ỨNG DỤNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ CHẨN ĐOÁN BỆNH PHONG
VÀ CÁC BỆNH LÂY TRUYỀN QUA ĐƯỜNG TÌNH DỤC
TẠI BỆNH VIỆN PHONG - DA LIỄU TRUNG ƯƠNG QUY HOÀ
Nguyễn Phúc Như Hà
Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào thực tế ngày nay đã trở thành công nghệ, đặc biệt là trong
ngành y. Sinh học phân tử xâm nhập hầu hết vào tất cả các lĩnh vực, trong đó mạnh nhất là lĩnh vực chẩn
đoán, điều trị và phòng ngừa. Việc phát hiện các tác nhân gây bệnh bằng phương pháp sinh học phân tử có
nhiều thuận lợi hơn các phương pháp cổ điển. Thứ nhất: tiết kiệm thời gian vì không phải nuôi cấy, thứ hai:
Có thể phát hiện các tác nhân không thể nuôi cấy hay khó nuôi cấy như vi khuẩn phong, lao, Chlamydia, các
tác nhân ký sinh trùng ngay trên vật chủ trung gian và các tác nhân virus khác. Thứ 3: Các ứng dụng chuyên
biệt khác trong lĩnh vực di truyền, miễn dịch, dược lý, vaccin… ở mức phân tử.
Tại bệnh viện Phong-Da liễu TW Quy hoà, ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện các tác
nhân gây bệnh như Vi khuẩn phong, lao, Chlamydia, lậu cầu khuẩn, HSV, HPV, HIV, HBV và HCV …
Ngoài ra còn có thể định type HPV phân nhóm nguy cơ cao gây ung thư cổ tử cung, định type HSV1-2,
Realtime-PCR định lượng và theo dõi điều trị trong nhiễm HBV, HCV… đặc biệt ứng dụng Realtime-PCR
thử nghiệm phát hiện đột biến điểm liên quan kháng thuốc trên vi khuẩn phong.
1. Multiplex PCR phát hiện đồng thời Chlamydia và N.gonorrhoeae
Hiện nay các phương pháp nuôi cấy hay kháng nguyên để chẩn đoán C. trachomatis và N. gonorrheae
không đủ nhạy cảm trên các đối tượng nhiễm Chlamydia, nhiễm lậu cầu không triệu chứng hay mạn tính. Do
vậy các phương pháp khuếch đại nucleic acide hiện đang rất được quan tâm để áp dụng. Có nhiều phương
pháp khuếch đại nucleic acide đã được thương mại hóa như các phương pháp dựa vào kỹ thuật LCR (Abbott),
PCR (Roche)
(11)
, TMA (Bayer), hay SDA (BD). Trong các phương pháp này, dễ tiếp cận nhất là phương pháp
PCR vì đây là phương pháp mà các nhà nghiên cứu dễ dàng thiết kế nhất và không cần phải bị phụ thuộc vào
một hệ thống kín nào. Mục tiêu chính của multiplex PCR là phát hiện được đồng thời cả hai tác nhân C.
trachomatis và N. gonorrhoeae có trong bệnh phẩm lâm sàng. Kết quả nghiên cứu cho thấy, Multiplex PCR
có khả năng phát hiện rất cao, có thể nói là lý tưởng đạt mức phát hiện tối thiểu chỉ cần 1 DNA bộ gen của vi
khuẩn đích có mặt trong mẫu thử là có thể phát hiện được. Mẫu thử là các trích biệt DNA từ các huyền dịch vi
khuẩn N. gonorrhoeae và C. trachomatis và mẫu bệnh phẩm lâm sàng như dịch niệu đạo, nước tiểu nam giới,
phết cổ tử cung.

C.psi
t
259
C.pne
u
258
M C.tra
90
89
C.tra
90
89
C.psi
190
69
C.pn
e
199
59
C.tra
245
C.tra
245
C.psi
189
70
C.pn
e
258
66

