Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Phƣơng Thị Hà
XÁC ĐỊNH KIỂU GEN VIRUS VIÊM GAN C TRONG
HUYẾT THANH BỆNH NHÂN VIÊM GAN C BẰNG KỸ
THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ RT - PCR Chuyên ngành : Vi sinh vật học
Mã số : 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
Ts.Bs Nguyễn Văn Tiến

kỹ thuật để xác định kiểu gen HCV. Trên thế giới có nhiều công ty: Bayer,
Beckman Coulter, QIAgen, Roche… đã cho ra đời các bộ kit xác định genotypes
HCV với độ chính xác cao. Tuy nhiên, giá thành của những bộ kit này còn cao nên
chưa được áp dụng rộng rãi. Ở Việt Nam phổ biến hai kỹ thuật xác định genotypes
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 3

HCV: Real-time PCR (RT-PCR) và kỹ thuật giải trình tự gen (sequencing). Kỹ
thuật Sequencing trong chuẩn đoán có nhiều tính ưu việt trong việc xác định kiểu
gen là sự chính xác cao, tránh được những nhầm lẫn trên cùng một type hoặc
subtype nhưng phương pháp này cần có các máy móc trang thiết bị hiện đại và điều
kiện kỹ thuật cao nên gía thành cao chủ yếu được thực hiện tại các trung tâm nghiên
cứu. Kỹ thuật RT-PCR được tiến hành ở tất cả các phòng thí nghiệm PCR do dễ
thực hiện không đòi hỏi máy móc trang thiết bị và kỹ thuật cao, giá thành rẻ phù
hợp với điều kiện kinh tế của đa số người dân ở Việt Nam,tuy nhiên không xác định
được đến subtype và có sự nhầm lẫn giữa type1 và type6. Với mục đích khuyến cáo
bệnh nhân lựa chọn đúng phương pháp xác định genotype, vì vậy tôi chọn đề tài:
“Xác định kiểu gen virus viêm gan C trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan C
bằng kỹ thuật sinh học phân tử RT-PCR”, với những mục tiêu như sau :
1) Xác định tỉ lệ người mang kiểu gen HCV bằng phương pháp RT-PCR sử
dụng Taqman probe.
2) Xác định lại kiểu gen Type 1 bằng phương pháp giải trình tự gen (Sequencing)
trên đoạn gen NS5B.
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 4


1.1.3. Genome HCV
Genome của HCV có một lõi chứa vật liệu di truyền là một sợi ARN có tính
phân cực dương, bao quanh bởi một màng protein có chức năng bảo vệ tạo hình đa
diện đều và gói lại bởi màng lipid từ nguồn của tế bào gan, kích thước của một
chuỗi đơn ARN (+) là 9,6 kb. Giống như các chuỗi ARN dương của các loại virut
khác, tổ chức genome của virut viêm gan C cũng mang vai trò như một ARN thông
tin (mARN) truyền đạt thông tin di truyền cho protein của virut [17,40,47].
Tổ chức Genome của HCV được chia làm hai vùng
Vùng cấu trúc mã hóa cho các protein cấu trúc gồm:
- Gen C mã hóa cho protein nuclecapsit p22 làm nhiệm vụ gắn với ARN để
tạo nuclecapsit.
- Gen E1 mã hóa cho glycoprotein vỏ ngoài p33.
- Gen E2 mã hóa cho protein vỏ ngoài gp 70.
Vùng không cấu trúc mã hóa cho các protein không cấu trúc bao gồm:
Màng vỏ
ARN virus
Màng vỏ
glycoprotein
Core
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 6

- Gen NS2 mã hóa cho protein gắn vào màng (p23).
- Gen NS3 mã hóa cho proteaza và helicaza (p72).
- Gen NS4 được chia thành NS4A mã hóa cho protein p10 và NS4B mã hóa
cho protein p27.
- Gen NS5 được chia thành NS5a mã hóa cho replicaza và NS5b mã hóa cho
ARN-Polymeraza phụ thuộc ARN cần cho quá trình sao chép.

