BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
**********
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
SO SÁNH TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ ENZYME THUỶ PHÂN
ĐỂ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN B
1
TRONG GẠO
Người hướng dẫn: TS. Lê Thị Hồng Hảo
DS. Trần Cao Sơn
Sinh viên thực hiện: Lê Thị Khánh Loan
Lớp: CNSH 06-04
Hà Nội 2010
LỜI CẢM ƠN
Nhân dịp hoàn thành khó luận tốt nghiệp cho phép tôi được bày tỏ lòng
biết ơn sâu sắc và lời cảm ơn chân thành tới:
TS. Lê Thị Hồng Hảo -Viện phó Viện Kiểm Nghiệm Vệ Sinh An Toàn
Thực Phẩm Quốc Ga , DS. Trần Cao Sơnv à KS. Lê Thị Thý , h ững g ười
đã r ực i ếph ướngd n , i úp đỡtĩ i. Đồng h i ,tơ i xin hõ n h ànhc ảmơ n banl
ãnh đạo i ện i ểm Ngi ệmV ệ Sinh An o àn h ực h ẩm u ốc Giac ùng o àn h ểc
ác anh h ịc ánb ộ iâ n trong i ện đã i úp đỡv àt ạođi ều i ện chotơ i trong u á r
ình ngiâ nc ứuv à h ực i ện ko á u ậnn y
Tĩi cũng xin chõn thành cảm ơn các thầy cụ, cán bộ cuả khoa Cụng
Nghệ Sinh Học - Viện Đại Học Mở Hà Nội đã dạy dỗ, chỉ bảo, tạo điều kiện
tốt cho tĩi học tập, tạo cơ hội cho tĩi đi thực tập và làm khoá luận tốt nghiệp.
Cuối cũng xin cảm ơn gia đình, bạn bố đã động viân,giúp đỡ tĩi trong
thời gian qua.
Hà Nội, tháng 5 năm 2010
Sinh viân

Bảng 3.3.9. Hiệu suất thu hồi của vitamin B1 ở các nồng độ khác nhau. 45
Bảng 3.3.10: Kết quả phân tích mẫu thực tế 46
DANH MỤC HÌN
Hình 2.3.3: Sơ đồ mô tả hệ thống HPLC 27
Hình 3.1.4: Sắc đồ Vitamin B1 sử dụng cột Symmestry Water C18 34
(250mm × 4,6mm × 5µm) 34
Hình 3.1.5: Sắc đồ chạy chuẩn 0,50 ppm tại tốc độ dòng 0,8 ml/phút 37
Hình 3.3.6: Sắc đồ chạy chuẩn vitamin B1 0,025ppm 43
Hình 3.4.8: Sắc đồ chạy mẫu gạo RN64 47
Hình3.4.9: Sắc đồ chạy mẫu gạo Nàng Xuân 48
Hình3.4.10: Sắc đồ chạy mẫu gạo nếp Ốc 48
Hình 3.4.11: Sắc đồ chạy mẫu gạo Tám 48
Hình 3.4.12: Sắc đồ chạy mẫu gạo tẻ thường 49
Hình3.4.13: Sắc đồ chạy mẫu gạo nếp nương Điện Biên 49
Hình3.4.14: Sắc đồ chạy mẫu gạo Tài Nguyên 49
Hình 3.4.15: Sắc đồ chạy mẫu gạo nếp Cái Hoa Vàng 50
Hình 3.4.16: Sắc đồ chạy mẫu gạo lứt 50
Hình 3. : Sắc đồ chạy chuẩn vitamin ại ồng độ 0, pp 57
Hình 4. : Sắc đồ chạy mẫu dựng Clara –diastase 5 59
Hình 4. : Sắc đồ chạy mẫu dựng Clara –diastase 10 60
ình 4.5: ắc đồ c ạy ẫu ùng C a a- ia tase15 60
Hình 5. : Sắc đồ chạy mẫu với enzyme α-amylas 60
Hình 5. : Sắc đồ chạy mẫu với Taka diastase 61
ìn 5.4: ắc đồ ẫu ùng Taka ia tase t m 34,6µg ch ẩ 61
MỤC LỤ
MỞ ĐẦU 1
PHẦN I 3
TỔNG QUAN 3
1.1. Giới thiệu chung về vitamin [5], [11] 3
1.1.1. Định nghiã[11] 3

