ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LÝ THU HƢƠNG

MỨC ĐỘ NHIỄM VI NẤM SINH OCHRATOXIN A TRONG ĐẤT VÀ RỄ
CÂY CÀ PHÊ Ở MỘT SỐ VÙNG TRỒNG CÀ PHÊ TRỌNG ĐIỂM

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội - 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

50
của ochratoxin A đối với một số loài động vật [24]
Bảng 1.3: Mức độ nhiễm ochratoxin A trong máu của người ở một số nước [24]
Bảng 1.4: Mức nhiễm ochratoxin A trên một số đối tượng[25]
Bảng 1.5: Thời gian giảm 50% ochratoxin A trên lúa mỳ trong điều kiện nhiệt độ khác
nhau [24]
Bảng 3.1. Mức độ nhiễm nấm mốc Aspergillus niger và Penicillium viridicatum có khả
năng sinh ochratoxin A trong đất trồng cà phê
Bảng 3.2. Mức độ nhiễm nấm mốc Aspergillus niger và Penicillium viridicatum có khả
năng sinh ochratoxin A trong rễ cây cà phê
Bảng 3.3. Mức độ nhiễm nấm mốc A.niger và P.viridicatum có khả năng sinh ochratoxin
A trong đất và rễ cây cà phê ở Đắclắk, Đắc Nông
Bảng 3.4: Khả năng tạo độc tố ochratoxin A của 23 chủng Aspergillus niger đã phân
lập bằng phương pháp nuôi cấy trên cơ chất ngô
Bảng 3.5: Khả năng tạo độc tố ochratoxin A của 12 chủng Penicillium viridicatum đã
phân lập bằng phương pháp nuôi cấy trên cơ chất ngô
Bảng 3.6: Đặc điểm hình thái của chủng A.niger AN1 sau 5 đến 7 ngày nuôi cấy trên
môi trường PDA ở 28ºC
Bảng 3.7:Đặc điểm hình thái của chủng A.niger AN3 sau 5 đến 7 ngày nuôi cấy trên
môi trường PDA ở 28ºC
Bảng 3.8: Đặc điểm hình thái của chủng P1 trên môi trường PDA DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 3.1: Sắc ký đồ Ochratoxin A của các chủng AN1, AN8, P.viridicatum P8
(trước khi phun dung dịch)
Hình 3.2: Sắc ký đồ Ochratoxin A của các chủng AN1, AN8, P.viridicatum P8 (sau
khi phun dung dịch)
Hình 3.3: Hình thái của chủng A.niger AN1
Hình 3.4: Khuẩn lạc của chủng A.niger AN3

1.2. Đại cƣơng về độc tố nấm mốc…………………………………
4

1.3. Ochratoxin A…………………………………………………………
6

1.3.1. Các loại độc tố ochratoxin…………………………………
6

1.3.2. Tính chất hoá lý của độc tố ochratoxin A…………………………
7

1.3.3. Sự tạo độc tố ochratoxin A do các nấm mốc……………………….
8

1.3.4. Độc tính của ochratoxin A…………………………………… ……
8

1.3.5. Phƣơng pháp phân tích……………………………………………
10

1.3.6. Tình hình nhiễm ochratoxin A trên cà phê và các nông sản khác
ở thế giới và Việt Nam……………………………………………………….

11

1 .3.7. Tình hình nghiên cứu phòng chống ochratoxin A trên thế giới và
Việt Nam ………………………………………………………………….

