ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HÀ NỘI

Hoàng Thị Thanh Hà

XÂY DỰNG QUY TRÌNH
SẢN XUẤT MẪU NGOẠI KIỂM ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG
PHÒNG THÍ NGHIỆM HUYẾT THANH HỌC HIV
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC


Xin cảm ơn các bạn đồng nghiệp trong khoa, đặc biệt các bạn đồng nghiệp tại
Phòng thí nghiệm huyết thanh học HIV đã đồng hành cùng tôi trong suốt thời
gian thực hiện nghiên cứu không kể ngày đêm.
Cuối cùng tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, đến Bố Mẹ hai bên
cùng chồng và các con, những người thân yêu trong gia đình. Gia đình luôn là
điểm tựa và là nguồn động viên không thể thiếu đối với tôi trong suốt cuộc đời này.
Để hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự ủng hộ về tài chính từ dự án
“Nâng cao năng lực giám sát và xét nghiệm HIV tại Việt Nam, giai đoạn 2010-
2015” do Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa bệnh tật Hoa Kỳ tài trợ.
Hà nội, ngày 4 tháng 12 năm 2014

Hoàng Thị Thanh Hà

i
MỤC LỤC
MỤC LỤC i
DANH MỤC BẢNG iv
DANH MỤC HÌNH v
BẢNG DANH MỤC VIẾT TẮT vi
MỞ ĐẦU 1
Chương 1- TỔNG QUAN 3
1.1 THÔNG TIN CƠ BẢN VỀ HIV/AIDS 3
1.1.1 Cấu trúc của Virut HIV 3
1.1.2 Vòng đời của vi rút HIV 4

1.4.6.4 Các phương pháp sản xuất mẫu ngoại kiểm HIV 24
1.4.6.5 Phương pháp đánh giá chất lượng mẫu ngoại kiểm 24
1.5 HỆ THỐNG CÁC PHÒNG THÍ NGHIỆM HIV TẠI VIỆT NAM 25
Chương 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 27
2.1 ĐỐI TƯỢNG 27
2.2 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT 27
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30
2.3.1 Xây dựng bộ mẫu chuẩn EQAS 30
2.3.2 Xác định đặc tính của mẫu chuẩn 30
2.3.3 Kỹ thuật chuyển đổi huyết tương thành huyết thanh 33
2.3.4. Đánh giá chất lượng mẫu sản xuất 35
2.3.4.1 Đánh giá độ đồng nhất 35
2.3.4.2 Đánh giá độ ổn định 36
2.3.4.3 Kiểm tra vô khuẩn 37
2.4. Áp dụng bộ mẫu với các phòng thí nghiệm tại Việt Nam. 38
Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 39
3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT BỘ MẪU NGOẠI KIỂM . 39
3.1.1. Kết quả phân tích đặc điểm bộ mẫu chuẩn 39
3.1.2 Kết quả chuyển đổi huyết tương thành huyết thanh 42
3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG BỘ MẪU 48
3.2.1. Đánh giá độ đồng nhất 48
3.2.2. Đánh giá độ ổn định mẫu 50
3.2.3. Đánh giá tính vô khuẩn của bộ mẫu 53

iii
3.2.4. Đánh giá chất lượng mẫu thông qua phiếu khảo sát 54
3.3. QUY TRÌNH SẢN XUẤT MẪU NGOẠI KIỂM 54

Bảng 12: Kết quả đánh giá độ ổn định của mẫu chuẩn 52
Bảng 13: Kết quả độ vô trùng của mẫu chuẩn 53
Bảng 14: Độ ổn định của bộ mẫu gửi đến 398 đơn vị 58
Bảng 15: Kết luận của các phòng thí nghiệm về kết quả của bộ mẫu chuẩn 59
v
DANH MỤC HÌNH

