhóm cũng được mô tả độc tố đường ruột một hợp
phần với các phân tử trọng lượng khoảng từ 40 – 100 kDa
• Những nghiên cứu gần đây về độc tố đường ruột đã khẳng định rằng cả độc tố
chỉ có một hợp phần và độc tố nhiều hợp phần đều có liên quan.
• Những nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp giúp thiết lập nên các giải pháp
ngăn ngừa các độc tố sinh ra từ Bacillus cereus trong tương lai gần. Hoặc có
thể đưa ra các phương pháp giúp phát hiện ra độc tố cereulide trong tự nhiên
bất cứ lúc nào.
• III.Các phương pháp phát hiện BACILLUS CEREUS trong thực phẩm.

• 3.2.Các phản ứng khẳng định:
• Nhuộm Gram:
• Cấy ria các khuẩn lạc được chọn từ môi trường MYP/MOSSEL sang ống thạch
dinh dưỡng -> ủ ở 30oC/ 24h -> nhuộm Gram -> quan sát dưới kính hiển vi tế
bào nhuộm bằng vật kính 100X nhúng trong dầu.
• Các bước nhuộm Gram:
• Chọn phiến kính sạch -> vẽ lên kính 1 vòng tròn, đường kính 2cm -> ở vị trí
tương ứn với vòng tròn, mặt còn lại nhỏ vài giọt nước cất thành 1 giọt lớn ->
chuyển một ít sinh khối khuẩn lạc vào giọt nước trên kính bằng que cấy vòng
-> khuấy nhẹ bằng đầu que cấy -> dung dịch huyền phù đồng nhất -> bôi đều
trong khu vực của vòng tròn -> để yên cho vệt bôi khô -> đưa phiến kính ở vị
trí cạnh vệt bôi qua lại trên ngọn lửa đèn cồn/đèn Bunsen để cố định vệt bôi
(tránh để vệt bôi tiếp xúc trực tiếp với ngọn lửa)
• Tương tự cho hai chủng VSV đối chứng trong cùng một phiến kính khác:
E.coli làm chủng
• đối chứng cho Gram (-) và Staphylococcus aureus làm chủng đối chứng cho
Gram (+).
• Có hai phương pháp nhuộm Gram:
• Phương pháp Jensen: nhỏ vài giọt dd methy violet lên vệt bôi -> giữ yên
20giây -> dùng bình xịt nước lên vệt bôi -> rửa sạch phẩm nhuộm -> nhỏ vài
giọt KI/I2 lên vệt bôi/ để yên 1phút -> dùng bình xịt cồn 95% lên vệt bôi -> rửa
phẩm nhuộm đến khi mất màu -> để yên vài giây -> rửa bằng nước -> nhuộm
bằng dd safranin/30giây -> rửa sạch bằng nước, thấm nước dư bằng giấy lọc.
• Phương pháp Hucker: tương tự như phương pháp Jensen, nhuộm vệt bôi bằng
dd crystal violet/ 1 phút -> rửa bằng nước -> nhuộm bằng dd KI/I2 / 1 phút ->
khử màu bằng cách xịt cồn 95% -> rửa lại bằng nước -> nhuộm màu bằng dd
safranin/2phút.
• Kết thúc qui trình nhuộm, quan sát dứơi kính hiển vi cho ta thấy tế bào nhuộm
Gram (+) có màu xanh tía (S.aureus), tế bào nhuộm Gram (-) có màu đỏ hồng
(E.Coli). Bacillus cereus là trực khuẩn lớn, Gram (+), thường kết hợp với nhau

ngoài ra acetoin còn bị oxi hóa thành diacetyl, chất này tham gia vào phản ứng
tạo màu trong thử nghiệm VP.
• Như vậy, thử nghiệm VP có thể giúp phân biệt các loài trong
Enterobacteriaceace dựa trên sự oxi hóa acetoin (acetylmethylcarbinol, AMC)
từ 2,3-butanediol thành diacetyl. Sự oxi hóa acetoin thành diacetyl được tăng
cường nhờ xúc tác của α-naphthol. Diacetyl kết hợp với nhân guanidine có
trong peptone kết tụ thành phức diacetyl-guanidine có màu đỏ. Trong thuốc thử
Koblentz và O’Meara có chứa creatine có tác dụng bổ sung nguồn nhân
guanidine.
• Các bước tiến hành:
• Môi trường được sử dụng cho thử nghiệm VP là môi trường lỏng Clark-Lubs
(môi trường MR-VP), có pH 6.9. Dùng que cấy vòng cấy vào các ống môi
trường MR-VP một ít sinh khối (trường hợp dùng thuốc thử Koblenntz thì cấy
nhìu sinh khối) từ khuẩn lạc của chủng thuần đã ủ 18-24h trên môi trường KIA
hoặc TSI. Ủ yên các ống môi trường này ở 37oC / 24-48h hoặc đến 10 ngày.
Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử trực tiếp vào ống môi trường. Có 3 loại
thuốc thử VP là:
• • Thuốc thử Barritt: gồm dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồn tuyệt đối,
dung dịch B là 40% KOH hoặc NaOH.
• • Thuốc thử Koblentz: gồm dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồn 95%,
dung dịch B là 0.3% creatine, 40% KOH hoặc NaOH.
• • Thuốc thử O’Meara: dung dịch 0.3% creatine, 40% KOH hoặc NaOH
• Khi sử dụng các loại thuốc thử 2 thành phần, trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A,
sau đó nhỏ 2 giọt dung dịch B, bổ sung 1ml thuốc thử vào ống môi trường. Lắc
nhẹ ống 1 phút để oxi hóa acetoin. Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm nhất 4h.
• Trước khi sử dụng nên kiểm tra thuốc thử bằng các chủng đối chứng như
E.Coli (VP -) bề mặt môi trường không đổi màu và Enterobacter cloacae (VP
+) có màu đỏ trên bề mặt môi trường.
•
• Thử nghiệm khả năng thủy phân tyrosine: cấy vi khuẩn vào thạch nghiêng

m
yc
oi
de
s
• B.
an
thr
aci
s
• B.me
gater
ium
• G
r
a
m

• +
(
a
)

• + • + • + • +
• C
a
t
a
l
a

(d)n
i
t
r
a
t
e

• P
h
â
n

h
ủ
y

t
y
r
o
s
i
n
e

• +

n

ứ
n
g

v
ớ
i

l
ò
n
g

đ
ỏ

t
r
ứ
n
g

• L
ê
n

m
e

n
h

a
c
i
d

t
ừ

m
a
n
i
t
o
l

• -

• - • - • - • +
• T
a
n

m
á
u