15


2.2.1. Phƣơng pháp lấy mẫu cho phân tích độc tố ochratoxin A………
21 2.2.2. Phƣơng pháp phân lập nấm mốc từ đất và rễ cây cà phê…………
22 2.2.2.1 Phương pháp phân lập nấm mốc từ đất trồng cà phê………….…
22 2.2.2.2. Phương pháp phân lập nấm mốc từ rễ cây cà phê………………
22 2.2.3. Phƣơng pháp làm tiêu bản soi nấm mốc……………………
23 2.2.4. Phƣơng pháp phân loại các loài nấm mốc………………………….
23 2.2.5. Phƣơng pháp phân tích ochratoxin A………………………………
23 2.2.5.1. Chiết xuất………………………………………………………….

có khả năng sinh ochratoxin A trong đất và rễ cây cà phê………………

28
3.2. Xác định khả năng tạo độc tố ochratoxin A của các chủng
Aspergillus niger và Penicillium viridicatum đã phân lập …………………

34
3.3. Đặc điểm phân loại chủng nấm mốc Aspergillus niger và Penicillium
viridicatum có khả năng sinh ochratoxin A đã phân lập………………

38
3.3.1.Đặc điểm hình thái và cấu trúc hiển vi của một số chủng
Aspergillus niger đặc trƣng đã phân lập từ đất và rễ cây cà phê………

39
3.3.1.1. Chủng A.niger AN 1……………………………………………………
39


43
3.3.2.1. Chủng P.viridicatum P1…………………………………………
43
3.3.2.2. Chủng P.viridicatum P2…………………………………………
45
3.3.2.3. Chủng P.viridicatum P5…………………………………………
45
KẾT LUẬN& KIẾN NGHỊ ……………………………………………
46
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Cà phê là một trong những sản phẩm nông nghiệp chính có giá trị kinh tế cao
của nước ta. Cà phê là nông sản được xuất khẩu với số lượng lớn sang các nước
thuộc khối ASEAN, Nhật Bản, Cộng hoà liên bang Nga và một số nước Đông Âu.
Vì vậy, việc nâng cao chất lượng cà phê nói riêng và các nông sản nói chung bao

Xác định được mức độ nhiễm nấm mốc sinh ochratoxin A trong đất và rễ cây
cà phê ở một số vùng trọng điểm trồng cà phê ở Việt Nam.
1.2.2. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát sự nhiễm nấm mốc Aspergillus niger và Penicillium viridicatum
sinh ochratoxin A trong đất và rễ cây cà phê.
- Phân lập và phân loại chủng nấm mốc A.niger và P.viridicatum trong đất
và rễ cây cà phê.
- Xác định khả năng sinh ochratoxin A của các chủng nấm mốc A.niger và
P.viridicatum nhiễm trong đất và rễ cây cà phê.

Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1. Hệ nấm mốc trên lƣơng thực
1.1.1. Hệ nấm mốc ngoài đồng
Các hạt lương thực hay hạt giống trước khi thu hoạch có thể bị nấm mốc xâm
nhiễm. Các nấm mốc ngoài đồng được phân biệt theo các loại ngũ cốc, vùng, địa lý
cư trú, thời tiết,… Một số loại nấm mốc ngoài đồng điển hình là Alternaria,
Cladosporium, Helminthosporium, và Fusarium. Tất cả các nấm mốc ngoài đồng có
thể sống qua được trong nhiều năm ở hạt khô.
Các nấm mốc ngoài đồng có thể ảnh hưởng tới bề ngoài và chất lượng của
hạt. Thông thường, tổn thất gây nên do nấm mốc ngoài đồng xảy ra trước khi thu
hoạch có thể phát hiện ra bằng phương pháp giám định thông thường và không tiếp
tục tăng lên trong quá trình bảo quản. Điều này được nhận biết rõ nhất là bắp, khi
chín khô ngoài đồng, chưa thu hoạch kịp, gặp mưa có độ ẩm cao, các loại nấm mốc
có nguồn gốc từ đất tấn công vào nông sản. Muốn khắc phục tình trạng này cần phải