Hình 1. Cấu trúc vi rút HIV [15] 4
Hình 2: Vòng đời của vi rút HIV[15] 5
Hình 3: Biến đổi các thông số sinh học trên bệnh nhân HIV chưa điều trị 7
Hình 4: Mô hình quản lý chất lượng[70] 12
Hình 5: Sơ đồ hoạt động của phòng thí nghiệm [70] 13
Hình 6: Vai trò của các đơn vị tham gia ngoại kiểm 18
Hình 7: Cách tính T test thông qua phần mềm Exel 37
Hình 8: Thử nghiệm phục hồi Caxi với các nồng độ khác nhau 43


Chữ viết tắt
Nghĩa tiếng Anh
Nghĩa tiếng Việt
AIDS

Acquired Immune Deficiency
Syndrome
Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc
phải
ADN

Acid Desoxyribonucleic
ARN

Acid Ribonucleic
CDC
Centers for Disease Control
and Prevention
Trung tâm Kiểm soát và Phòng chống
bệnh tật Hoa Kỳ
CLSI
Clinical and Laboratory
Standards Institute
Viện tiêu chuẩn phòng thí nghiệm và
lâm sàng
CRM
Certified Reference
Materials
Vật liệu so sánh chuẩn

Virus gây suy giảm miễn dịch ở người

vii
Virus
HTQLCL
Quality Management System
Hệ thống quản lý chất lượng
ISO
International Organization
for Standardization
Tổ chức tiêu chuẩn hóa quốc tế
IQC
Internal Quality Control
Nội kiểm chứng
IUPAC
International Union of Pure
and Applied Chemistry
Quy dịnh quốc tế hài hòa dối với thử
nghiệm thành thạo
trong linh vực hóa phân tích
OD
Optical Density
Mật độ quang học
OIML
International Organization
of Legal Metrology
Cơ quan đo lường hợp pháp quốc tế

squares
Tổng biến thiên giữa các nhóm
SST
Total sum of squares
Tổng biến thiên trong nhóm và giữa
các nhóm
SSW
Within-group sums of
squares
Tổng biến thiên trong nội bộ nhóm

viii
TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam
TTYTDP
Center for preventive
medicine
Trung tâm Y tế dự phòng
TTAIDS
Provincial AIDS Center
Trung tâm Phòng chống AIDS
UNAIDS USAID
The United States Agency for
1
MỞ ĐẦU
Kể từ khi được phát hiện vào năm 1981, dịch HIV/AIDS đã nhanh chóng lây
lan trên phạm vi toàn thế giới và trở thành một trong những đại dịch nguy hiểm nhất
cho đến hiện nay. Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới, tính đến cuối năm 2009,
toàn thế giới có khoảng 33,3 triệu người lớn và trẻ em nhiễm HIV/AIDS còn sống
và hàng năm có khoảng 2,6 triệu người mới nhiễm và 1,8 triệu người tử vong do
AIDS [12]. Do nên
(WHO) khu như

- 9/2014 24.223
9.617 70.734
Những trường hợp chẩn đoán mới
Trong công tác phòng chống HIV/AIDS từ trước cho đến nay, c
thí
và mở rộng ra tuyến xã
Độ chính xác và đáng tin cậy của kết quả xét nghiệm nói
chung và đặc biệt là xét nghiệm HIV là vấn đề quan trọng của bất kỳ phòng thí
nghiệm nào trong công tác chẩn đoán, chăm sóc y tế và nghiên cứu khoa học. Kết
quả xét nghiệm HIV sai sẽ mang đến những hậu quả nặng nề đối với người bệnh,
gia đình và cả xã hội đồng thời sẽ ảnh hưởng đến uy tín của phòng thí nghiệm. Để
có được độ chính xác và đáng tin cậy về kết quả xét nghiệm phòng thí nghiệm cần
phải có một chương trình đảm bảo chất lượng xét nghiệm tổng thể, chương trình
này phải được tiến hành thường xuyên liên tục và có độ tin cậy.
Ngoài ra, hiện nay trên thị trường có rất nhiều loại sinh phẩm khác nhau,
mặc dù có các loại sinh phẩm chẩn đoán HIV chất lượng tốt, sẵn có tuy nhiên chưa
đủ đảm bảo các kết quả của phòng thí nghiệm là đáng tin cậy. Mẫu bệnh phẩm từ
khi thu thập đến khi trả kết quả cho khách hàng phải trải qua nhiều bước, nhiều qui