và vùng 3’ (NCRs- Noncoding regions) bao gồm các chuỗi nucleotit có liên quan
đến sự điều chỉnh quá trình sao chép của virut. Tất cả các NCR đều có chứa các
vùng miền bảo tồn cao so với các vùng protein mã hóa của genome HCV.
Mức độ chuyển hóa cao của các NCRs làm cho chúng thành mục tiêu nghiên cứu:
+ Nâng cao chất lượng việc chẩn đoán phân tử.
+ Nghiên cứu cho việc điều trị kháng virut.
+ Nghiên cứu kháng sinh chống HCV.
Phần 5’ NCR có khoảng 341 nucleotit và nó có một cấu trúc phức thứ hai với
bốn vùng khác nhau (I-IV) [30], 125 nucleotit đầu tiên của 5’ NCR được phân ba
đều ra các vùng I và II là phần cơ bản của quá trình sao chép ARN trong virut
[ 21,52]. Các vùng (II-IV) thiết lập một tâm đầu vào của ribosome bên trong (IRES)
bao gồm ribosome liên kết và độc lập khởi động cho quá trình sao chép tương
ứng[7,52].
Chuỗi 3’ NCR có chứa ba vùng chức năng khác nhau: một vùng có thể thay
đổi, một chuỗi U/UC có chiều dài thay đổi và đuôi X đã chuyển đổi ở mức độ cao
tại đuôi 3’ của hệ gen HCV, vùng thay đổi có chứa khoảng 40 nucleotit và không
quan trọng đối với quá trình sao chép ARN. Tuy nhiên nếu bỏ đi chuỗi này có thể
dẫn đến việc giảm sút đáng kể hiệu quả của quá trình sao chép[21]. Chiều dài của
chuỗi vùng U/UC thay đổi theo các chuỗi HCV khác nhau và nằm trong khoảng từ
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 8

30- 80 nucleotit [35]. Chiều dài nhỏ nhất trong vùng này đối với quá trình sao chép
ARN được cho là có chứa 26 nucleotit homouridine trong môi trường tế bào
[22,49]. Đuôi X với mức chuyển hóa cao có khoảng 98 nucleotit có chứa ba
stem-loops (SL1-SL3) [23] và quá trình tiêu hủy hoặc thay thế nucleotit trong các
vùng này thường không gây tử vong [23]. Một cách gọi tên khác của quá trình
tương tác giữa đuôi 3’ X và SL2 là “ kissing-loop” và một phần phức hợp của vùng

nucleocapsid của HCV. Protein core đã được báo cáo tương tác với nhiều loại
protein của tế bào tác động đến chức năng của nhiều protein của tế bào và chức
năng của tế bào túc chủ như gen dịch mã, chuyển hóa lipid, chết theo chương trình
và khá nhiều tín hiệu dẫn đường. Ngoài ra protein core mồi dẫn gan hóa mỡ và ung
thư gan ( UTG)[51,52].
E1 và E2: là protein type I xuyên màng và có đoạn cuối C ái nước làm neo.
Được chuyển vị đến ruột của ergoplasme và được glycosyl hóa tại đấy. Do kết nối
rất mạnh với N liên kết glycosyl hóa. E1,E2 tạo thành non-covalent heterodimer đã
cho là tạo thành vỏ của HCV. Quá trình đóng gói các phần tử của HCV và trồi ra
chưa được hiểu thấu đáo nên cần nghiên cứu có hệ thống vấn đề này[15,20,48].
F-Protein, ARFP: Tổng hợp protein này là do một khung đọc mở thay thế
trong nội tại gen core. Được đặt tên là khung protein đọc mở thay thế ( ARFP ) hay
là khung F ( F frame shift ) có 160 amino acid. ARFP hay F là cần thiết cho
ARN-HCV tăng sinh. Được thể hiện trong diễn biến tự nhiên như thế nào khi nhiễm
HCV cần làm sáng tỏ [7,46].
Protein P7: P7 là một polypeptide có 60 amino acid, nằm tại vị trí giao nhau
của gen cấu trúc và gen không cấu trúc. Chưa biết chắc chắn là P7 có được đóng gói
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 10

không với các phần tử khác của HCV, P7 gồm 2 vùng để tạo thành hexamer là kênh
cho các ion hoạt động, có thể cho rằng P7 có vai trò quan trọng trong đóng gói vì
một protein như vậy của virus gây tiêu chảy ở Bò ( BVDV- bonine diarrhea virus)
đã chứng minh là rất cần thiết để sản sinh virus-progeny nhưng không thể để cho
tăng sinh ARN virus [28].
Protein tự tiêu NS2-3 ( autoprotease): kết nối NS2/3 bị tách bởi autoprotease
để có NS2 và đoạn cuối N thứ ba của NS3. Mặc dù hoạt tính protease của NS2-3
cho genome HCV tăng sinh trong chu kỳ sinh trưởng nội bào cũng như trong in

