ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
NGUYỄN VŨ SƠN TÌM HIỂU CÁC CĂN NGUYÊN VI RÚT GÂY VIÊM
ĐƢỜNG HÔ HẤP CẤP CỦA MỘT SỐ BỆNH NHÂN
ĐIỀU TRỊ Ở BỆNH VIỆN ĐA KHOA VIỆT TIỆP
HẢI PHÒNG 2010 - 2012
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2012
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
1.2.1 Trên thế giới 15
1.2.2 Tại Việt Nam 17
1.3 ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG 19
1.4 DỰ PHÒNG VÀ ĐIỀU TRỊ 19
1.4.1 Dự phòng 20
1.4.2 Điều trị 21
1.5 CHẨN ĐOÁN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM 22
1.5.1 Phương pháp phát hiện kháng nguyên 22
1.5.2 Phương pháp phát hiện vật liệu di truyền 23
1.5.3 Phương pháp phát hiện kháng thể 24
1.6. CƠ SỞ LÝ LUẬN ĐỂ THIẾT KẾ VÀ TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU. 26
CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28
2. 1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 28
2.1.1 Định nghĩa ca bệnh 28
2.1.2 Cỡ mẫu 28
2.2 VẬT LIỆU 28
2.2.1 Mẫu bệnh phẩm 28
2.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ 30
2.2.3. Sinh phẩm 32
2.3 PHƢƠNG PHÁP 37
2.3.1 Tách chiết vật liệu di truyền của vi rút ARN 37
2.3.2. Phản ứng di truyền phân tử (PCR) 37
2.3.3 Phương pháp Luminex/xTAG RVP 43
2.3.4 Phân lập 45
2.3.5 Phản ứng xác định trình tự chuỗi nucleotide (sequence) 47
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 50
A/H1N1pdm/09
Vi rút cúm A/H1N1 đại dịch 2009
CDC
Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm
Phòng ngừa và kiểm soát bệnh, Mỹ)
dNTP
Deoxiribonucleotide 5‟-triphosphates
ELISA
Enzyme linked-immusorbent assay (Thử nghiệm hấp phụ
miễn dịch gắn enzyme)
HA
Hemagglutination test (Phản ứng ngưng kết hồng cầu)
HAI
Hemagglutination Inhibition Test (Phản ứng ngăn ngưng
kết hồng cầu)
KN
Antigen (Kháng nguyên)
KT
Antibody (Kháng thể)
RSV
Respiratory Syncytial Virus (Vi rút hợp bào đường hô
hấp)
RT-PCR
Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (Phản
ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược)
TCYTTG
World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)
VĐHHC
Viêm đường hô hấp cấp
WHO
nhanh phòng thí nghiệm bằng các kỹ thuật sinh học phân tử, đặc điểm di truyền,
đặc tính kháng nguyên của các tác nhân vi rút gây bệnh VĐHHC hiện chưa được
áp dụng rộng rãi, đó là lý do chúng tôi tiến hành nghiên cứu:
2
“Tìm hiểu các căn nguyên vi rút gây viêm đường hô hấp cấp của một số bệnh
nhân điều trị ở bệnh viện đa khoa Việt Tiệp - Hải Phòng 2010-2012”.
Với mục tiêu:
1. Xác định các tác nhân vi rút gây viêm đường hô hấp cấp của bệnh
nhân điều trị tại bệnh viện đa khoa Việt Tiệp Hải Phòng bằng phương pháp RT-
PCR và Luminex/xTAG RVP.
2. Tìm hiểu đặc điểm di truyền của vi rút cúm thông qua phân tích các vi
rút cúm được phân lập
3. Hoàn thiện quy trình chẩn đoán sớm nhiễm vi rút đường hô hấp trên
bệnh phẩm lâm sàng bằng kỹ thuật RT- PCR thông dụng (conventional RT-PCR).
4
Coronaviridae
- Vi rút gây hội chứng viêm đường hô hấp cấp
tính nguy hiểm (Severe acute respiratory
syndrome coronavirus - SARS-CoV)
1.1.1. Vi rút họ Orthomyxoviridae
1.1.1.1 Hình thái:
Orthomyxoviridae là họ vi rút đa hình thái, có vỏ ngoài, genome là ARN
đơn, âm, phân đoạn. Trước đây, các vi rút Orthomyxo và Paramyxo đều được
xếp chung vào một họ là Myxoviridae do chúng có cấu trúc và khả năng lây bệnh
giống nhau, nhưng về sau được tách thành 2 họ riêng là Orthomyxoviridae và
Paramyxoviridae do phát hiện thấy chúng còn nhiều đặc điểm cơ bản không
giống nhau [13, 51].