- Đánh giá chất lượng mẫu sau khi sản xuất
- Sản xuất mẫu ngoại kiểm trong điều kiện ở Việt Nam .
3
Chương 1- TỔNG QUAN

1.1 THÔNG TIN CƠ BẢN VỀ HIV/AIDS
Tháng 6 năm 1981, lần đầu tiên loài người biết đến một căn bệnh lạ trên thế
giới, đó là Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở người (AIDS). Đó là những ca
bệnh được mô tả tại Los Angeles với biểu hiện viêm phổi do Pneumocystis carinii ở
5 thanh niên có quan hệ tình dục đồng giới [38]. Do đó tên gọi ban đầu của hội
chứng này là suy giảm miễn dịch có liên quan với tình dục đồng giới. HIV lần đầu
tiên được các nhà khoa học Pháp ở Viện Pasteur Paris phân lập vào năm 1983 [23].
Kể từ đó đến nay, nhiễm HIV/AIDS được coi là đại dịch và là thảm họa của nhân
loại bởi tốc độ lây truyền rất nhanh và rộng khắp. Hiện nay, chưa có thuốc điều trị
chữa khỏi và tỷ lệ tử vong rất cao.
HIV (Human Immunodeficiency Virus) là vi rút gây suy giảm miễn dịch ở
người, làm cho cơ thể suy giảm khả năng chống lại các tác nhân gây bệnh.
AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome) là Hội chứng suy giảm
miễn dịch mắc phải ở người do HIV gây ra, thường được biểu hiện thông qua các
nhiễm trùng cơ hội, bệnh ung thư và có thể dẫn đến tử vong. Đây là giai đoạn cuối
cùng của nhiễm HIV.
Một người khi bị nhiễm HIV sẽ trở thành nguồn lây nhiễm suốt đời cho
người khác. Hầu hết những người nhiễm HIV đều không có các dấu hiệu và triệu
chứng của bệnh trong thời gian dài và có thể không biết rằng mình đã bị nhiễm

Hệ miễn dịch của cơ thể mà chủ yếu là các tế bào Lympho giúp chống lại các
tác nhân gây bệnh từ bên ngoài xâm nhập vào. Trong đó tế bào lympho T4 đóng vai

5
trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch của cơ thể. Khi vào cơ thê, HIV tấn công
có lựa chọn vào các tế bào lympho T4 (Hình 2). Về vòng đời của HIV khi xâm
nhậm vào cơ thể người diễn ra như sau:
- Vi rút gắn lên bề mặt tế bào: Nhờ phân tử CD4 và các đồng thụ thể CCR5,
CXCR4 với tế bào lympho T, vi rút gắn vào bề mặt tế bào đích.
- Vi rút xâm nhập tế bào: Sau khi bám vào tế bào đích, phân tử protein gp41
của vi rút cắm vào màng tế bào tạo nên hiện tượng hòa màng. Do đó, bộ gen và
enzym của HIV giải phóng vào trong tế bào.
- Vi rút nhân lên trong tế bào: Nhờ men sao chép ngược, ADN bổ sung của
HIV được tạo thành từ khuôn mẫu ARN của nó. Đầu tiên là phân tử lai ARN-ADN,
sau đó ARN được tách ra khỏi ADN nhờ ADN-ase và sợi ADN bổ cứu mới được
tổng hợp tạo thành ADN chuỗi kép. Sau khi được tổng hợp, ADN chuỗi kép chui
vào nhân tế bào đích, quá trình tích hợp vào ADN tế bào nhờ men integrase. Vì vậy,
HIV đã tránh được sự phát hiện của hệ thống bảo vệ (hệ thống miễn dịch) của cơ
thể cũng như tránh được tác dụng trực tiếp của thuốc.
- Vi rút nảy chồi: Từ các thành phần được tổng hợp, các hạt HIV mới được
lắp ráp tại bào tương tế bào. Các hạt vi rút tiến gần khu vực màng sinh chất và nảy
chồi ở màng tế bào.