khổng lồ về tương tác với các yếu tố khác của NS5A nên chức phận của NS5A lại
không rõ ràng. Khởi đầu thì rất hấp dẫn vì NS5A có tiềm năng điều hòa đáp ứng
interferon, tuy kết quả nghiên cứu còn trái ngược nhau. Một nhận xét nổi bật là trên
replicon thích ứng của nuôi cấy tế bào thấy độ tập trung đột biến cao trong phần
trung tâm của NS5A, hiện tượng trên chỉ ra rằng NS5A có tác động hiệu quả trên
điều hòa tăng sinh của HCV. Yếu tố liên kết màng của NS5A được làm trung gian
bởi một amphipathic alpha helix khu trú tại N-đoạn cuối, tuy ít thực nghiệm về
tiêu hủy protein mới đây nhưng cũng cho phép định nghĩa ba vùng protein tại
domain cytosolic. Gần đây nhất cấu trúc ba chiều của đoạn N- cuối domain 1 cũng
được giải quyết bằng chụp hình. Sau khi dimer hóa cấu trúc này tạo ra basic groove
đối diện với cytosol tại bề mặt màng tế bào. Cấu trúc kiểu claw like được cho rằng
đã cung cấp chỗ cho ARN gắn kết và vì vậy đã tham dự vào việc điều hòa đích của
genome ngay trong phức hợp sinh trưởng HCV [7,48,51].
NS5B: Chìa khóa của replicase khởi hoạt tổng hợp genome ARN mới là NS5B
ARN- phụ thuộc ARN polymerase (RdRp). NS5B là kích thước đo theo mấu của
protein neo màng (tail-anchored protein) có đặc trưng bởi domain xuyên màng tại
C- đoạn cuối của protein chịu trách nhiệm tác động hậu dịch mã màng. Cấu trúc của
NS5B là điển hình cấu tạo polymerase dáng hình bàn tay phải với dưới vùng ngón
tay, mu bàn tay, ngón tay cái bao bọc thành vòng tròn nơi có hoạt tính cao. Quá
trình tăng sinh thông qua tổng hợp một vòng ARN bổ sung mang dấu (-) sử dụng
genome như là một khuôn mẫu và hậu quả của tổng hợp được ARN (+) từ ARN(-)
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 12

trung gian. Tác động như là thành phần trung tâm của tăng sinh NS5B nổi lên như
là một đích chính để làm thuốc mới có hiệu quả.
1.1.5. Vòng đời của virut viêm gan C
Chưa biết đầy đủ vòng đời của HCV vì chưa có môi trường nuôi cấy HCV in

và 5’ vùng không mã hóa là vùng bảo tồn cao trong các chủng HCV được phân lập
và có chứa IRSE ( internal ribosome entry site). IRES gắn trực tiếp với riboxom
40S và được coi là yếu tố tiền khởi động cần thiết cho cap-dependent dịch mã. Cấu
trúc ba chiều HCV IRES gắn với 40S ribosomal subunit minh họa cơ sở phân tử để
dịch mã tạo ra polyprotein bằng bộ máy dịch mã của tế bào [7,46].
Bước 3: xâm nhập ergoplasme và polyprotein tự cắt đoạn để sinh 3 protein cấu
trúc C,E1,E2 và 7 protein không cấu trúc NS; đặc biệt tạo ra ARN (-) làm khuôn
mẫu để HCV sinh trưởng tạo lại ARN sợi (+), tại 1 thời điểm nào đó genome HCV
thay chức phận trở thành phức hợp sinh trưởng liên quan đến màng (membrane
associated replication complex)[7].
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 14

Bước 4: đóng gói và xuất ra ngoài.
Mọi việc của quá trình đều trong nguyên sinh chất không liên quan đến nhân tế
bào gan như HBV.
Như tất cả virus ARN (+) đã nghiên cứu từ trước đến nay HCV tạo ra một phức
hợp màng liên kết bao gồm protein virut,yếu tố tổn thương màng, và những thành tố
của tế bào túc chủ. Yếu tố tổn thương màng đặc hiệu được coi như là một web
màng, đã được xác định là nơi ARN tăng sinh trên tế bào Huh-7 chứa subgenomic
HCV replicon.