2.2.2. Đánh giỏ phương pháp đã xây dựng 25
2.2.3. Ứng dụng phương pháp xác định vitamin B1 trong một số loại gạo 25
2.3. Phương pháp nghiên cứu 25
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu 25
2.3.2. Phương pháp phân tích vitamin B1 25
2.3.3. Phương pháp xử lý kết quả 32
PHẦN III 33
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33
3.1. Tối ưu hoá các điều kiện để tách và xác định vitamin B1 bằng HPLC 33
3.1.1. Lựa chọn detector và bước sóng phát hiện 33
3.1.2. Lựa chọn cột tách 33
3.1.3. Lựa chọn pha động 34
3.1.4. Khảo sát tốc độ dòng 36
3.2. So sánh một số enzyme thủy phân để tối ưu hoá quy trình xử lý mẫu 38
3.2.1. Khảo sát hàm lượng enzyme tối ưu cho quá trình xử lý mẫu 38
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của enzyme tới hiệu suất thu hồi 39
3.3. Đánh giá phương pháp phân tích 40
3.3.1. Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn 41
3.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD) 43
3.3.3. Giới hạn định lượng (LOQ) 44
3.3.4. Xác định độ lặp lại 44
3.3.5. Xác định độ thu hồi 45
3.4. Ứng dụng phân tích mẫu thực tế 45
PHẦN IV 51
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51
4.1. Kết luận 51
4.2. Đề nghị 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO 53
PỤ Ụ 56
Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội

hơn nữa chúng còn có sự ràng buộc với protein. Sau đó, thiamin tự do được
oxy hóa thành thiochrom và định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao HPLC sử dụng detectơ huỳnh quang RF.
Hiện nay ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về hàm lượng vitamin
B
1
trong ngũ cốc nói chung và gạo nói riêng. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành
nghiên cứu đề tài: “So sánh tác dụng của một số enzyme thuỷ phân để xác
định hàm lượng vitamin B
1
trong gạo” với các mục tiêu:
- Khảo sát điều kiện chạy máy sắc ký lỏng hiệu năng cao để phân tích
vitamin B
1
.
Lê Thị Khánh Loan 06-04 K13 Khoa
CNSH
1
Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội
- So sánh tác dụng của một số enzyme thuỷ phân để khảo sát quá trình
tách chiết vitamin B
1
trong gạo.
- Đánh giá phương pháp xác định hàm lượng vitamin B
1
.
- Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng vitamin B
1
trong một số
loại gạo trên thị trường Hà Nội.

1. 2. Vài nét về vitamin B
1
[5], [11]
1.2.1. Lịch sử
Năm 1911, nhà bác học Casimir Funk đã phân lập được từ cám gạo một
yếu tố có hoạt tính và cho rằng nó là một loại yếu tố mới trong thực phẩm,
yếu tố này cú tác dụng điều trị bệnh viâm nhiều dây thần kinh. Ông đặt tên là
vitamine sau rút gọn thành vitamin và cuối cùng gọi là vitamin B
1
. Năm 1926,
hợp chất này đã được phân lập dưới dạng kết tinh bởi Jansen và Donath, và
cấu trúc hoá học của nó được xác định bởi Willians vào năm 1936. Hội đồng
dược và hoá học chấp nhận tên gọi thiamin đối với chất kết tinh vitamin B
1
.
1.2.2. Cấu tạo và tính chất
1.2.2.1. Cấu tạo
Gồm 1 vòng pyrimidin và nhóm thiazol nối với nhau qua cầu nối
metylen
Công thức hoá học:
C
12

1
7
4

Tân khoa hoc: 3-[(4- amio-2- methyl-5- pyrimdinyl) methyl]-5-(2-
hydroxyethyl)-4 - methyl thiazol.
Tên gọi khác: Thiamin.

1
tồn tại dưới dạng tinh thể màu trắng, tan nhiều trong nước,
khó tan trong ethanol 960 và methanol, không tan trong clorofom và
ether. rất nhạy cảm với nhiệt và bị phân huỷ phần lớn khi làm chín,
hoặc xử lý trong lò vi sóng. ngược lại, sự đông lạnh không làm thay đổi
hàm lượng của nó. Vitamin B
1
có mùi đặc biệt của men. Nỉ dễ hút ẩm
và ở trạng thái khô thì vững bền. Trái lại trong dung dịch, nó dễ bị oxy
hoá và dễ bị phá huỷ.
 Độ bền của thiamin phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, lực ion và các phần tử
phản ứng khác. Thiamin trong môi trường trung tính và đặc biệt trong
môi trường acid tương đối vững bền. Trong môi trường kiềm, thiamin
rất dễ bị phá huỷ, đặc biệt là khi có tác dụng của nhiệt độ.
 Do có tính bazơ nên vitamin B
1
tạo tủa với một số thuốc thử chung của
Alkaloid: tạo tủa với Hg
2
Cl, với I
2
, tanin, thuốc thử Mayer. Đặc biệt,
với acid silicovolframic tạo tủa có thành phần xác định nên ngoài việc
dựng thuốc thử này để định tính, người ta còn dựng nó để định lượng
thiamin.
 Trong môi trường kiềm, vitamin B
1
tác dụng với kali fericyanid tạo
thiocrom màu vàng và có huỳnh quang màu xanh da trời.
 Vitamin B