Hình 2: Vòng đời của vi rút HIV[15]
Khi vi rút xâm nhập tế bào, có hai khả năng xảy ra:
do lây truyền qua đường tình dục [12]. Từ năm 1994 dịch bắt đầu lan ra các thành
phố lớn và đến 1998 dịch đã lan ra 100% các tỉnh, thành phố. Trong giai đoạn 2001-

7
2005, dịch lan rộng và tăng nhanh. Trong số những ca nhiễm HIV được phát hiện
giai đoạn này, nam giới chiếm 85%, nữ giới chiếm 15%, nhóm tuổi nhiễm HIV tập
trung từ 20-39 tuổi (chiếm 8%). Trong giai đoạn này dịch HIV không chỉ tập trung
chủ yếu trong nhóm nghiện chích ma túy và phụ nữ bán dâm như trước mà còn xuất
hiện ở tất cả các ngành nghề, địa vị trong xã hội. Dịch cũng không tập trung tại
thành thị mà lan rộng đến khu vực nông thôn, miền núi.
Tính đến 30/9/2014, cả nước có 224.223 người nhiễm HIV hiện đang còn
sống được báo cáo, trong đó có 69.617 trường hợp chuyển sang giai đoạn AIDS và
số người tử vong do HIV/AIDS là 70.734 trường hợp [7, 12].
1.2 XÉT NGHIỆM HIV TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM
Khi cơ thể nhiễm HIV, phản ứng của cơ thể đáp ứng lại với tác nhân gây
bệnh sẽ có những biến đổi thông số sinh học (hình 3)
thông số sinh học trong quá trình nhiễm vi rút, các kỹ thuật xét nghiệm có thể phát
hiện kháng thể kháng HIV, kháng nguyên vi rút hoặc các chất liệu di truyền ARN
hoặc tiền ADN.
Hinh 3: Biến đổi các thông số sinh học trên người nhiễm HIV chưa điều trị
9
tháng tuổi. Bao gồm các kỹ thuật như: Kỹ thuật Elisa, kỹ thuật xét nghiệm đơn
giản/nhanh, kỹ thuật hóa phát quang, điện hóa phát quang, Western Blot.
Phương pháp trực tiếp: Là phương pháp tìm trực tiếp các thành phần của
vi rút như : ADN tiền virút, ARN, p24 hoặc phân lập virút. Các phương pháp xét
nghiệm trực tiếp được dùng trong chẩn đoán sớm nhiễm HIV ở trẻ em dưới 18
tháng tuổi. Bao gồm các kỹ thuật như: Phát hiện kháng nguyên p24 bằng kỹ thuật
elisa, kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện ARN, ADN provirus, kỹ thuật Real time
PCR phát hiện nhiễm HIV (Kỹ thuật PCR theo thời gian thực), kỹ thuật PCR – lai
phân tử phát hiện HIV - ADN tiền virut [5, 11].
1.2.2 Chiến lược và phương cách xét nghiệm HIV
ELISA cho kết quả dương tính và được xét nghiệm khẳng định bằng Western Blot
được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán trường hợp HIV dương tính. Các mẫu
sàng lọc ELISA có kết quả âm tính thì mẫu đó được coi là âm tính [64, 67, 68].
Tuy nhiên để thực hiện xét nghiệm chẩn đoán dương tính HIV theo tiêu
chuẩn vàng thường có giá thành rất cao mà nhiều nước không thể áp dụng được do
nguồn lực tài chính hạn chế. Chính vì lý do đó, để đảm bảo chất lượng xét nghiệm
cũng như đảm bảo nguồn lực tài chính, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã nghiên cứu
và đưa ra các chiến lược xét nghiệm bằng cách phối hợp các loại sinh phẩm thông
thường theo các phương cách nhất định nhưng có thể đưa ra kết quả xét nghiệm có
độ tin cậy cao tương tự như xét nghiệm bằng tiêu chuẩn vàng [64, 68, 69].
Bộ Y tế Việt Nam theo hướng dẫn của WHO cũng đã ban hành các hướng
dẫn về xét nghiệm HIV dựa vào chiến lược và phương cách xét nghiệm.
Chiến lược xét nghiệm HIV:
Xét nghiệm HIV được tiến hành theo những chiến lược khác nhau tùy thuộc
vào mục đích xét nghiệm, tỷ lệ hiện nhiễm HIV của quần thể xét nghiệm.