Hình 8: Kết quả ts-PCR
định type HPV type 68,
39, 51 và 66
Hình 9: Kết quả ts-PCR
định type HPV type 16,
18, 31, 59 và 45
- Kỹ thuật Nested-Multi PCR (NMPCR) cũng được ứng dụng, hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm đồng
thời 3-4 cặp mồi sao cho sản phẩm PCR có độ dài khác biệt để có thể phân biệt được trên thạch điện di. Kỹ
thuật đòi hỏi nghiêm ngặt các điều kiện về nhiệt độ, nồng độ các thành phần của hỗn hợp PCR và việc chọn
lựa các cặp mồi… để phản ứng khuếch đại đặc hiệu có thể xảy ra.
Hình 10: Phát hiện và định
type HPV bng kỹ thuật
NMPCR
Thống kê tại khoa xét nghiệm Bệnh viện Phong Da liễu Trung ương Quy hoà:
- Có 102/126 mẫu (80%) bệnh phẩm dịch cổ tử cung của bệnh nhân được chẩn đoán “tổn thương tế bào
gai mức độ thấp LSIL/HPV” cho kết quả dương tính với PCR-HPV.
- 170/175 (97%) mẫu bệnh phẩm là u sùi sinh dục của bệnh nhân được chẩn đoán sùi mào gà cho kết
quả dương tính với PCR-HPV và 100% thuộc type HPV-6/11.
- Lấy ngẫu nhiên 100 mẫu bệnh phẩm là phết cổ tử cung của bệnh nhân STD được chỉ định làm PCR-
Chamydia trachomatis, có 26/100 (26%) mẫu cho kết quả dương tính với PCR-HPV. Kết quả này phù hợp
với nhiều thống kê khác, cho thấy tình hình dịch tể của HPV không chỉ đối với ung thư cổ tử cung mà còn là
vấn đề cần thiết phải quan tâm trong các bệnh lây truyền qua đường tình dục.
4. Multiplex-PCR phát hiện và định type HSV
Herpes sinh dục là một bệnh do virus Herpes Simplex HSV
1
và HSV
2
gây nên nhưng chủ yếu là HSV
2.
Là bệnh cấp tính lây truyền qua đường tình duc. Bệnh tái phát dai dẳng, người lành mang mầm bệnh và người

(Các trường hợp tiểu biểu cho kết quả dương tính với TB-PCR)
6. PCR và Realtime-PCR phát hiện và định lượng HBV
Kỹ thuật này ngày nay trở thành một công cụ hữu ích trong chân đoán và theo dõi điều trị các trường
hợp nhiễm HBV. Một người có xét nghiệm HBsAg dương tính thì cần thiết phải cho chỉ định làm thử nghiệm
xác định xem trong máu của người nhiễm có mang HBV hoàn chỉnh hay không bằng xét nghiệm PCR phát
hiện HBV-DNA, và nếu dương tính thì cần phải biết số lượng HBV hoàn chỉnh có trên 10
5
copies/1ml hay
không bằng xét nghiệm Realtime-PCR để định lượng HBV-DNA. Nếu lượng HBV trong máu dưới 10
5
thì
không cần thiết phải điều trị vì HBV vẫn còn nhân bản rất giới hạn trong tế bào gan và chưa gây tổn hại tế bào
gan. Nhưng nếu lượng virus ≥10
5
thì cần phải xem xét gan có bị tổn thương chưa thông qua xét nghiệm men
gan. Do vậy, sau khi đã bắt đầu điều trị bệnh nhân phải thường xuyên theo dõi hiệu quả điều trị đặc hiệu bằng
cách phải định kỳ mỗi 3 tháng cho bệnh nhân làm xét nghiệm định lượng HBV-DNA (nếu lượng HBV-DNA
vẫn còn định lượng được) hay PCR định tính phát hiện HBV-DNA (nếu HBV-DNA dưới ngưỡng phát hiện
định lượng). Nếu sau một thời gian điều trị đặc hiệu (thường là 3 tháng) mà lượng virus không giảm quá 2 log
(100 lần), hay không đạt đến ngưỡng 10
3
/ml, hay trong quá trình điều trị, xét nghiệm HBV-DNA dương tính
trở lại, bác sĩ điều trị phải nghĩ đến khả năng virus kháng thuốc, đặc biệt là kháng lamivudine.
HBV-PCR định tính
Sản phẩm có chiều dài 259bp
Hình 17 : Đường biểu diễn quá trình nhân bản DNA theo thời gian
của phản ứng Realtime PCR định lượng HBV. Phản ứng tiến hành
song song với 3 nồng độ chuẩn để định lượng nồng độ DNA có
trong mẫu thử.
7. Realtime-PCR sử dụng Hairpin primer phát hiện điểm đột biến liên quan kháng thuốc DDS,

quan gây kháng thuốc. Kết quả là giống nhau khi so sánh với PCR- sequencing. Tận dụng khả năng của thử
nghiệm này là: đơn giản, nhạy, nhanh chóng và giá thành không cao. Đây là lợi thế cho việc ứng dụng kỹ
thuật này trên M. leprae cũng như những tác nhân gây bệnh khác ví dụ M.tuberrculosis. Biểu đồ 2: Đường biểu diễn độ hấp phụ huỳnh
quang của phản ứng khuếch đại của cặp mồi
bắt cặp hoàn toàn xuất hiện sớm hơn so với
các cặp mồi khác.
Thai53-wild type
Ct: 11-15-20-22
P55L-C ;P55L-T; P55L-A; P55L-G
Zensho-4-53- aTc
Ct: 10-15-19-25
T53I-T; T53I-G; T53I-C; T53I-A
Thai53-wild type
Ct: 10-14 -19- 27
P53I-C; T53I-T; T53I-G; T53I-A
QH35-53- aTc
Ct: 11 -13- -19- -27
T53I-T; T53I-G; T53I-C; T53I-A; T53I-A.
Pakistan-53-Gcc
Ct:12- 16 –22 –30
T53A-G; T53A-A; T53A-Ta; T53A-C
Qh9-55-cGc
Ct: 13-17-23-24
P55L-G; P55L-A; P55L-Ta; P55L-C