BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN THỊ THANH THÙY

NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở CÁ MÚ CHẤM
CAM (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) NUÔI TẠI
KHÁNH HÒA ĐỐI VỚI VI KHUẨN
Vibrio parahaemolyticus

Chuyên ngành : Nuôi trồng Thủy sản
Mã ngành : 62 62 03 01
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP


Thư viện Quốc gia
Thư viện Trường Đại học Nha Trang
1
MỞ ĐẦU
1. Sự cần thiết của luận án
Cá mú chấm cam Epinephelus coioides có giá trị dinh dưỡng
cao, lớn nhanh nên được nuôi phổ biến ở nhiều nước. Trong những
năm gần đây, nghề nuôi cá mú đang chịu thiệt hại do dịch bệnh,
thường gặp nhất là bệnh lở loét do vi khuẩn Vibrio gây ra.
Cho đến nay, việc phòng trị bệnh Vibriosis cho cá mú chủ yếu
bằng kháng sinh và hóa chất vẫn chưa đem lại hiệu quả ổn định.
Thiệt hại do bệnh vẫn luôn là mối đe dọa cho nghề nuôi cá mú. Vì
vậy, nghiên cứu cơ bản về miễn dịch học của cá mú đối với tác nhân
gây bệnh góp phần cung cấp thêm những thông tin về cơ chế kháng
bệnh ở cá, đặc điểm tác nhân gây bệnh, làm tiền đề cho nghiên cứu
ứng dụng vaccine phòng bệnh cho cá là hướng tiếp cận mới, phù hợp
với định hướng phát triển nghề nuôi cá biển công nghiệp, bền vững,
thân thiện môi trường.
2. Mục tiêu và nội dung của luận án
2.1. Mục tiêu của luận án
Làm rõ đặc điểm đáp ứng miễn dịch của cá mú chấm cam đối với
vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus.
2.2. Nội dung nghiên cứu
 Nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩn V. parahaemolyticus gây
bệnh lở loét ở cá mú chấm cam.
 Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch tự nhiên của cá mú chấm cam
và ảnh hưởng của chất kích thích miễn dịch β-glucan đến đáp ứng
này.
 Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá mú chấm cam
đối với vi khuẩn V. parahaemolyticus bất hoạt bằng formalin.

3
1.1.3. Một số bệnh thƣờng gặp ở cá mú nuôi
Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam đã phát
hiện các bệnh do vi rút, vi khuẩn, ký sinh trùng trên cá mú nuôi.
Trong đó, bệnh do vi khuẩn Vibrio là phổ biến nhất, lây lan nhanh và
gây thiệt hại lớn (Sarjito et al., 2009); Sun et al., 2011; Yambot và
Song, 2006; Đỗ Thị Hòa và cs, 2008 ).
1.2. Vi khuẩn Vibrio và bệnh Vibriosis trên cá biển
1.2.1 Vi khuẩn Vibrio
Luận án đã tổng quan các kết quả nghiên cứu trong và ngoài
nước về các đặc điểm hình thái cấu tạo, sinh lý, sinh thái, sinh hóa và
độc tính của vi khuẩn Vibrio.
1.2.2 Bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển
Nhiều loài cá phân bố ở các vùng biển khác nhau đều nhiễm
bệnh do vi khuẩn Vibrio. Dấu hiệu chính của bệnh do Vibrio là xuất
hiện các đốm đỏ, xuất huyết hoặc các vết loét trên thân. Bệnh này
gây chết cá rải rác đến hàng loạt nếu nhiễm nặng. Tác nhân thường
gặp là vi khuẩn V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. alginolyticus,
V. cachariae. Cách phòng trị bệnh chủ yếu bằng hóa chất và kháng
sinh nhưng chưa có kết quả ổn định.
1.3. Đặc điểm hệ miễn dịch ở cá xƣơng
1.3.1. Miễn dịch tự nhiên
Nhiều nghiên cứu về các khía cạnh khác nhau của hệ miễn
dịch không đặc hiệu ở cá xương đã được tổng quan bởi các tác giả
Ellis (2001), Rombout et al. (2005), Magnadottir (2006),Whyte
(2007), Chistiakov et al. (2007), Van Muiswinkel (2008).
1.3.2. Miễn dịch đặc hiệu
Cho đến nay, các nghiên cứu tương đối đầy đủ các khía cạnh liên
quan đáp ứng miễn dịch (ĐƯMD) đặc hiệu ở cá chỉ mới tập trung trên
4