4
Vi rút Orthomyxoviridae gồm 5 nhóm vi rút: vi rút cúm A, vi rút cúm B, vi
rút cúm C, vi rút Thogoto và vi rút Isa [51]. Trong đó vi rút cúm A lưu hành phổ
biến trên gia cầm, người và các động vật khác như lợn, ngựa… là căn nguyên
gây nên các đại dịch lớn trên toàn cầu. Vi rút cúm B thường gây bệnh nhẹ nhưng
cũng có thể bộc phát thành dịch vào mùa đông, đặc biệt là ở trẻ em. Vi rút cúm C
chưa thấy biểu hiện gây bệnh nguy hiểm cho người.
Hình 1.1. Mô hình cấu trúc virion của vi rút cúm [18]
Virion có vỏ đa hình thái, thường có hình cầu với cấu trúc xoắn, đường kính
80-120nm nhưng đôi khi cũng thấy dạng sợi dài đến vài µm. Genome của vi rút
cúm A và B được chia thành 8 phân đoạn, đơn âm với tổng khối lượng 5x10
6
cũng đóng vai trò quan trọng trong việc lây truyền vi rút cúm. Vi rút cúm người
gắn vào thụ cảm thể trên tế bào chủ tại cổng 2.6 (SAα- 2,6 Gal) [43].
Phân đoạn gen NA có 1413 nucleotid mã hóa cho 453 axit amin. Protein
NA có bản chất là một enzyme đóng vai trò quan trọng trong việc giải phóng vi
rút từ tế bào nhiễm và lan trải vi rút trong đường hô hấp. Các đột biến tại vị trí
axit amin: 275, 295 ở NA của típ N1 hay 292 ở NA của típ N2 liên quan sự
kháng hoặc giảm độ nhạy của thuốc kháng vi rút (Osertamivir và Zanamivir). Sự
đột biến này được cho là kết quả của quá trình cạnh tranh sinh học [19, 34, 35,
42, 44] 6
1.1.1.3 Cơ chế nhân lên
Hình 1.2. Chu trình nhân lên của vi rút cúm[48]
- Đầu tiên, vi rút sẽ gắn vào các thụ thể đặc hiệu trên màng sinh chất nhờ
gai glycoprotein HA. Vi rút xâm nhập vào bên trong tế bào theo cơ chế nhập bào.
Màng tế bào bao lấy vi rút, tạo bọng (endosome) nằm bên trong tế bào chất. Quá
trình dung hợp với màng endosome làm giải phóng nucleocapsid vào tế bào chất
và được vận chuyển vào trong nhân tế bào.
- Trong nhân sợi ARN (-) ban đầu được làm khuôn để tổng hợp nên sợi ARN
(+) theo cơ chế bổ sung cARN (+) nhờ enzyme ARN - polymerase phụ thuộc ARN
của vi rút. Chính các cARN (+) này lại được dùng làm khuôn để tổng hợp các sợi
ARN (-) mới là nguyên vật liệu di truyền của vi rút. Các sợi ARN (-) được tạo thành
này là một sợi hoàn chỉnh về độ dài và một phần được phiên mã tạo ra các mARN
(+) ngắn hơn. Sau đó, quá trình dịch mã thành các protein chức năng xảy ra ở tế bào
chất.
7x10
6
. Bao quanh nucleocapsid đối xứng xoắn là màng M có cấu tạo từ protein
M không được glycosyl hoá. Phía ngoài màng M là vỏ ngoài với các gai
glycoprotein bề mặt dài khoảng 8nm.
Virion bị bất hoạt bởi các dung môi hoà tan lipid, chất tẩy rửa,
formaldehyde, các chất oxy hoá…
Đặc điểm đặc trưng là hạt vi rút được bao bọc bởi 2 lớp vỏ lipid với các gai
glycoprotein mang tính kháng nguyên [13].
Phần vỏ bao của vi rút Paramyxo bao gồm hai cấu trúc glycoprotein: H-N
và F. Chúng tạo nên các gai trên bề mặt của hạt vi rút. Các glycoprotein lớn H, N
có vai trò của hemagglutinin và neuraminidase là men ngưng kết hồng cầu động
vật lông vũ và giúp sự hấp phụ (adsorbtion) của vi rút trên tế bào cảm thụ. Cấu
trúc protein khác, ký hiệu F, có vai trò kết dính các thành phần của hạt vi rút
trong tế bào và giúp vi rút xâm nhập qua màng tế bào cảm thụ. Hoạt động xâm
nhập của yếu tố F là nhờ sự hoạt hoá bởi phần giải protein (proteolytic) làm cho
men sớm của tế bào chủ tạo F thành Fo rồi cắt thành F1 và F2. F1, F2 hoạt động
8
để có sự hoà nhập của vi rút vào màng tế bào do đó ARN vi rút xâm nhập vào
được tế bào [13].