trực tiếp mà còn là nguồn mang độc tố vào sữa, thịt, và như vậy tạo sự nhiễm độc tố
tiếp theo cho con người. Thường thì con người và vật nuôi bị nhiễm độc tố nấm
mốc khi ăn phải lương thực, thực phẩm bị nhiễm độc tố.[2]
Hiện nay có khoảng 300 loại độc tố được phát hiện và nghiên cứu. Tuy nhiên
chỉ có khoảng 20 loại độc tố có trong thực phẩm ở mức độ nghiêm trọng và liên
quan đến an toàn thực phẩm. Được tạo bởi năm chi nấm là Aspergillus, Penicillium,
Fusarium, Alternaria và Claviceps, chúng bao gồm:
Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin ( B
1
, B
2
, G
1
, G
2
, M
1
, M
2
), ochratoxin
A, stermatocystin, axit cyclopianxoic.
Các độc tố của Penicillium: Pautulin, ochratoxin A, citrinin, penitrem A và
axit cyclopianzoic toxin, fumonisin, moniliformin, diacetocyscirpenon.
Các độc tố của Fusarium: deoxynivalenon, nivalenon, zearalenon, T-2 toxin.
Các độc tố của Alternaria: Axit tenuazoic, alternarion, methyl ether
alternarion.
Các độc tố của Claviceps: Các alkaloid của nấm cựa gà [45]
Độc tố nấm mốc ngày càng thu hút sự quan tâm, nghiên cứu của các nhà
khoa học ở nhiều lĩnh vực khác nhau. Rất nhiều hội nghị quốc tế, hội thảo, chuyên
khảo, tạp chí và các bài báo nghiên cứu về vấn đề có tính cấp thiết này.

hệ chất hấp phụ độc tố nấm mốc có nhiều thành quả nhất đáp ứng được hầu hết các
yêu cầu về một chất hấp phụ độc tố điều mà các loại đất sét còn thiếu sót.
1.3. Ochratoxin
1.3.1. Các loại độc tố ochratoxin
Sau aflatoxin thì ochratoxin là nhóm độc tố tiếp theo được phát hiện. Hiện
nay có 4 loại ochratoxin được biết đến là ochratoxin A, ochratoxin B, ochratoxin C
(este etyl của ochratoxin A) và este metyl của ochratoxin A. Ở các ochratoxin chủ
yếu là sự ghép một nhân phenylalanine và một nhân izocumarin. [6] Công thức cấu
tạo của độc tố ochratoxin A như sau:
Ochratoxin A
Claude Moneau và cộng sự [5] khi nghiên cứu tính chất hoá lý của
ochratoxin đã đưa ra những kết quả sau:
Bảng 1.1: Tính chất hoá lý của các ochratoxin
Ochratoxin
Công thức
phân tử
Trọng lƣợng phân
tử (MW)
Điểm nóng chảy
(ºC )
Ochratoxin A
C
20
H
18
O
6

20
O
6
NCl
417,5

1.3.2. Tính chất hoá lý của độc tố ochratoxin
Hợp chất đầu tiên được phát hiện trong nhóm độc tố ochratoxin là ochratoxin
A, được phân lập từ Aspergillus ochraceus. Ochratoxin A là tinh thể không màu,
phát quang màu xanh dưới ánh sáng cực tím. Muối natri của ochratoxin A hoà tan
trong nước, hoà tan nhẹ ở các dung môi phân cực như clorofom,
methanol, Ochratoxin A tinh khiết bền ở nhiệt độ cao. Ochratoxin A ít hoặc không
bị phá huỷ ở điều kiện nấu bình thường. Tuy nhiên ochratoxin A bị phân huỷ dưới
tác dụng trực tiếp của ánh sáng mặt trời. Trong quá trình thuỷ phân axit ochratoxin
A sẽ tạo ra phenylalanine và axit lacton hoạt động về mặt quang học. Ochratoxin C
là chất trao đổi tìm thấy ở nước tiểu của động vật ăn thức ăn có nhiễm ochratoxin A.
[6]
1.3.3. Sự tạo độc tố ochratoxin A do các nấm mốc
Ochratoxin A đầu tiên được phân lập từ Aspergillus ochraceus nhưng những
nghiên cứu tiếp theo cho thấy các biến chủng của chi Aspergillus và Penicillium
cũng tạo ochratoxin A.
Các nấm mốc tạo ochratoxin A ở chi Aspergillus gồm: A.ochraceus, A.
elegans, A.fresenii, A.melleus, A.ostianus, A.petrakii, A.screrotium, A.sulphureus.
Các nấm mốc tạo ochratoxin A ở chi Penicillium gồm: P.verrucosum,
P.viridicatum, P.chrysogenum, P.commune và P.cyclopium, P.expansum,
P.palitans, P.purpurescence, P.nordiceum, P.variable.[4]
Ochratoxin A được tạo ở nhiệt độ tối thích từ 20º- 30ºC và hoạt độ nước
0,953 (39% hàm lượng nước tính theo phần trăm trọng lượng khô), ở nhiệt độ cao
hơn hàm ẩm yêu cầu cao hơn a
w