1.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM
1.3.1 Một số khái niệm về chất lượng
- Chất lượng (Quality): Là mức độ của tập hợp các đặc tính vốn có đáp ứng
các yêu cầu.
- Quản lý chất lượng (Quality Management-QM): Là một loạt các hoạt động
có phối hợp để định hướng và kiểm soát một tổ chức về chất lượng. Việc định

11
hướng và kiểm soát về chất lượng một tổ chức nói chung bao gồm: chính sách chất
lượng; mục tiêu chất lượng; hoạch định chất lượng; kiểm soát chất lượng; đảm bảo
chất lượng và cải tiến chất lượng.
- Kiểm soát chất lượng (Quality Control-QC): Các hoạt động và kỹ thuật
được sử dụng nhằm đáp ứng đầy đủ các yêu cầu chất lượng.
- Đảm bảo chất lượng (Quality Assurance-QA): Tất cả các hoạt động hệ
thống được lập kế hoạch thiết yếu nhằm cung cấp độ tin cậy chắc chắn rằng sản
phẩm hoặc dịch vụ thỏa mãn các yêu cầu chất lượng.
- Đánh giá chất lượng bên ngoài (External Quality Assessment-EQA), còn
được gọi ngoại kiểm hay thử nghiệm thành thạo phòng thí nghiệm: Việc xác định
hoạt động thử nghiệm của phòng thí nghiệm bằng so sánh liên phòng.
- So sánh liên phòng: Việc tổ chức, thực hiện và đánh giá các thử nghiệm
trên cùng một mẫu thử nghiệm hoặc mẫu thử nghiệm tương tự được thực hiện bởi
hai hay nhiều phòng thí nghiệm theo các điều kiện xác định trước [9-11].
1.3.2 Giới thiệu về hệ thống đảm bảo chất lượng
Hệ thống quản lý chất lượng (HTQLCL) do Viện tiêu chuẩn phòng thí
nghiệm và lâm sàng CLSI Hoa Kỳ đề xuất , hệ thống này bao hồm 12 thành tố cơ
bản bao trùm tất cả các hoạt động của phòng thí nghiệm [29, 30]. Mô hình của
HTQLCL hoàn toàn phù hợp với các tiêu chuẩn quốc tế (International Organization

Quản lý thông tin: Các thông tin phòng thí nghiệm cần được quản lý cẩn thận
đảm bảo sự chính xác và bí mật.
Tài liệu và hồ sơ: Tài liệu và hồ sơ luôn được lưu giữ cẩn thận để đảm bảo sự
chính xác và có thể đánh giá được.