1.1.2.2 Cấu trúc phân tử
Bô
̣
gen cu
̉
a ca
́
9
Phân lớp pneumovirinae (hMPV và RSV) không có enzyme
neuraminidase. Protein G không có hemagglutinin mà nó đảm nhiệm chức năng
năng thay cho hemagglutinin để gắn vào thụ thể của tế bào.
Hình 1.3. Mô hình cấu trúc virion của vi rút họ Paramyxoviridae [31]
1.1.2.2 Cơ chế nhân lên
Trong quá trình gây nhiễm trùng, vi rút Paramyxo xâm nhập vào tế bào tạo
tế bào khổng lồ. Khả năng xâm nhập tế bào này được sử dụng như một đặc điểm
quan trọng để chẩn đoán bệnh.
Có thể xâm nhiễm vào nhiều loại tế bào nuôi cấy mô. Xâm nhập nhờ dung
hợp giữa vỏ ngoài vi rút với màng sinh chất của tế bào chủ. Quá trình phiên mã
và nhân lên đều diễn ra trong tế bào chất. Virion trưởng thành chui ra ngoài theo
lối nảy chồi. Các tế bào nhiễm thường bị tan ra, nhưng cũng xảy ra sự dụng hợp
tế bào với nhau để tạo ra thể hợp bào, thể vùi
1.1.3 Vi rút họ Picornaviridae
10
Picorna bắt nguồn từ chữ pico là nhỏ, rna là axit ribonucleic. Họ
Picornaviridae có chứa rất nhiều vi rút gây bệnh quan trọng cho người và động
vật, bao gồm vi rút polio, viêm gan A, vi rút bệnh lở mồm long móng (Foot and
mouth disease virus-FMDV), và vi rút rhino [13, 51]. Theo ủy ban phân loại vi
rút quốc tế, họ Picornaviridae gồm:
- Vi rút aphto bệnh lở mồm long móng.
- Vi rút avihepato gây bệnh viêm gan A ở vịt.
- Vi rút cardio gây bệnh viêm não, viêm cơ tim ở loài gặm nhấm
- Vi rút Entero gồm có vi rút polio, coxsackie, Echo
capsid, ARN lập tức bắt đầu dịch mã ở lại trí gần đầu 5‟ để tạo thành một
polyprotein. Polyprotein này lúc đầu phân cắt thành 3 protein tiền chất là VP1,
VP2 và VP3. Mỗi protein lại tiến hành phân cắt tiếp:
- VP1 cắt ra thành VP1A, VP1B, VP1C và VP1D. Đó là protein capsid.
- VP2 cắt thành VP2A, VP2B. Đó là kháng nguyên của vật chủ và VP2C
tham gia vào tổng hợp ARN.
- VP3 tiến hành tự cắt thành VP3A, VP3B (VPg), VP3C (protease dùng
phân cắt hầu hết các protein) và VP3D (ARN polymerase làm nhiệm vụ kéo dài
chuỗi ARN mới tổng hợp trên khuôn ARN). Sợi (-) được tổng hợp trên khuôn sợi
(+). Đầu sợi (+) được uốn lại thành hình kẹp tóc để làm mỗi cho tổng hợp sợi (-).
Kết quả là tạo ra một phân tử “đúp”, có chiều dài gấp đôi genome.
12
VP9 ARN vi rút Poly A
5‟ 3‟
Dịch mã
Polyprotein
Phân cắt
VP1 VP2 VP3
VP0 VP1 VP3 Protease, VP9, ARNpolymerase VP2 VP4
Hình 1.5. Sơ đồ sinh tổng hợp protein của vi rút polio [12]
chứng về khả năng gây bệnh cho người của chi Torovirus, do vậy chi này ít được
quan tâm.
Các thành viên của Coronavirus bao gồm :
- Vi rút corona gây bệnh cho người - HCV (human corona virus) và năm
2003 đã phát hiện thêm vi rút corona gây hội chứng viêm đường hô hấp cấp
- SARS
- Các vi rút corona khác gây bệnh cho gà (viêm phế quản), chuột (viêm gan,
dạ dày, viêm não), lợn (viêm ruột - dạ dày, viêm não), chó, gà tây, gia cầm,
ngựa (sưng tuyến nước bọt) và mèo (viêm phúc mạc).