nồng độ thấp), gây đẻ ít trứng rõ rệt, rối loạn gan và thận, đôi khi làm chết gà (ở
nồng độ cao).[49]
Bằng thực nghiệm người ta đã nhiễm độc cho vịt con và chuột, kết quả nhận
thấy vịt và chuột bị viêm ruột, rối loạn thận, hoại tử ở tiểu quản thận, rối loạn gan,
hoại tử các tế bào quanh cửa gan, thông thường nhiễm vào các tế bào riêng lẻ.
Ochratoxin A và dihidro- izocumarin, một trong những sản phẩm thuỷ phân của nó
gây ức chế nghiêm trọng sự hô hấp nhịp khi cho hai chất đó ở nồng độ thấp vào các
thể ty lạp riêng rẽ ở gan chuột. Ochratoxin A còn gây sẩy thai ở động vật thí nghiệm
và ở các động vật trong các trại chăn nuôi. Giá trị LD
50
(liều gây chết tối thiểu 50%
số động vật thí nghiệm) của ochratoxin A đối với một số động vật được thể hiện qua
bảng 1.2 dưới đây.
Bảng 1.2: LD
50
của ochratoxin A đối với một số loài động vật [24]

Loài
LD
50
(mg/kg trọng lƣợng cơ thể)
Trong miệng
Trong màng bụng
Trong tĩnh mạch
Chuột mới sinh
3,9 Chuột
46 - 58

tương đối thấp, đối với ochratoxin A là 0.25ppb. Có thể định lượng ochratoxin A
nhờ phương pháp sắc ký bản mỏng bằng cách so sánh cường độ phát quang của
mẫu thử so với mẫu chuẩn bằng mắt thường hoặc có thể tiến hành đo trên máy đo
mật độ huỳnh quang. Việc đo cường độ phát quang bằng máy là ưu thế hơn xác
định bằng mắt vì nó loại trừ được sai số cao được gây ra trong điều kiện của sắc ký
bản mỏng. Các nhà khoa học đã xác định được giới hạn chính xác của việc xác định
bằng mắt thường là 20- 28% trong điều kiện lý tưởng. [6]
Phương pháp sắc ký lỏng cao áp
Ngoài sắc ký bản mỏng còn có thể định tính và định lượng ochratoxin A
bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp. Sắc ký lỏng cao áp là phương pháp tách xác
định các chất dựa trên sự phân bố của chất giữa hai pha: pha tĩnh là chất lỏng bao
bọc tạo thành một tấm phim mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (gọi là chất mang)
được nhồi vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh.
Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp để định tính và định lượng các mycotoxin
trong đó có ochratoxin A được tiến hành dựa trên nguyên lý: mẫu được đưa qua bộ
phận tiêm mẫu vào dòng dung môi của pha di động được tạo bởi hệ thống phân chia
dung môi bao gồm một hay nhiều bơm cao áp chính xác. Dòng chảy của pha di
động truyền mẫu vào cột sắc ký có các hạt của pha tĩnh (5- 100 nm). Sau đó dung
dịch mẫu được chuyển vào cột. Sự phân tách các thành phần tiến hành ở dạng các
dải sắc ký phân tách. Những dải sắc ký này được chiết rút từ cột qua một hay nhiều
máy phát hiện. Tín hiệu xung động được khuếch đại và được ghi lại thành đồ thị ở
các đỉnh sắc ký.
Sắc ký lỏng cao áp là hệ thống thiết bị hoàn thiện với độ xác định chính
xác cao đối với việc phân tích các mycotoxin. Giới hạn phát hiện đối với ochratoxin
A là 0.5 ng/kg.
1.3.6. Tình hình nhiễm ochratoxin A trên cà phê và các nông sản khác trên thế
giới và ở Việt Nam.
Trên các loại nông sản như ngô, lạc, lúa mì, đại mạch, cà phê, bia, nho, các
loại thức ăn gia súc đã tìm thấy ochratoxin A. Ochratoxin A cũng đã được tìm thấy
trong máu của người ở các nước như Bulgari, Hungari, Nhật Bản, Canada. Kết quả

