TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
∞ PHẠM THỊ TƯƠI
XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG
CÂY HOA CÚC CN01
(Chrysanthemum maximum Seiun - 3)
BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

HÀ NỘI, 2014
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
∞

thực vật, Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ, Phòng thí
nghiệm sinh lí thực vật, khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội
2 đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện trong suốt quá trình tôi thực hiện đề
tài.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn những người thân và bạn bè đã động viên, tạo
mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học tập cũng như hoàn thành
khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2014
Sinh viên thực hiện

Phạm Thị Tươi

Phạm Thị Tươi K36B - Sinh
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu đề tài: “Xây dựng quy trình nhân
giống cây hoa cúc CN01 (Chrysanthemum maximum Seiun - 3) bằng kỹ
thuật nuôi cấy in vitro” là kết quả nghiên cứu của riêng tôi do ThS. La Việt
Hồng hướng dẫn và không trùng lặp với kết quả của tác giả khác.
Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2014
Sinh viên thực hiện


Murashige and Skoog, 1962 Phạm Thị Tươi K36B - Sinh
DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Các công thức thí nghiệm xác định hiệu quả của chất khử trùng 26
Bảng 2.2. Các công thức thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ
BAP đến khả năng tái sinh và tạo đa chồi ở cúc CN01 27
Bảng 2.3. Các công thức thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ  -
NAA đến khả năng hình thành rễ của chồi cúc CN01 28
Bảng 2.4. Các công thức thí nghiệm xác định ảnh hưởng của các giá thể
dinh dưỡng đến tỉ lệ sống của cây in vitro ngoài tự nhiên 28
Bảng 3.1. Hiệu quả chất khử trùng trên mẫu đỉnh sinh trưởng của cây cúc
CN01 31
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân chồi cúc CN01 Số
mẫu cấy 36
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ  - NAA đến số lượng và chiều dài rễ
cúc CN01 38
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây trong vườn ươm 41

Phạm Thị Tươi K36B - Sinh
DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Chrysanthemum maximum Seiun - 3 8
Hình 2.1. Chồi đỉnh cây hoa cúc CN01 24
Hình 3.1. Mẫu cúc bị nhiễm khuẩn sau 5 ngày nuôi cấy 33
Hình 3.2. Mẫu cúc bị mốc sau 5 ngày nuôi cấy 33
Hình 3.3. Mẫu cúc sạch nhưng chết sau 5 ngày nuôi cấy 33
Hình 3.4. Mẫu cúc vô trùng sau 5 ngày nuôi cấy 33

1.1.3.2. Sinh thái cây hoa cúc 5
1.2. Giá trị kinh tế của cây hoa cúc 7
1.3. Đặc điểm cây hoa cúc CN0l 7
1.4. Tình hình sản xuất và thương mại cây hoa cúc trên thế giới và Việt
Nam 8
1.4.1. Tình hình sản xuất và thương mại cây hoa cúc trên thế giới 8
1.4.2. Tình hình sản xuất và thương mại hoa cúc ở Việt Nam 9
1.5. Tình hình nghiên cứu cây hoa cúc trên thế giới và ở Việt Nam trong
lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào 10
1.5.1. Tình hình nghiên cứu cây hoa cúc trên thế giới 10
1.5.2. Tình hình nghiên cứu về cây hoa cúc ở Việt Nam 11
1.6. Nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng trong công tác nhân giống 13
Phạm Thị Tươi K36B - Sinh
1.6.1. Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào 13
1.6.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô và tế bào thực vật 13
1.6.2.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật 13
1.6.2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào 13
1.7. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 14
1.7.1. Vật liệu nuôi cấy 14
1.7.2. Môi trường nuôi cấy 15
1.7.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy 19
1.8. Các nguyên tắc kỹ thuật về nhân giống in vitro 19
1.9. Ứng dụng của nuôi cấy in vitro trong sản xuất 21
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.1. Vật liệu thực vật 24
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 24
2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 24
2.3.1. Thiết bị 24
2.3.2. Dụng cụ 25
2.4. Môi trường nuôi cấy 25