 Thiamin pyrophosphate còn tham gia thành phần coenzyme của
trancetolaza trong chuyển hoá pentoza. Vitamin B
1
cần cho quá trình
tổng hợp acid ribonucleic (RNA), acid deoxyribonucleic (DNA) là
những acid liên quan đến quá trình di truyền[34]. Vitamin B
1
cũng cần
cho quá trình tổng hợp nicotinamid adenin dinucleotid photphat khử
(NADP) cần cho tổng hợp acid béo mà các acid béo không no lại có rất
nhiều vai trò trong cơ thể (là thành phần của nhiều hợp chất có hoạt
tính sinh học cao như lipoprotein; là yếu tố cần thiết của màng tế bào,
các tổ chức liên kết, tổ chức thần kinh ).
 Ngoài ra, vitamin B
1
cùng với acid pantothenic còn tham gia tạo nên
chất acetylcholin là chất giữ vai trò quan trọng trong việc truyền xung
động thần kinh. Chính vì vậy mà khi thiếu vitamin B
1
, ở hệ thần kinh
nơi xảy ra trao đổi mạnh glucid, sẽ bị ảnh hưởng nhiều hơn cả[5].
 Khi thiếu B
1
có thể phát sinh bệnh beri-beri, còn gọi là bệnh tờ phù, do
quá trình trao đổi chất bị rối loạn[11].
Lê Thị Khánh Loan 06-04 K13 Khoa
CNSH
6
Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội
1.2.4. Nhu cầu [5]

Gạo nếp cái 0,13
Gạo tẻ máy 0,10
Thịt gà 0,15
Cải xong 0,07
Dưa hấu 0,03
Lê Thị Khánh Loan 06-04 K13 Khoa
CNSH
7
Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội
1.3. Tổng quan về enzyme
1.3.1. Khái niệm
Enzyme là chất xúc tác sinh học, có bản chất protein, hồ tan trong nước
và trong dung dịch muối lỏng. Enzyme có phân tử lượng lớn từ 20.000-
1.000.000 dalton [2].
1.3.2. Vai trò[5]
Enzyme có cường lực xúc tác rất lớn: ở điều kiện thích hợp hầu hết các
phản ứng có xúc tác enzyme xảy ra với vận tốc nhanh gấp 108 -1011 lần so
với phản ứng không có chất xúc tác.
Tất cả các enzyme đều có nguồn gốc tự nhiên, không độc điều này có ý
nghĩa quan trọng trong công nghiệp thực phẩm và y học
1.3.3. Cấu tạo hoá học của enzyme[5],[26]
1.3.3.1. Bản chất protein của enzyme
Bản chất hoá học của enzyme là protein. Enzyme được cấu tạo từ các L- α-
axitamin kết hợp với nhau qua liên kết peptit. Enzyme chia ra làm hai dạng
cấu tạo:
- Enzyme một cấu tử (là một protein đơn giản) như pepsin, amylase
- Enzyme hai cấu tử (là một protein phức tạp, trong phân tử còn có nhóm
không phải protein)
Trong phân tử enzyme hai cấu tử có hai phần:
 Apoenzyme: phần protein (làm tăng hoạt tính xúc tác của coenzyme,