1.1.4.2 Quá trình nhân lên
Vi rút corona bám vào thụ thể của tế bào đích nhờ protein S. Sau khi xâm
nhập vào tế bào, chúng dịch mã tạo thành ARN – polymeraza phụ thuộc ARN.
14
Enzyme này tiến hành phiên mã để tạo sợ ARN âm rồi sợi này lại được dùng làm
khuôn để tạo genom ARN dương và mARN. mARN tiến hành dịch mã để tạo
protein cấu trúc (capsit). Quá trình nhân lên xảy ra trong tế bào chất. Sau khi lắp
ráp vi rút nảy chồi từ bộ máy Golgi chứ không phải từ màng tế bào chất. Các
protein M đã được gắn sẵn vào màng của bộ máy Golgi. Khi vi rút chui ra được
bọc bởi protein M và nằm trong bào nang. Bào nang vận chuyển đến tế bào chất
rồi tiến hành dung hợp sau đó được đẩy ra ngoài [13].
Các tế bào nhiễm vi rút có thể bị phân giải nhưng chúng có thể dung hợp với
nhau dưới dạng hợp bào. Trong thể hợp bào, vi rút có khả năng tồn tại lâu. Nhiệt
độ thích hợp cho quá trình nhân lên của vi rút là 33
o
C, tương đương với nhiệt độ
môi trường sống ở đường hô hấp trên.
kinh tế lớn. Cuối tháng 12 năm 2003 và những tháng đầu năm 2004, dịch cúm gia
cầm đã gây thiệt hại lớn về kinh tế cho các nước Châu Á, trong đó Việt Nam và
Thái Lan là 2 nước có cúm gia cầm lây truyền sang người gây tử vong 26 trường
hợp [38].
Đại dịch cúm năm 2009 do tác nhân là vi rút cúm A/H1N1 là vi rút cúm
hoàn toàn mới được tích hợp gen từ vi rtus cúm lợn (H1N1; H3N2), vi rút cúm
gia cầm (H5N1), vi rút cúm người (H3N2) lần đầu tiên được xác định vào tháng
3 năm 2009 tại Mexico. Trong thời gian ngắn, vi rút cúm A/H1N1pdm/2009 đã
lây truyền trên phạm vi toàn cầu. Ngày 11 tháng 6 năm 2009, Tổ chức Y tế Thế
giới (WHO) đã chính thức công bố đại dịch cúm toàn cầu, và tại thời điểm đó vi
rút đã ghi nhận tại 74 quốc gia, 28.774 người và 144 trường hợp tử vong[64].
Vi rút a
́
cu
́
m phân típ 1- 3 gây bệnh đường hô hấp trên, gặp ở mọi lứa tuổi,
tuy nhiên trẻ em có xu hướng cảm nhiễm nhiều hơn. Vi rút này xuất hiện nhiều
nơi khác trên toa
̀
n thế giơ
́
i, lây truyền qua đươ
̀
ng hô h ấp và lan truyền ở tập thê .
Vi rút a
́
cu
́
m là căn nguyên của 1/3 số nhiê
̃
̣
nh ba
̣
ch hầu thanh qua
̉
n), bé trai có xu hướng cảm nhiễm nhiều hơn bé ga
́
i. Vi
rút á cúm típ 3 thươ
̀
ng gây nhiê
̃
m bê
̣
nh đươ
̀
ng hô hấp dươ
́
i như là viêm tiểu phế
quản và viêm phổi . Vi rút á cúm típ 4 thường lưu hành ở Châu Phi và gây bệnh
nhẹ đường hô hấp trên [13].
Vi rút hợp bào đường hô hấp (Respiratory Syncytial Virus-RSV) là một
trong những căn nguyên gây bệnh viêm đường hô hấp chủ yếu ở trẻ nhỏ. Dịch
thường xảy ra vào mùa đông và mùa xuân. RSV phân bố khắp nơi và có những
yếu tố dịch tễ riêng, hàng năm có thể bùng phát thành dịch và kéo dài khoảng 5
tháng, từ tháng 12 đến tháng 4, đỉnh dịch thường vào tháng 1 hoặc tháng 2 [29,
30, 50]. Ở Anh, nhiễm RSV thường xảy ra từ tháng giêng đến tháng ba và nó có
thể thay đổi từ năm này qua năm khác. Ở Mỹ, RSV xuất hiện vào mùa đông và
kéo dài tới mùa xuân [29]. Ở Washington DC, số trẻ em nhập viện có triệu chứng
giống RSV, viêm đường hô hấp dưới cao hơn 2,7 lần. Dịch lớn có thể dao động
trường hợp mắc, trong đó 15 trường hợp tử vong được xác định, vi rút cúm
A/H5N1 tiếp tục lưu hành trong quần thể gia cầm nuôi và tuyền bệnh sang một
số người trong những năm tiếp theo[38].