1,0-4,0

Bulgari
1984-90
9/127
7

1,0-1,3
Petkova-
Bocharova và cs.
(1991)
Canada
1994
144/144
1
0
0,23
0,29 -2,4
Scott và cs. (1998)
Cộng hoà
Séc
1994
734/809
9
1
0,23
0,1-14
Malir và cs. (1998
1995
404/413

6
8
0,75
0,1-8,4
Hungary
1995
291/355
8
2

0,2-10
Solti và cs. (1997)
1997
213/277
7
7

0,1-14
Tapai và cs. (1997)
Italia
1992
65/65
1
0
0,53
0,1-2,0
Breitholtz-
Emanuelsson và
cs. (1994)
Nhật Bản

ochratoxin A trên một số đối tượng như rễ cây cà phê, mỳ, bột mỳ, cám mỳ, lúa
mạch, ngô Bắc Mỹ, … Dưới đây là bảng 1.4 trình bày kết quả mức nhiễm
ochratoxin A trên một số đối tượng.
Bảng 1.4: Mức nhiễm ochratoxin A trên một số đối tượng[25]
Đối tƣợng
Mức nhiễm ochratoxin A
( ng/g )
Lúa mỳ
0,41
Bột mỳ
1,2
Cám mỳ
3,8 – 4,5
Lúa mạch
0,8 - 14
Ngô Bắc Mỹ
0,8 - 40
Rượu trắng
0,01 – 1,8
Bia
0,01 – 1,4
Rễ cây cà phê
0,1 – 5,4
Tại Việt Nam, những nghiên cứu của Nguyễn Thuỳ Châu và cộng sự cho
thấy ngô bột của miền Bắc năm 1994 đã nhiễm 67% ochratoxin A với hàm lượng
trung bình là 1,8 ppb. Các mẫu ngô hạt nhiễm 88% ochratoxin A với hàm lượng
trung bình là 10ppb [7]. Nghiên cứu về mức độ nhiễm ochratoxin A trên gạo tại
Nha Trang của Nguyễn Minh Trí cho kết quả, 22/64 mẫu kiểm tra (34%) nhiễm
ochratoxin A nhưng chỉ có 9/64 (14%) mẫu có thể định lượng được với mức nhiễm
là 0,63 ng/g gạo, chỉ có một mẫu nhiễm 2,78 ng/g gạo.

