ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
NGUYỄN THỊ NHIÊN
LỰA CHỌN CÁC ĐIỀU KIỆN LÊN MEN XỐP TỐI ƯU VÀ NGHIÊN CỨU
ĐẶC TÍNH XYLANASE TỪ VI KHUẨN ƯA NHIỆT

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

TS. ĐÀO THỊ LƯƠNG Hà Nội - 2012 3

MỤC LỤC BẢNG

Bảng
Tên bảng
Trang
1.1.
T 
13
1.2.



18
1.3.
Mt s nhóm vi sinh vc dùng trong lên men xp (Raimbault,


4
MỤC LỤC HÌNH

Hình
Tên hình
Trang
1.1.
 
14
1.2.
 
16
1.3.
Cu trúc không gian xylanase ca Bacillus subtilis 
19
1.4.
Các enzyme cn thit phân c 
20
1.5.
S thy phân thành t bào thc vt b 
24
3.1.
V trí phân loi ca chng B
2

H
2


62
3.7.
pH thích hp cho s ng và tng hp enzyme chng B
2
H
2
và


63
3.8.
Thi gian thích hp cho ging khng ca chng B
2
H
2
 
65
3.9.
t thích hp cho quá trình tng hp xylanase ca 2 chng B
2
H
2
và


66



 ng hp xylanase ca

2
H
2
và chng 118

70
3.14.
M ng ca cao thn kh ng hp xylanase ca
chng B
2
H
2


71 5
3.15.
M ng cn kh ng hp xylanase ca chng
 

72
3.16.
 



77
3.20.
 trên gel ho mu enzyme thô có ME (1) và không có ME
(2); mu enzyme ta aceton có ME (3) và không có ME (4)

78
3.21.
n di trên gel hot tính mu enzyme ta aceton
79
3.22.
Ho xylanase chng 118 thu hc khi ta trong mui
ammonisunfat t n 90%

80
3.23.
n di trên gel SDS-n di trên gel ho mu enzyme ta
aceton và mu enzyme ta ammonisunfat t n 90%

80
3.24.
Si ion dch enzyme ta ammonisunfat 50%
81
3.25:
Kt qu si ion mu enzyme ta ammonisunfat 80%
82
3.26.
n di SDS-PAGE mu enzyme ta ammonisunfat 80%, E1 và E2
83
3.27.


88
3.34.
Kh u nhit ca enyme xylanase t chng B
2
H
2

88
3.35.
ng ca các ion kim loi n ho xylanase
89
6
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 11
1. Lý do lựa chọn đề tài 11
2. Nhiệm vụ và mục đích nghiên cứu 12
3. Những đóng góp mới của đề tài 12
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 13
1.1. XYLAN 13
1.1.1. Xylan 13
1.1.2. Cấu trúc của xylan 14
1.2.3. Tính chất của xylan 15
1.2. ENZYME PHÂN GIẢI XYLAN - XYLANASE 16
1.2.1. Nguồn gốc xylanase 16
1.2.2. Phân loại xylanase 17
1.2.3. Cấu trúc 18

1.4.4.1. Điện di trên gel agarose 38
1.4.4.2. Điện di trên gel polyacrylamide 38
CHƢƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40
2.1 CHỦNG VI SINH VẬT, MÔI TRƢỜNG VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 40
2.1.1. Chủng vi sinh vật 40
2.1.2. Môi trường nghiên cứu 40
2.1.2.1. Môi trường nhân giống (g/l) 40
2.1.2.2. Môi trường nuôi dịch thể 40
2.1.2.3. Môi trường kiểm tra hoạt độ enzyme 41
2.1.2.4. Môi trường nuôi xốp 41
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu 41
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41
2.2.1. Phương pháp xác định hoạt tính xylanase 41
2.2.1.1. Phương pháp định tính (khuếch tán trên thạch) 41
2.2.1.2. Phương pháp định lượng 42
2.2.2. Tuyển chọn chủng 44
2.2.3. Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng 44
2.2.4. Phương pháp phân loại 44
2.2.4.1. Phương pháp phân loại vi khuẩn dựa vào đọc trình tự ADN 44
2.2.4.2. Quan sát hình thái 48
2.2.5 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả năng tổng hợp
xylanase ở các chủng vi sinh vật nghiên cứu 49
2.2.5.1. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống thích hợp cho khả năng tổng
hợp xylanase ở các chủng nghiên cứu 49
2.2.5.2. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy xốp thích hợp cho khả năng tổng hợp
xylanase ở các chủng nghiên cứu 49
2.2.6. Thu hồi enzyme 51 8