hoá gọi là zimogen hoặc proenzyme.
Theo Emil- Fischer (1890) thì trung tâm hoạt động của enzyme vốn có
cấu trúc không gian tương ứng với cấu trúc của phân tử cơ chất, cũng giống
như tương ứng giữa ổ khó và chìa khó.
Lê Thị Khánh Loan 06-04 K13 Khoa
CNSH
9
Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội
Tuy nhiên đã có nhiều dẫn liệu thực nghiệm chứng minh cấu trúc không
gian của enzyme cũng như protein không cứng mà mềm dẻo, linh động. Theo
quan niệm hiện nay, khi enzyme tương tác với cơ chất các nhóm chức ở phần
trung tâm hoạt động của phân tử enzyme thay đổi vị trí không gian tạo thành
hình thể khớp với hình thể của cơ chất, vì vậy gọi là sự “khớp cảm ứng”.Giữa
cơ chất và trung tâm hoạt động tạo thành nhiều tương tác yếu, do đó có thể dễ
dàng bị cắt đứt trong quá trình phản ứng để giải phóng enzyme và các sản
phẩm phản ứng.
1.3.4. Cơ chế hoạt động[5]
Enzyme tác dụng trong điều kiện ”êm dịu” nhiệt độ tối ưu 30- 50
o
C, pH
trung tính và áp suất thường. Điều này quan trọng trong công nghiệp thực
phẩm.
Các cơ chất kết hợp với trung tâm hoạt động tạo phức hợp enzyme - cơ
chất (ES) E + S → ES → E + P
S: cơ chất
P: sản phẩm
 Yêu cầu: E và S phải bổ sung về mặt không gian và hợp nhau về mặt
hóa học, có khả năng hình thành nhiều liên kết yếu với nhau. Chúng
liên kết sao cho có thể tạo ra và cắt đứt sự dính nhau được gây nên do
biến động nhiệt ngẫu nhiên ở nhiệt độ thường.

Lê Thị Khánh Loan 06-04 K13 Khoa
CNSH
11
Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội
Hình 1.3.2: Ảnh hưởng của pH tới tốc độ phản ứng có enzyme xúc tác
1.3.5.3. Nồng độ cơ chất[5]
Với một lượng enzyme xác định, nếu tăng dần lượng cơ chất trong
dung dịch thì thoạt đầu hoạt tính của enzyme tăng dần nhưng đến một lúc nào
đó thì sự gia tăng về nồng độ cơ chất cũng không làm tăng hoạt tính của
enzyme. Đó là vì tất cả các trung tâm hoạt động của enzyme đã được bão hồ
bởi cơ chất.
1.3.5.4. Nồng độ enzyme[30]
Với một lượng cơ chất xác định, nồng độ enzyme càng cao thì tốc độ
phản ứng xảy ra càng nhanh. Tế bào có thể điều hồ tốc độ chuyển hoá vật chất
bằng việc tăng giảm nồng độ enzyme trong tế bào.
1.3.5.5. Chất ức chế enzyme[30]
Một số chất hoá học có thể ức chế hoạt động của enzyme nhưng khơng
bị chuyển hoá bởi enzyme. Các chất này cú thể là những ion, các phân tử vĩ
cơ, hữu cơ, kể cả các protein. khi cần ức chế enzyme nào đó cũng có thể tạo
ra các chất ức chế đặc hiệu cho enzyme ấy. Một số chất độc hại từ môi trường
như thuốc trừ sâu DDT là những chất ức chế một số enzyme quan trọng của
hệ thần kinh người và động vật.
Lê Thị Khánh Loan 06-04 K13 Khoa
CNSH
12
Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội
1.3.5.6. Chất hoạt hoá[5], [30]
Chất hoạt hoá: Là những chất làm cho enzyme từ trạng thái không hoạt
động thành trạng thái hoạt động, từ trạng thía hoạt động yếu sang trạng thái
hoạt động mạnh.

Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội
chiết, giải phóng vitamin B
1
dạng tự do[24]. Với các lớ do trờn và vỡ lớ do
kinh tế, enzyme thường được chọn hơn cả là enzyme loại diastase nỉ cú sự
hoạt động phosphatase. Giờ đõy tất cả các enzyme diastase cú sự hoạt động
của protease, phosphatase[27].
1.3.6.1. α-Amylasae
Amylase là enzyme đầu tiên được phát hiện và cô lập bởi Anselme Paye
ào năm 183à enzyme l ại ia tas [4

Các enzyme mylase thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết
nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước
: RR’ + H-OH → R’OH + R

Trong hệ enzyme amylase có enzyme α-amylase (EC 3.2.1.1 . Enzyme α –
amylase được h ạt ỉa i C+ à C
-
[5