13
Quản lý sự cố: Phòng thí nghiệm luôn cần một hệ thống để phát hiện những
vấn đề và sự cố, hành động khắc phục, tìm hiểu nguyên nhân và đưa ra những hành
động để không tái diễn các sự cố.
Đánh giá: Quá trình đánh giá chính là công cụ để kiểm soát việc thực hiện
của phòng thí nghiệm và so sánh với các chuẩn mực để đánh giá.
Cải tiến quá trình: Mục đích đầu tiên của HTQLCL là sự cải tiến liên tục các
quá trình trong phòng thí nghiệm và sự cải tiến được thực hiện một cách hệ thống.
Dịch vụ khách hàng: Đảm bảo khách hàng nhận được các dịch vụ cần thiết cho họ.
Cơ sở vật chất và an toàn: Cơ sở vật chất và an toàn bao gồm nhiều vấn đề
như: An ninh, An toàn, sức khỏe người lao động, môi trường làm việc [20, 25, 44].
1.3.3 Sơ đồ hoạt động của phòng thí nghiệm
Hoạt động của một phòng thí nghiệm được chia thành 3 giai đoạn: Giai
đoạn trước xét nghiệm, giai đoạn trong xét nghiệm và giai đoạn sau xét nghiệm
(Hình 5).

Hình 5: Sơ đồ hoạt động của phòng thí nghiệm [70]
1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng xét nghiệm:
Với sự phát triển của tiến bộ khoa học kỹ thuật, đặc biệt khoa học y học
nhiều kỹ thuật xét nghiệm, phân tích các thành phần các chất trong cơ thể (liên quan
đến xét nghiệm huyết học, sinh hóa và vi sinh cả máu, dịch sinh học và nước tiểu,


độ ăn uống, vận động, nhịp độ sinh học hay tư thế bệnh nhận , biến động do tình
trạng bệnh, biến động do lấy mẫu như vị trí lấy mẫu, thời gian lấy, điều kiện bảo
quản, vận chuyển cũng đều ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm [9, 10, 21].

15
1.3.4.2 Giai đoạn xét nghiệm
Trong giai đoạn này việc biến động đối với kỹ thuật phân tích ảnh hưởng
nhiều đến kết quả xét nghiệm. Đó là việc biến động tại các cơ sở xét nghiệm do sai
so của các thiết bị và kỹ thuật. Ngoài ra các biến động trong cơ sở xét nghiệm cũng
ảnh hưởng nhiều đến kết quả. Đó là những sai số trong phòng thí nghiệm hoặc trình
độ tay nghề của cán bộ. Những sai sót trong giai đoạn xét nghiệm thường xảy ra khi
các đơn vị không có quy trình chuẩn hoặc có nhưng không tuân thủ cũng như các
trang thiết bị không được hiệu chỉnh định kỳ. Vì vậy, giai đoạn này phòng thí
nghiệm cần đảm bảo thực hiện xét nghiệm theo quy trình chuẩn thức phù hợp, nhằm
đạt được kết quả với độ chính xác cao, đáp ứng yêu cầu xét nghiệm. Quy trình thực
hiện xét nghiệm phải có tính chuẩn thức, được công nhận và được cập nhật. Các
quy trình phải được viết bằng ngôn ngữ dễ hiểu đối với nhân viên, theo mẫu quy
định và luôn được để sẵn trên bàn làm việc để tiện tham khảo. Bên cạnh đó việc
đảm bảo chất lượng xét nghiệm cần được thực hiện thông qua việc sử dụng các mẫu
nội kiểm tra và tham gia các chương trình ngoại kiểm tra và định kỳ hiệu chỉnh các
trang thiết bị [9, 10, 21].
1.3.4.3. Giai đoạn sau xét nghiệm
Sau khi đã hoàn thành xét nghiệm, việc đánh giá và ghi nhận kết quả, gửi trả
kết quả đến nơi yêu cầu xét nghiệm là rất quan trọng. Việc vào hồ sơ xét nghiệm và
trả kết quả cần tránh sai sót và chậm trễ, gây tổn hại đến uy tín của phòng thí
nghiệm. Trả lời kết quả xét nghiệm cần đảm bảo đủ thông tin và được lưu trữ ở
phòng thí nghiệm để tiện tham khảo hoặc tra cứu khi cần thiết [9, 10, 21].