3.3.1. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống 60
3.3.1.1. Môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng 60
3.3.1.2. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng 62
3.3.1.3. pH thích hợp cho sự sinh trưởng 63
3.3.1.4. Thời gian thích hợp cho giống khởi động 64
3.3.2. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy xốp 65
3.3.2.1. Lựa chọn cơ chất 65
3.3.2.2. Lựa chọn độ ẩm thích hợp 65 9
3.3.2.4. Lựa chọn tỷ lệ giống cấy thích hợp 68
3.3.2.5. Lựa chọn nguồn nitơ bổ sung 68
3.3.2.6. Lựa chọn nguồn cacbon bổ sung 71
3.3.2.7. Lựa chọn loại khoáng thích hợp 72
3.4. THU HỒI ENZYME 72
3.4.1. Điều kiện thích hợp cho chiết enzyme 72
3.4.2. Thu hồi enzyme bằng các dung môi hữu cơ 73
3.5. TINH SẠCH ENZYME 74
3.5.1. Tinh sạch enzyme xylanase chủng 118 theo phương pháp sắc ký trao
đổi ion 74
3.5.2. Tinh sạch xylanase của chủng 118 bằng phương pháp tủa trong muối
ammonisunfat bão hòa kết hợp với sắc ký trao đổi ion sepharose DEAE. 77
3.6.1. Đặc tính enzyme xylanase từ chủng 118 81
3.6.1.1. pH thích hợp 81
3.6.1.2. Nhiệt độ thích hợp 82
3.6.1.3. Ảnh hưởng của các ion kim loại 83
3.6.1.4. Khả năng chịu nhiệt của enzyme 84
3.6.2. Đặc tính xylanase từ B
2

C : các bon
CMC : Carboxymethyl cellulose
Da : Dalton
DEAE : Diethylaminoethyl
DNS : Dinitro-salicylic acid
dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate
EtBr : Ethidium Bromide
G : gram
GH : Glycoside Hydrolase
kb : Kilo-base
kDa : Kilo-Dalton
mA : mini Ampe
PCR : Polymerase Chain Reaction (Phn ng chui polymerase)
SDS : Sodium Dodecyl Sulfate
SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate- Polyacrylamide Gel Electrophoresis
TAE : Tris - Acetate - Ethylendiamin tetracetic acid
TE : Tris - Ethylendiamin tetracetic acid
TEMED : Tetramethylethylenediamine
U : Unit )
v/p : Vòng /phút
VPG : Vòng phân gii
XK : X khun
YG : Yeast Glucose ng YG)
11
MỞ ĐẦU
ta thng enzyme vi sinh vt có th sinh ra trong lên men x12
nhiu ln so vi trong lên men dch th khi s dng cùng mt chng vi sinh vt
u kin lên men [14].
 góp phn b sung các s liu cn thit v vic ng dng k thut lên men
xp trong công nghip sn xut enzyme chúng tôi thc hi tài: “Lựa chọn các
điều kiện lên men xốp tối ưu và nghiên cứu đặc tính xylanase từ các chủng vi
khuẩn ưa nhiệt”.
2. Nhiệm vụ và mục đích nghiên cứu
- Kho sát và tuyn chn nhng chng vi khun và x khun bn nhit có hot
 enzyme xylanase cao.
- Nghiên cm sinh hc và phân loi các chng vi khun và x khun
nghiên cu.
- La chu kin lên men xp tng vi khun và x
khun nghiên cu.
- Nghiên cc tính và tinh sch enzyme ca các chng nghiên cu.
3. Những đóng góp mới của đề tài


 c hi 



 
g m




13
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. XYLAN
1.1.1. Xylan


 Xylan còn tham gia vào cu trúc và giúp lignocellulose b
Bảng 1.1: Thành phần chất khô trong thực vật [2]
Ngun gc
Cellulose (%)
Hemicellulose (%)
Lignin (%)
Thân g cng
40-55
24-40
18-25
Thân g mm
45-50

Ht bông
80-95
5-20
0
Giy báo
40-55
25-40
18-30
Giy thi t bt giy hóa hc
60-70
10-20
5-10
Cht rc thi u
8-15
-
24-29
Cht thi ca ln
6
28
-
Phân bón gia súc
1.6-4.7
1.4-3.3
2.7-5.7
C  b bin Bermuda
25
35.7
6.4
C mm
45

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của xylan [35]

ng nht ca xylan, s thy phân ca nó phi cn mt h
thng enzyme phc tng bao gm hai loi: enzyme không phân
nhánh (-1,4-endoxylanse, ferulic acid esterases) và enzyme phân nhánh (-
arabinofuranosidase, -glucuronidase, esterase xylan acetyl và esterase axit
phenolic) (Hình 1). Tt c   chuyn hóa xylan
thành cu t ng ca nó. H thy phân xylan khá ph bin  vi
khun và nm. Các xylan khác loi cha các nhóm th khác nhau trong mch chui
chính và chui bên. S phân gii polysaccharide phc tp cn có hong h tr
gia các thành phn khác nhau ca h thng enzyme . 
endo--1,4-
 15