2.1. Đối tƣợng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1. Đối tƣợng: Cá mú chấm cam Epinephelus coioides
2.1.2.Vật liệu:
i) Cá mú chấm cam: cá mú bệnh dùng để phân lập vi khuẩn
được thu tại Khánh Hòa. Cá mú chấm cam khỏe được thu mua từ trại
sản xuất giống nhân tạo tại Khánh Hòa. Cá được nuôi thuần dưỡng
trước khi tiến hành các thí nghiệm.
ii) Vi khuẩn V. parahaemolyticus: Chủng V3 được phân lập từ cá
mú bệnh lở loét thu tại Khánh Hòa; chủng V1 được cung cấp bởi Trung
tâm Quan trắc cảnh báo môi trường và Phòng ngừa dịch bệnh khu vực
miền Bắc; chủng V2 được cung cấp bởi Trung tâm Quan trắc cảnh báo
môi trường và Phòng ngừa dịch bệnh khu vực Nam Bộ; chủng A là V.
parahaemolyticus 17802 được mua từ ngân hàng chủng ATCC.
iii) Chất kích thích miễn dịch: β-glucan (Macrogard-Biorigin,
Na Uy).
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu: Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III
và Phòng Nghiên cứu miễn dịch cá- Bộ môn Sinh học- Khoa toán và
Khoa học tự nhiên- Trường Đại học Bergen, Na Uy.
2.1.4. Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 1/2008 đến 11/2012.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩn V. parahaemolyticus
 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa
Phân lập vi khuẩn và nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh
lý, sinh hóa dựa theo phương pháp của Whitman (2004). Định danh
vi khuẩn theo khóa phân loại của Bergey và phân tích trình tự gen
16S rDNA theo Harris và Hartley (2003).
6
 Phân tích thành phần protein của các chủng vi khuẩn
Thành phần protein của các chủng vi khuẩn được xác định
bằng kỹ thuật SDS-PAGE theo Tsang et al. (1983).

 Xác định công thức bạch cầu trong máu: Làm tiêu bản và
đếm các loại tế bào máu theo phương pháp của Selvaraj et al. (2006).
Phân loại các loại bạch cầu theo Ainsworth (1992).
7
 Phân lập, nuôi cấy, khảo sát các thông số miễn dịch không
đặc hiệu của bạch cầu tiền thận: Phân lập bạch cầu từ thận bằng cách
ly tâm trên phân lớp gradient percoll theo Yeh et al. (2008); Khảo sát
hoạt tính thực bào dựa trên khả năng bắt nuốt các hạt nhuộm huỳnh
quang của bạch cầu theo Yeh et al. (2008); Khảo sát hoạt tính bùng
nổ hô hấp của bạch cầu theo Cheng et al. (2007).
 Khảo sát khả năng kháng bệnh của cá mú chấm cam sau khi
ăn β-glucan: Tiêm cảm nhiễm V. parahaemolyticus với liều 1,07 x
10
5
cfu/g cá ở 2 thời điểm: ngày thứ nhất và ngày thứ 15 sau khi
ngừng ăn thức ăn có bổ sung β-glucan. Tại mỗi thời điểm, 24 cá
thể/nghiệm thức được tiêm cảm nhiễm. Theo dõi ghi nhận tỷ lệ cá
chết ở mỗi nghiệm thức.
2.2.3. Nghiên cứu đặc điểm phân tử kháng thể của cá mú chấm
cam
 Thu huyết thanh cá mú thực hiện theo phương pháp của Aakre
et al. (1994). Tinh sạch kháng thể IgM từ huyết thanh trên hệ thống
sắc ký FPLC (Pharmacia, Uppsala, Sweden) theo Havarstein et al.
(1988). Phân tích IgM bằng kỹ thuật SDS-PAGE theo Tsang et al.
(1983).
 Tạo huyết thanh thỏ kháng IgM của cá mú chấm cam: Gây
miễn dịch cho thỏ qua 3 lần tiêm dưới da 0,2 mg IgM cá mú và chất
bổ trợ (FCA/FIA) với tỷ lệ 1:1 (v/v), mỗi lần tiêm
cách nhau 4 tuần. Thu huyết thanh sau mũi tiêm cuối cùng 2 tuần, lưu
giữ huyết thanh ở -70