Sự tác động của α amylase lên tinh bột: α amylase tác động lên mạch
amyloza và amylopectin của tinh bột và bẻ gãy các mối liên kết α- 1,4- gl o
id. Sau một thời gian ngắn , toàn bộ mạch amyloza và mạch chính của
amylopectin bị cắt nhỏ thành từng mảnh có năm hoặc sáu gốc glucozid. Gia
đo ạn tiếp theo α- amylase phân cắt cục bộ các mảng dextrin để tạo thành sản
phẩm cuối cùng là glucoza, maltoza và dextrin thấp phân tửhơn[
 .
α- amylase của sinh vật có những đặc tính rất đặc trưng về cơ chế tác động,
chuyển hóa tinh bột, khả năng chịu nhiệt α- amylae t hể hiện họat tính trong
vùng aciế u[

mặt bản chất clara-diastase có đầy đủ các loại enzyme thủy phân đường,
protein, cắt gốc phosphat và sulfat.
1.4. Các phương pháp xác định thiamin
Nghiên cứu xác định hàm lượng vitamin B
1
là một lĩnh vực rất quan
trọng và được ứng dụng rộng rãi trong y học, dược, công nghệ thực phẩm
Lê Thị Khánh Loan 06-04 K13 Khoa
CNSH
15
Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội
Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công trình khoa học và các nghiên cứu về
phương pháp xác định hàm lượng vitamin B
1
. Dưới đây là một số phương
pháp đã được ứng dụng rộng rãi
1.4.1. Định lượng thiamin bằng phương pháp khối lượng
D.Adamson và J.Handisyde định lượng thiamin trong các chế phẩm
dược bằng phương pháp khối lượng dựa theo phản ứng kết tủa của vitamin B
1
với thuốc thử acid silicovonframic. Phương pháp được tiến hành: Cho dung
dịch acid silicowonframic vào thiamin có nồng độ khoảng 0.05mg khi đun sôi
trong môi trường acid clohydric để tạo kết tủa, sau đó rửa kết tủa bằng acid
clohydric 1,4% nóng qua phễu thuỷ tinh G4, sấy khô kết tủa đến khối lượng
không đổi ở nhiệt độ 100-150
0
c. Khối lượng kết tủa được nhân với hệ số 0,19
sẽ cho hàm lượng của thiamin khan nước trong mẫu phân tích, với sai số 7,5-
15%.
Khi định lượng thuốc viên, trước tiên phải tiến hành hồ tan thuốc viên đã

Gran’s plot. Phương pháp cho phộp phân tích hàm vitamin B
1
trong khoảng 3-
50mg cho độ lặp lại 99% và độ lệch chuẩn ?0,7%. Phương pháp cho kết quả
với độ lặp lại cao nhưng không được dựng để định lượng thiamin trong các
chế phẩm dược đa thành phần và trong nguyên liệu tự nhiên. Vỡ trong các chế
phẩm dược đa thành phần và trong nguyên liệu tự nhiên có nhiều yếu tố gây
ảnh hưởng đến thế của điện cực [20].
1.4.4. Phương pháp sắc ký điện di mao quản thế cao
Điện di mao quản thế cao (HVCE) là một phương pháp phân tích hiện
đại, được phát triển trân cơ sở của điện di cổ điển, đã được ứng dụng trong
khoảng chục năm gần đây. Phương pháp này ngày càng được áp dụng rộng
rói trong nhiều lĩnh vực đặc biệt trong dược, y và sinh học.
Phương pháp sắc ký điện di mao quản thế cao khác với phương pháp sắc
ký lỏng hiệu suất cao (HPLC) về cơ chế của sự tách, đó là sự di chuyển khác
nhau của các phân tử chất tan (ion) dưới tác dụng của lực điện trường E của
nguồn cao thế được đặt vào hai đầu của cột tách (ống mao quản) trong môi
trường của dung dịch điện ly và chất đệm có pH thích hợp.
Phương pháp này đã được sử dụng để phân tích bẩy vitamin tan trong
nước thiamin, nicotinamide, nicotic acid, pyridoxin, ascorbic acid, folic acid,
riboflavin và đã được áp dụng thành công trong dược phẩm. Hỗn hợp có chứa
các viatamin này được tách khỏi nhau trong thời gian 7 phút bằng sắc ký điện
Lê Thị Khánh Loan 06-04 K13 Khoa
CNSH
17
Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội
di mao quản thế cao trong môi trường dung dịch điện di natri dodecyl sunfat
(SDS) sau đó được phát hiện bằng detector UV-VIS và detector diode-aray.
Phương pháp cho giới hạn phát hiện 0,08-1mg đối với acid forlic và 0,025-
1mg nicotinamide và thiamin, với độ lệch chuẩn <6% đối với tất cả các

OH
CH
3
N
S
CH
2
N
N
Kaliferixyanua
Thiamin
Thiocrom
NH
2
HO
N
N
CH
2
CH
3
CH
2
CH
2
OH
N
S
N
H

Trích đoạn Phương pháp phân tích vitamin B1

---