150-    Các si xylan liên kt vi nhau nh các phân t acid
diferulic và bao quanh các vi si cellulose. Cùng vi lignin, xylan còn có tác dng
bo v các vi si cellulose [31].


           
arabinose: 4-O-methyl-         
            
-O-methyl-
 

    


còn kt hp vi các enzyme thy phân khác tham gia vào quá trình tách dòng.
1.2.1. Nguồn gốc xylanase
 c sinh tng hp bi nm, vi khun, x khu  ng vt
nguyên sinh. Trong các loài vi sinh vt có kh ng hp xylanase, nm, vi
khun và x khun là các nhóm quan trng nhc bit là nm si. Các nhóm vi
sinh vt có kh  khá rng rãi và tham gia tích cc vào
các chu trình tun hoàn vt cht, nht là các quá trình phân gii cht h hình
thành cht mùn [31]. 17
Các loc sinh ra bi vi khun và nm sm có kh 
chu nhit tc ng dng rng rãi và cho hiu qu 
trong công nghip [22].
1.2.2. Phân loại xylanase
 c nghiên cu rng khp toàn cu trong sut  p k
va qua do chúng có nht trc ng dng trong công nghip,
chng h    p thc phm, sn xut th    
nghip sn xut bt giy và làm giy.
Xylanase thuc nhóm các enzyme thy phân liên kt glycoside (glycoside
hydrolase, GH), thy phân xylan. Glycoside hydrolase là mt nhóm enzyme phân
b rng rãi, thy phân các liên kt glycoside trong chui polysaccharide hoc
oligosaccharide. Do cu trúc phc tp ca các carbonhydrate trong t nhiên, nên các
c hin ti s ng ln song song vi nó. GH
t các nguc phân loi thành các h khác nhau da vào trình t axit
ng. Nguyên tn là t trình t axit amin bc mt có th thy
c mi liên kt trc tip gia cu trúc bc này và s cun gp ci
vi các thành viên trong mt h nhnh [7].
     c cho rng xylanase khác vi h enzyme
i ta nghiên cc rng xylanase

Bảng 1.2. Các họ thuộc glyoside hydrolase (GHs) có hoạt động trên xylan
(Collin & cộng sự, 2005)

hydrolase


xylan


tác
Nhóm acid/base
chính
Nucleophilchase
chính
5
8

8


Glutamate
Glutamate
7
1
-Jelly roll

Glutamate
Glutamate
8
4

sandwich gn ging vi cu trúc bàn tay phi và có khng phân t nh 
vào khong 20 kDa, pI cao và thy phân các liên kt glycoside v xúc tác
i ch hai ln (Hakylinen & cng s, 2003; Zhou & cng s, 2009).
Xylanase thuc h GH10 thuc nhóm acid xylanase. Xylanase thuc h
GH11 thuc nhóm alkaline xylanase [36].
1.2.3. Cấu trúc
Cu trúc bc ba ca phân t nh bng cách s dng mô
hình Insight II Molecular. u trúc xylanase bao gm mt mi 
cha 2 vùng c t min có chui xo u trúc này ch có 
xylanase h GH
11
. Cu trúc chung ca phân t 
vi các ngón tay  i và ngón cái nm phía trên. Trung tâm hong là
ngón tay cái, lòng bàn tay và ngón tay.
19

thuc các chi Trichoderma, Aspergillus, Schizophyllum, Bacillus, Clostridium và
Streptomyces [30].
Ferulic acid esterases là enzyme ngoi bào exoglyosidase thy phân các
oligosaccharide ngng xylose. Ferulic acid esterases có th
phân hy các cht nhân t  p-nitrophenyl -D-xyloside [31]. Trong s các
     t tt nht. Ái lc c  i vi
xylooligosaccharide gim theo m a phn ng polymer hóa [22]. Hu
ht các ferulic acid esterases c nghiên cn nay u b c ch bi xylose
- sn phm thy phân ca chúng. Nhiu ferulic acid esterases có ho transferase,
c bit là  các n t cao, to ra sn phm phân t ng cao.
α-L-Arabinofuranosidase 21
M trng trong quá trình thy
 có mc tinh sch và mô t. Có hai loi
enzyme arabinase, các enzyme -L-arabinofuranosidase ngoi bào (EC 3.2.1.55)
hoc li vi p-nitrophenyl--L-arabinofuranosida trên các arabinan phân
nhánh và các enzyme 1,5-alpha-L-arabinase ni bào (EC3.2.1.99), ch hot hóa các
arabinan dng thng.
-L-Arabinofuranosidase có kh y phân c hai liên kt 1,3- và 1,5--
L-    c báo cáo trong A. ninger và B.
subtilisc hii vi arabinoxylan và có th gii phóng mi
arabinose t arabinoxylan. Khi gii phóng arabinose, mch chính xylan không b
thy phân và không ti vi
-L-1,3 hoc -1,5 liên kt arabinose t arabinan, arabinogalactan, hoc p-
nitrophenyl-alpha-L-arabinofuranoside.
α-Glucuronidase
-D-Glucuronidase phân gii liên kt -1,2 gia axit glucuronic và gc
xylose trong phân t   c hiu ca -glucuronidase là khác