thể/nghiệm thức được thu huyết thanh để phân tích tính đặc hiệu của
kháng thể bằng kỹ thuật Western Blot và xác định hàm lượng kháng
thể bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp.
Đồng thời, tại thời điểm 30 ngày và 60 ngày sau khi gây miễn
dịch, 20 con/nghiệm thức/thời điểm được tiêm cảm nhiễm vi khuẩn
V. parahaemolyticus lần lượt với liều 2,5 x 10
5
cfu/g và 2,0 x 10
5

cfu/g. Theo dõi ghi nhận tỷ lệ cá chết ở mỗi nghiệm thức. Tính toán
9
hệ số bảo hộ (RPS) của kháng nguyên vi khuẩn đối với cá mú theo
công thức của Ellis (1988).
Thí nghiệm được lặp lại 2 lần trong cùng thời điểm.
2.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu:
Số liệu thu thập được xử lý thống kê trên phần mềm SPSS
version 15.0. Các giá trị trung bình của các đại lượng được so sánh
theo phương pháp phân tích phương sai một yếu tố (one-way
ANOVA) và Chi- test. So sánh sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa
nhiều giá trị trung bình của các biến bằng phân tích Post Hoc test
theo phép kiểm định Tukey HSD ở độ tin cậy 95 %.

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đặc điểm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh lở loét
ở cá mú chấm cam
3.1.1. Bệnh xuất huyết lở loét ở cá mú chấm cam nuôi tại Khánh
Hòa
Trên 24 mẫu cá mú bệnh thu được tại Khánh Hòa trong thời
gian từ tháng 3-7/2008, tần suất bắt gặp các dấu hiệu bệnh lý chính

Thành phần protein của 4 chủng V. parahaemolyticus tương tự
nhau. Trong phổ protein của các chủng vi khuẩn này có các protein
khối lượng phân tử 66, 47, 31, 28 và 21 kDa tương đồng với các
protein mang độc tố và có tính kháng nguyên cao đã được nhiều tác
giả công bố (Hình 3.5). Phát hiện này có ý nghĩa quan trọng trong
việc chọn lựa các chủng vi khuẩn tiềm năng ứng dụng cho nghiên
cứu sản xuất vaccine phòng bệnh cho cá biển.
11
3.1.3.Khả năng gây bệnh và độc lực của V. parahaemolyticus trên
cá mú chấm cam
Sau 10 ngày cảm nhiễm, kết quả thí nghiệm cho thấy chủng
V3 có độc lực cao nhất so với các chủng V1, V2 và A với giá trị LD
50

là 1,78 x 10

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240
Thời gian (giờ)
Tỷ lệ chết tích lũy (%)
ĐC 10^2cfu/g 10^3 cfu/g
10^4 cfu/g 10^5 cfu/g
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240
Thời gian ( giờ)
Tỷ lệ chết tích lũy (%)
ĐC 10^2 cfu/g 10^3 cfu/g
10^4 cfu/g 10^5 cfu/g
0
10
20
30
40
50
60
70
80

50
= 2.14 x 10
4
cfu/g
d. LD
50
= 1,48 x 10
4
cfu/g
c. LD
50
= 1,78 x 10
3
cfu/g
Hình 3.5: Thành phần protein của các chủng vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus
Hình 3.6: Tỷ lệ chết tích lũy của cá mú chấm cam cảm nhiễm Vibrio
parahaemolyticus (a: Chủng V1; b: Chủng V2; c: Chủng V3; d: Chủng A)