Sự lây truyền của vi rút cúm A/H1N1pdm/09 đã ảnh hưởng tới Việt nam,
trường hợp nhiễm vi rút đầu tiên được xác định vào ngày 31/5/2009 tại thành
phố Hồ chí Minh, và nhanh chóng vi rút cúm A/H1N1pdm/09 đã lây truyền
trong cộng đồng ( 10/7/2009. Theo báo cáo của Bộ Y tế Việt Nam, tính đến ngày
30 tháng 9 năm 2009, Việt Nam có 9.868 trường hợp mắc cúm A/H1N1-pdm/09,
trong đó có 22 ca tử vong.
Trong những năm gần đây, đã có nhiều công trình nghiên cứu về căn
nguyên gây VĐHHC ở các vùng miền khác nhau trong cả nước. Nghiên cứu của
GS. TS. Huỳnh Phương Liên và cộng sự về các chủng vi rút cúm và các vi rút
gây VĐHHC ở Hà Nội năm 2001 chủ yếu là vi rút cúm B (74%), sau đó là vi rút
cúm A/H1N1 (20,78%), các vi rút gây VĐHHC khác như vi rút họ Picorna
(51,28%) và RSV phân típ B là 10,26%[9]. Một nghiên cứu khác ở Tây Nguyên
năm 2003 đã cho thấy 13,9% là chủng vi rút cúm A/H3N2, xuất hiện gần như
quanh năm và cao nhất vào tháng 9. Ngoài ra, các vi rút gây VĐHHC khác như
vi rút hợp bào đường hô hấp (RSV), hMPV và các vi rút đường ruột (họ
Picorna) cũng là căn nguyên gây viêm đường hô hấp ở Tây Nguyên (18,2%) [5].
Nhóm nghiên cứu gần đây nhất về vi rút gây bệnh VĐHHC ở trẻ em miền Trung
19
Việt Nam năm 2007 đã cho thấy căn nguyên chính là vi rút rhino (28%), RSV
(23%), vi rút cúm (15%), hMPV (4,5%), vi rút á cúm (5% )[84].
Tại Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, tác giả Ngô Hương Giang và cộng sự
cũng đã xác định có 9 tác nhân vi rút gây VĐHHC của các bệnh nhân tại miền
bắc Việt Nam trong giai đoạn 2007-2009. Kết quả nghiên cứu cho thấy vi rút
thuộc họ Picorna là tác nhân gây bệnh có tỷ lệ cao nhât (36.18%), vi rút cúm
và B. Tuy nhiên do vi rút cúm thay đổi liên tục và hiệu lực của vắc xin phụ thuộc
vào sự tương đồng giữa chủng sản xuất vắc xin và chủng vi rút cúm đang lưu
hành.
- Việc tiêm vắc xin được ưu tiên cho ba nhóm đối tượng:
+ Nhóm đối tượng có nguy cơ cao: người già, người tàn tật, người mắc bệnh
mãn tính về tim, phổi, thận
+ Nhóm tiếp xúc với các tác nhân gây nhiễm: nhân viên phòng thí
nghiệm…
+ Nhóm người làm việc tại các dịch vụ công cộng: cảnh sát…
- Vắc xin cúm hiện tại có nhiều loại khác nhau bao gồm vắc xin bất hoạt
(inactivated vaccine), vắc xin sống giảm độc lực (live attenuated influenza virus-
LAIV) và vắc xin sống bất hoạt bằng công nghệ di truyền ngược (reassortment
vaccine).
- Vắc xin cúm mùa đang dùng phổ biến là vắc xin sống bất hoạt, đa giá.
Hiện nay do vi rút cúm A/H1N1 ít lưu hành, tổ chức Y tế Thế giới khuyến cáo sử
dụng vắc xin gồm 3 chủng vi rút cúm đối với khu vực Bắc bán cầu (Việt Nam)
mùa cúm 2012 bao gồm:
Vi rút cúm đại dịch A/H1N1/09: A/California/7/2009 (H1N1)pdm09
Vi rút cúm A/H3N2: A/Perth/16/2009 (H3N2)
Vi rút cúm B: B/Brisbane/60/2008 [69]
b, Vắc xin cúm A/H5N1
Hiện nay, vắc xin phòng bệnh cúm A/H5N1 cho người vẫn đang được một
số nước trên thế giới và Việt Nam nghiên cứu, sản xuất ở quy mô phòng thí
Copyright: Tài liệu đại học ©