- Xác định đúng thời gian trước thu hoạch, thu hoạch và sau thu hoạch cho cây
trồng
- Giảm hàm ẩm của các hạt lương thực sau thu hoạch và trong quá trình bảo
quản
- Bảo quản các nông sản ở nhiệt độ thấp nếu có thể
- Sử dụng các chất diệt nấm và các chất bảo quản để ngăn chặn sự phát triển
của nấm mốc
- Kiểm soát sự xâm nhiễm của các côn trùng trong bảo quản bằng việc sử dụng
các chất diệt côn trùng,…
Các nghiên cứu về nguyên nhân nhiễm nấm mốc trong quá trình bảo quản
nông sản của nhà khoa học Mỹ Christensen [9] cho thấy, đất là nơi phát sinh đầu
tiên của các nấm mốc. Các nấm này đã nhiễm vào rễ của cây rồi nhiễm nội sinh
vào cây trồng và từ đó nhiễm tiếp vào bên trong các hạt lương thực. Fernado E.
Vega và Francisco, các nhà khoa học của Brazin, Pháp, Mỹ đã phát hiện trong số 11
chủng Penicillium sống nội sinh trong cây cà phê, 4 chủng có khả năng tạo
ochratoxin A là P.brevicompactum, P.crustosum, P.olsonii và P.oxalicum [43].
Hiện nay rất nhiều nước trên thế giới quan tâm đến việc phòng chống
ochratoxin A. Các nhà khoa học của Brazin, Pháp, Mỹ đã nghiên cứu việc phòng
chống nấm mốc Aspergillus ochraceus và Penicillium viridicatum sinh ochratoxin
A. Các tác giả Ringot D, Bejaoui H [18] cho thấy chủng A.niger không sinh độc tố
đã có khả năng ức chế chủng A.niger, A.ochraceus và các Penicillium sinh độc tố
theo cơ chế cạnh tranh. Cộng đồng châu Âu đã công nhận kết quả này và khuyến
cáo sử dụng chủng A.niger không sinh độc tố để phòng chống ochratoxin A.
Các biện pháp khử nhiễm ochratoxin A trong nông sản thực phẩm cũng được
các nhà khoa học trên thế giới nỗ lực nghiên cứu. Nhiều giải pháp được đưa ra
nhằm khử nhiễm ochratoxin A trên lương thực, thực phẩm. Boudra (1995) đã
nghiên cứu khả năng khử nhiễm ochratoxin A trên lúa mỳ bằng sức nóng. Kết quả
cho thấy ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau, khả năng giảm ochratoxin A là khác
nhau. Kết quả được thể hiện trong bảng 1.5 dưới đây.
Bảng 1.5: Thời gian giảm 50% ochratoxin A trên lúa mỳ trong điều kiện

thấy ở cả hai môi trường các nấm này đã có khả năng phân huỷ ochratoxin A thành
ochratoxinalpha. Tuy nhiên có sự khác nhau giữa các môi trường được thử. ở môi
trường dịch qủa nho và môi trường chất chiết nấm men 77% và 44 % các chủng
phân lập đã có khả năng phân huỷ 80 % ochratoxin A . Aspergillus được đánh giá là
loài có hiệu quả cao nhất đối với quá trình khử ochratoxin A, tiếp theo là
A.japonicus.
Varga J và cộng sự [39 ] đã nghiên cứu sự phân huỷ ochratoxin A và các độc
tố nấm mốc khác bằng các chủng Rhizopus. Kết quả cho thấy ochratoxin A đã được
phân huỷ một cách hiệu quả bằng nấm Rhizopus stolonifer, R.microsporus,
R.homothallicus, hai chủng R.oryae và bốn chủng Rhizopus khác chưa được định
loại. Các chủng Rhizopus đã phân lập có thể phân huỷ trên 95% ochratoxin A trong
vòng 16 ngày. Các chủng A.niger không sinh độc tố và Rhizopus stolonifer cũng đã
được cộng đồng châu Âu khuyến cáo để khử nhiễm ochratoxin A trên lương thực
nhiễm độc tố này ở mức độ quá giới hạn.

Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Đối tƣợng
Các mẫu đất và rễ cây cà phê được lấy ở các xã khác nhau của tỉnh ĐắkLắk
và ĐắkNông bao gồm: 50 mẫu đất và 30 mẫu rễ cây cà phê.
8 mẫu ở Tân Lập, Đắclắk.
15 mẫu ở Ea cúc, Đắclắk.
7 mẫu ở Eapole, Đắclắk.
10 mẫu ở Chư hlam, Đắclắk.