Hình 1.5 : Các đầu đồng tiếp nhận HCV[29]
Một khi đã vào trong tế bào gan và chỉ trong nguyên sinh chất tế bào gan chu kỳ
sinh trưởng của HCV mới khởi động dựa chủ yếu vào bộ máy của nội tế bào để
hoàn thành chu kỳ sinh trưởng. đặc hiệu nhất genome HCV dịch mã để tạo ra một
protein đơn độc có khoảng 3011 amino acid gọi là chất đa protein. Chất đa protein
tiếp theo quá trình tự phân hủy bởi protease của virus và tế bào gan để tạo ra 3

biến đổi của chuỗi trình tự mã hóa ở cả hai vị trí khung đọc và kích thước của
protein là không có sự bảo tồn cao với kiểu gen. Điều này trái ngược với tính chất
bảo tồn tiến hóa của rất nhiều bản sao HCV, đồng ý với ý kiến này cho rằng có khả
năng gen này là sản phẩm sinh ra từ sự nhân đôi của ARN có sự biến đổi codon thứ
ba của gen lõi[42,44].
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 16
Hình 1.6 : Sự phân bố của các kiểu gen [44].
Mỗi nhóm gen trong bộ 06 nhóm gen quan trọng nhất của HCV đều có chứa
một chuỗi các subtype có liên quan chặt chẽ với nhau. Trong đó, sự khác biệt của
mỗi subtype vào khoảng 20- 25% về chuỗi nucleotit, với genotype con số này là
>30%. Một số genotype như 1a,1b, và 3a có sự phân bố rộng hơn cả, điều này có
thể là kết quả của quá trình truyền máu và dùng chung kim tiêm giữa những người
sử dụng ma túy trong vòng 30-70 năm qua và bây giờ phần lớn là phân bố ở các
nước phương tây (Hình 1.6 ).(Đây là những kiểu gen được gặp phổ biến nhất trong
các thử nghiệm lâm sàng và thông tin mới nhất đã được thu thập trên các phản ứng
với interferon (INF) và các phương pháp điều trị virus khác). Trong đó 1a phân bố
toàn thế giới, 1b phân bố nhiều ở Châu Âu và Bắc Mỹ, type 2 phân bố địa trung hải
và Trung Đông, type 3 chủ yếu ở Châu Âu, type 4 phân bố ở trung đông, type 5 ở
Nam Phi, type 6 ở Hồng Kông và Việt Nam [42,44].
Kiểu gen 1a được phân bố rộng rãi ở
bắc Âu và Mỹ, các nước có nền công
nghiệp hóa.
Kiểu gen 1b thường thường phân
bố toàn thế giới

đáng kể trong vùng dịch tễ: tổ chức WHO xác định có 62 triệu người bị nhiễm
trong khu vực Tây Thái Bình Dương, chiếm 1/3 lây nhiễm các kiểu gen trên toàn
thế giới [42]. Kiểu gen 6 phân lập đã thu được từ các cư dân của Thái Lan, Ấn Độ,
Campuchia, Lào, Myanmar, Việt Nam, Trung Quốc, Hồng Kông và Indonesia
[42,44]. Sự lưu hành của HCV trong cộng đồng có sự thay đổi giữa các nước Đông
Á, từ khoảng 0,5% tại Singapore và Hồng Kông, khoảng 6% tại Việt Nam và Thái
Lan [42] và vượt quá 10% tại Myanma, tỷ lệ báo cáo tại Trung Quốc là khoảng 2-
3% xấp xỉ khoảng 30 triệu người [42]. Tất nhiên,không phải nhiễm HCV ở Đông Á
là do kiểu gen 6 và sự phân bố kiểu gen HCV có thể thay đổi giữa các nước trong
khu vực Đông Á.
Các genotype của HCV có sự khác nhau về độc lực, khẳ năng gây bệnh và khả
năng đáp ứng điều trị bằng interferon (genotype 1 đáp ứng thấp hơn các genotype
khác: 18,1% so với 54,9%)[2]
Hậu quả về tính đa dạng gen của HCV:
+Làm virut có khả năng né tránh đáp ứng miễn dịch của vật chủ dẫn đến tỉ lệ
nhiễm HCV mạn cao (>80%)
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 18

+ Sau khi khỏi bệnh, cơ thể không có miễn dịch bảo vệ và vẫn có nguy cơ bị tái
nhiễm
+ Việc nghiên cứu sản xuất vacin phòng bệnh rất khó khăn hiện chưa có vacin
(do thiếu hệ thống nuôi cấy tế bào thích hợp, do HCV đột biến gen tạo ra chủng
virut mới)
1.3. Bệnh học viêm gan virut C
1.3.1. Dịch tễ học
HCV lây truyền bằng sự tiếp xúc trực tiếp qua máu. Đường truyền bệnh bao
gồm việc dùng chung các vật dụng ma túy như kim chích, dây cầm máu, ống hút,

Khỏi (10-30%) Mang các dấu ấn của HCV mạn tính (70-90%)
Mang dấu ấn âm tính không triệu chứng 50% VGMT tối thiểu 50% Xơ gan 10% Ung thư gan 2%