12
3.2. Ảnh hưởng của β-glucan đến các thông số miễn dịch không
đặc hiệu và khả năng kháng bệnh do V. parahaemolyticus gây ra
ở cá mú chấm cam
3.2.1. Thành phần, đặc điểm hình thái và kích thƣớc các loại tế
bào máu cá mú chấm cam
Cá mú chấm cam có đầy đủ các loại tế bào máu tương tự như
nhiều loài cá xương khác. Thành phần, kích thước và hình ảnh của các
loại tế bào máu cá mú chấm cam thể hiện qua Bảng 3.2 và Hình 3.8.
Bảng 3.2: Kích thƣớc của các loại tế bào máu ở cá mú chấm cam
(n = 15, giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn)

3,9 ± 1,0
BC đơn nhân
9,9 ± 1,5
8,8 ± 1,3
7,1 ± 0,9
4,5 ± 0,9
Lympho bào
6,0 ± 0,9
5,1 ± 0,5 Tiểu cầu
7,6 ± 1,1
3,9 ± 0,9 Chú thích: BC- Bạch cầu
13

6,0 ± 0,5
c
BC trung tính
21,5±2,8
a
23,6± 4,4
ab
27,9 ± 1,9
b
27,1 ± 3,3
b
BC đơn nhân
18,7± 8,0
a
26,4 ± 3,7
ab
26,5 ± 5,4
ab
27,6 ± 2,5
b
BC ưa a xít
4,9 ± 2,4
a
5,2 ± 1,3
a
4,9 ± 1,4
a
4,1 ± 0,7
a
BC ưa kiềm

Thời gian
Nghiệm
thức
Tỷ lệ tế bào
BC tham gia
thực bào (%)
Cƣờng độ thực bào của tế bào bạch
cầu mô thận ( %, n = 6, TB ± SD )
1 hạt
2 hạt
> 3 hạt
Ngày thứ 1
sau khi
ngừng cho ăn
β-glucan
ĐC
13,3 ± 2,3
a
6,3 ± 1,6
a
4,4 ± 0,3
a
2,6 ± 0,5
a
G500
6,0 ± 2,1
ab
7,3 ± 0,5
ab
5,0 ± 0,9

a
4,9 ± 0,6
a
2,4 ± 0,3
b
G500
13,8 ± 0,8
a

7,4 ± 0,8
a
4,5 ± 0,9
a
2,0 ± 0,2
a
G1000
13,3 ± 0,4
a

7,1 ± 0,4
a
4,0 ± 0,6
a
2,2 ± 0,2
ab
G2000
13,5 ± 1,1
a
7,2 ± 0,8
a

khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra ở cá mú chấm cam
Cá mú chấm cam sau khi ăn thức ăn có β-glucan trong 2 tuần
và cảm nhiễm với vi khuẩn độc, kết quả cho thấy tỷ lệ chết tích lũy
(%) của các nhóm cá được ăn β-glucan thấp hơn có ý nghĩa thống kê
so với nhóm đối chứng. Tuy nhiên, tỷ lệ này không khác biệt sau khi
ngừng cho ăn 15 ngày (Hình 3.12).

a
b
b
a
a
a
a
a
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
Hoạt tính RB (OD 630 nm)
ĐC G2000 G1000 G500
A B
16


H
L
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Ngày
Tỷ lệ chết tích lũy ( %)
G-500 ppm G-1000 ppm G-2000 ppm ĐC
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
NgàyHình 3.14: Biến động hiệu giá kháng thể ở cá mú chấm cam sau khi
gây miễn dịch bằng 4 chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bất
hoạt bằng formalin đƣợc xác định bằng kỹ thuật ELISA đo ở bƣớc
sóng 490 nm (Ký tự trên mỗi cột trong cùng thời điểm chỉ sự khác
nhau có ý nghĩa (P< 0,05) với kiểm định Tukey, n=10)

30 45 60
Thời gian sau khi gây miễn dịch (Ngày)
c
b
b
d
a
c
b
b
d
a
a
a
a
a
a
0,00
0,05
0,10

Hình 3.15: Biểu hiện liên kết giữa kháng thể của cá mú chấm cam
với protein của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus V3 bằng kỹ thuật
Western Blot (Cột 1: Marker; Cột 2,3 và 4: Kháng nguyên có bổ sung
FIA sau 30, 45 và 60 ngày; Cột 5,6 và 7: Kháng nguyên không bổ sung
FIA sau 30, 45 và 60 ngày; Cột 8: nhóm đối chứng được tiêm PBS)
19
3.3.3.2. Hàm lƣợng kháng thể của cá mú chấm cam sau khi gây
miễn dịch bằng V. parahaemolyticus V3 bất hoạt bằng formalin ở
các thời điểm khác nhau
Hàm lượng kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh cá được gây
miễn dịch bằng chủng V3 kết hợp FIA cao nhất và khác biệt có ý
nghĩa thống kê tại các thời điểm 30, 45 và 60 ngày sau khi gây miễn
dịch (Hình 3.16).