ng  nhi th
o
C. H s này càng ln, phn ng càng khó xy ra 
nhi ng.
Q
10
= k
t+10
/k
t
Kt qu nghiên cu ng ca nhi n vn tc phn ng enzyme
cho thy, nhi hong thích hp (t
opt
) ca nhiu enzyme vào khong 40-50
o
C;
trên 50
o
C ho ng b gim mnh do cu trúc phân t ca enzyme b phá v
[1].
c sinh tng hp bi nng có nhi thích hp là 40-
60
o
C. Ví d, xylanse ca Aspegillus niger hong tt nht  nhi t 45-50
o
C.
i vc sinh tng hp bi các loài vi khung có nhi
thích hp t 37-80
o
C [21]. Ví d, xylanase ca Bacillus sp. ho ng tt nht 

nht, ch còn 18-34%. Các dung môi h
u c ch hot tính xylanase, riêng n-butanol c ch ch còn 33-63%.
 Th Tuyên & cng s (2008) cho rng các dung môi h
ethanol, isopropanol không  ng mnh ti ho  xylanase t chng A.
ozyzae DSM1863, riêng n-butanol lm nh hot tính.
Tween 20 và Triton X-100 không  ng mnh  n  thp (0,2-1%)
m hot tính xylanase  n 
gim ho enzyme mnh  tt c các n [31].
1.2.6. Ứng dụng của xylanase
1.2.6.1. Ứng dụng của xylanase trong công nghiệp thực phẩm
Công nghip thc phm là mt trong nhng ngành công nghip có giá tr
kinh t l i cht ca vi sinh vt có nhiu ng dng, doanh
thu trên toàn th gi a ngành này lên ti 10
9
 
nghiên c          n. Xét  quy mô công
nghip, sn xut enzyme là mn ca công ngh
sinh hc nói chung và công ngh thc phm nói riêng. Các enzy
cùng quan trng, nhu cu s dng enzyme có ngun gc t vi sinh vt ngày càng
c bic s dng trong nhiu ngành sn xut
trên toàn th gii [14].
 c ng dng trong sn xu c hoa qu và u.
i ta ch lc dch hoa qu ri b  sung xylanase vào
phn bã hoa qu sau khi lc s c mng dch hoa qu b 
na, xylanase còn có th hou kin nhi cao (khong 60-70
o
C)
nên có th c s nhim vi sinh vt khi ch bic hoa qu  nhit
 cao [15].
c ng dng trong công nghip thc ph

ng kh (s dng enzym hoc hóa cht), ri lên men các
ng kh u, và cut và tinh ch bioethanol [11]. Tuy
c tin x lý và s dng hóa ch thy phân làm giá thành sn xut cn
còn cao và gây ng ln t
c gng s dng công ngh  thc hin quá trình này, vic nghiên cu to
ra các loi enzym có ho  cao, và phi hp s dng các enzyme 
y mnh nghiên cu.
1.2.6.4. Ứng dụng trong công nghiệp vải sợi
Xylanase có nhiu ng dng trong công nghip vi si. Xylanase tham gia
     thu cellulose mt cách nhanh chóng và d
dàng. Do xylan liên kt vi li c si màu nâu t lignin thì phi
tách xylan ra khi lignin. Xylanase giúp ty màu và làm mm si lanh và si gai
[4].
1.2.6.5. Ứng dụng trong nông nghiệp
Thành phn ch yu trong thc có b sung thêm các
nguyên lic nguyên liu giàu lipid. Nhiu th
thc vt có cha khong 30% cellulose, hemicelulose, pectin (nhng chng
vt không hc). Xylan là chy trong thc vt và là cht
khó tiêu trong th vic b sung xylanase phân gii xylan thành
các sn phm phân t thng vt d tiêu hóa, d hp th, và làm gim ô
nhing.



1.2.6.6. Ứng dụng của xylanase trong xử lý môi trường
Cùng vi s phát trin ngày càng nhanh ca xã hng cht th
khá nhanh. Bin pháp x lý rác thi ch yu cc ta là chôn l
này tn din tích, thi gian phân hng thi quá trình x c r t rác rt
t c quan tâm ti Vit nam hin nay. Vic b sung
xylanase giúp cho quá trình phân hy rác hn gim nguy