Các triệu chứng thường gặp: Nhiều người không có hoặc có một ít triệu chứng
trong giai đoạn nhiễm HCV cấp tính. Phần lớn các người mang bệnh HCV kinh
niên cũng không có triệu chứng nào và vẫn sống gần như bình thường. Tuy nhiên,
những người khác có triệu chứng giống như bị cảm cúm nhẹ như buồn nôn, mệt
mỏi, sốt, nhức đầu, ăn không ngon, đau vùng bụng, và nhức bắp thịt hay ở khớp.
Một số người lại có những triệu chứng như bị cảm cúm nặng, cũng như vàng da và
mắt bị đục, nước tiểu đậm. Sau một thời gian (thường là nhiều năm hoặc vài chục
năm), người có bệnh HCV kinh niên có thể có những triệu chứng liên quan đến hư
gan. Viêm Gan C kinh niên có thể liên quan đến nhiều triệu chứng khác.
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 20

1.3.3. Các xét nghiệm chẩn đoán bệnh viêm gan virut C
1.3.3.1. Các xét nghiệm kháng thể HCV
+ ELISA II là một cuộc thử nghiệm máu đơn giản để phát hiện kháng thể HCV
+ RIBA là cuộc thử nghiệm kháng thể thứ nhì, có thể được dung sau cuộc thử

1.4. Các kỹ thuật xét nghiệm xác định kiểu gen HCV
Hiện nay kỹ thuật được ứng dụng trong xác định kiểu HCV ở Việt Nam là kỹ
thuật Real-time PCR và giải trình tự gen ( InoLIPA và Sequencing).
1.4.1. Kỹ thuật Real-time PCR
Real-time PCR là kỹ thuật PCR( Polymerase chain reaction-Phản ứng chuỗi
polymerase) mà kết quả khuếch đại DNA đích được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ
nhiệt của phản ứng, chính vì vậy nên được gọi là Real-time. Như vậy, có thể nói
Real-time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành hàng tỉ bản
sao dựa vào chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch đại trong ống phản ứng được hiển thị
cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra để người làm thí nghiệm có thể thấy được.

Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 22

1.4.1.1. Lịch sử phát hiện kỹ thuật PCR
Vào một buổi tối cuối tuần tháng 4 năm 1983, trong lúc đang lái xe trên đường
ở gần vùng đồi núi của California, một ý tưởng lóe lên trong đầu của Kary Mullis
khi ông phải lùi xe lại do chạy lố đường, hình ảnh hai làn bánh xe mới tách khỏi hai
làn bánh xe cũ:” Dùng nhiệt độ tách đôi sợi AND thành hai mạch đơn’’. Lúc đó
Kary Mullis chỉ là một nhà hóa sinh học bình thường, đang làm việc tại một phòng
thí nghiệm nhỏ.
Từ ý tưởng đó, Kary Mullis đã phát minh ra kỹ thuật PCR ( phản ứng chuỗi
polymerase) vào năm 1985, tạo nên cuộc cách mạng lớn trong đời sống khoa
học. Chỉ sau 8 năm (1993), K. Mullis đã được trao giải Nobel về hóa học nhờ
phát minh này.
1.4.1.2. Nguyên lý kỹ thuật PCR
Từ một đoạn ADN chọn lọc, nó sẽ được nhân lên gấp hàng triệu lần hoặc hơn
nữa trong một thời gian ngắn. Trong thời gian này, sự sao chép ADN được tạo ra

-3
’
exonuclease) khi tổng hợp sợi bổ sung ở giai đoạn
kéo dài. Sự thủy giải taqman probe sẽ làm tách rời chất phát huỳnh quang
(fluorophore) FAM ở đầu 5
’
khỏi chất hấp phụ huỳnh quang (quencher) ở đầu 3
’
của
probe, nhờ vậy ống phản ứng sẽ phát huỳnh quang khi bị chiếu tia cực tím hay laser
và sự phát huỳnh quang này sẽ được ghi nhận bởi đầu đọc real time của máy.
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 24 Hình 1.8: Nguyên lý kĩ thuật Real time PCR sử dụng Taqman Probe (phát
hiện , đinh lƣợng và định type HCV).
1.4.1.4. Máy Real-time PCR [10]
Điều kiện đầu tiên để có thể thực hiện được Real-time PCR (RT - PCR) là phải
có máy RT - PCR. Máy này cũng có một buồng ủ nhiệt chạy được chương trình
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 25

luân nhiệt như máy PCR bình thường, nhưng có thêm một thiết bị được gọi là thiết
bị real-time. Đây là một thiết bị quang học có hai chức năng:
+ Có các nguồn sáng phát ra được các tia sáng kích thích có bước sóng xác định