Hình 3.16: Biến động hiệu giá kháng thể ở cá mú chấm cam sau
khi gây miễn dịch bằng V. parahaemolyticus V3 đã bất hoạt bằng
formalin đƣợc xác định bằng kỹ thuật ELISA đo ở bƣớc sóng 490
nm (V3+ FIA: Cá được gây miễn dịch bằng chủng V3 có chất bổ trợ
FIA; V3: Cá được gây miễn dịch bằng chủng V3; PBS-C: Cá đối chứng
tiêm dung dịch PBS và C: Cá đối chứng không tiêm; Ký tự trên mỗi cột
trong cùng thời điểm chỉ sự khác nhau có ý nghĩa (P< 0,05) với kiểm

được gây miễn dịch cao hơn so với nhóm đối chứng (Hình 3.17). Hệ
số bảo hộ (RPS) cao nhất ở nhóm cá gây miễn dịch bằng vi khuẩn có
bổ sung FIA là 87,5%, trong khi ở nhóm không bổ sung FIA chỉ đạt
50%.

Hình 3.17: Tỷ lệ chết tích lũy ở cá mú chấm cam gây nhiễm thực
nghiệm ở thời điểm 30 ngày sau khi gây miễn dịch (V3+FIA:
kháng nguyên bổ sung FIA; V3: kháng nguyên không có FIA; PBS-
C: đối chứng tiêm PBS; C: đối chứng không tiêm)
0
10
20
30
40
50
60
70
80

10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Ngày
Tỷ lệ chết tích lũy (%)
V3+FIA V3 PBS-C C
22
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN
Kết luận
1. Chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus V3 có đặc điểm hình
thái, sinh lý, sinh hóa tương tự với chủng chuẩn ATCC 17802 và gây
bệnh xuất huyết lở loét cho cá mú chấm cam E. coioides trong điều
kiện thí nghiệm với các biểu hiện bệnh tương tự như trong tự nhiên,
với liều gây chết 50 % (LD
50
) là 1,78 x 10
3
cfu/g.
2. Thành phần protein của vi khuẩn V. parahaemolyticus V3
gồm các protein có khối lượng phân tử trong khoảng từ 97,4 đến thấp
hơn 14,4 kDa. Trong đó, các protein có khối lượng 66, 47, 31, 28, 21
kDa có tính sinh miễn dịch cao, có ý nghĩa ứng dụng trong sản xuất

thời điểm 30 ngày sau khi gây miễn dịch với giá trị RPS là 87,5 %.
Tuy nhiên, hiệu quả bảo vệ này suy giảm sau 60 ngày gây miễn dịch.
7. Đơn vị cấu trúc phân tử kháng thể IgM của cá mú chấm
cam E. coioides gồm một chuỗi nặng 78 kDa và một chuỗi nhẹ 25
kDa, ngoài ra, còn có một polypeptide có khối lượng 23 kDa hiện
chưa rõ vai trò của nó trong cấu trúc phân tử này.
Đề xuất ý kiến
1. β-glucan bổ sung vào thức ăn có tác dụng kích thích đáp ứng
miễn dịch không đặc hiệu ở cá mú E. coioides sau khi ăn liên tục
trong 2 tuần. Tuy nhiên, hiệu quả này giảm mạnh sau 15 ngày ngừng
cho ăn. Vì vậy, cần tiếp tục nghiên cứu xác định thời gian cho ăn bổ
sung β-glucan thích hợp cũng như thời gian duy trì tác dụng của nó
trên cá sẽ góp phần tạo cơ sở khoa học cho việc đưa ra khuyến cáo về
việc sử dụng β-glucan hiệu quả và ít tốn kém nhất cho người nuôi.