hấp dẫn người tiêu dùng về màu sắc, hình dáng và mùi thơm kín đáo mà còn
thu hút các nhà sản xuất kinh doanh bởi đặc trưng rất bền, một đặc tính mà
không phải bất kỳ loài hoa nào cũng có. Với các ưu thế đó, hoa cúc đang
được các nhà trồng hoa chú trọng đầu tư và phát triển.
Trong số các giống cúc hiện nay, cúc CN01 (Chrysanthemum maximum
Seiun - 3) là giống có năng suất cao, các đặc điểm về chất lượng hoa lại phù
hợp với nhu cầu xuất khẩu nên hiện đang trồng phổ biến. Tuy nhiên, cúc
CN01 lại được trồng chính vào mùa vụ mà thời tiết không thuận lợi, sâu bệnh
nhiều, việc nhân giống bằng phương pháp giâm cành vẫn còn gặp nhiều khó
khăn.
Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, kỹ thuật nhân giống vô
tính bằng phương pháp nuôi cấy in vitro tỏ ra rất hiệu quả, cung cấp số lượng
lớn cây giống sạch bệnh với tốc độ nhanh, chất lượng đồng đều và đồng nhất
về mặt di truyền, đáp ứng được nhu cầu cho thực tiễn sản xuất. Do đó, tôi đã
lựa chọn và tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xây dựng quy trình nhân giống
Phạm Thị Tươi 2 K36B - Sinh
cây hoa cúc CN01 (Chrysanthemum maximum Seiun - 3) bằng kỹ thuật
nuôi cấy in vitro”.
2. Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu
2.1. Mục đích nghiên cứu
Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hoa cúc CN01 để góp phần
đáp ứng thực tiễn sản xuất hoa cúc hiện nay.
2.2. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Nghiên cứu phương pháp khử trùng tạo vật liệu in vitro.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh và nhân nhanh
chồi cúc CN01.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của  - NAA đến khả năng tạo rễ để tạo cây in
vitro hoàn chỉnh.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây con sau giai
đoạn nuôi cấy.

Ngành: Angiospermatophyta
Lớp: Dicotyledones
Bộ: Asterales
Họ: Asteraceae
Chi: Chrysanthemum sp.
Loài: có nhiều loài, nhưng phổ biến như hoa cắt cành có thể kể là morifolium

Phạm Thị Tươi 4 K36B - Sinh
Họ cúc Asteraceae là một trong những họ lớn nhất của Ngành Ngọc Lan
(Magnoliophyta), thực vật hạt kín (Angniospermatophyta) 29. Qua hai hội
thảo quốc tế về họ Asteraceae năm 1967 và 1994 mang tên “Sinh học và hóa
học của họ cúc” đã có sự thống nhất tương đối về hệ thống học của họ
Asteraceae. Họ cúc trên thế giới xếp trong 2 phân họ, 13 tông 22, Việt Nam
có 2 phân họ và 12 tông, nhưng hiện tại chia làm 17 tông. Họ cúc có khoảng
1550 chi với 23000 loài 1 15 29.
Tuy nhiên, có nhiều tài liệu khác nhau về số liệu loài hoa cúc. Theo
GS.TS Khoa học Nguyễn Nghĩa Thìn thì họ cúc có 2500 loài và có 1100 chi
15. Theo Trần Lan Hương và cộng sự, hoa cúc có hơn 3000 loài với kích
thước, màu sắc khác nhau 4. Nghiên cứu của Anderson (1987), Langton
(1989) cho biết trên thế giới có hơn 7000 giống cúc đã đưa vào sử dụng với
sự đa dạng về chủng loại, phong phú về màu sắc 18 23.
1.1.3. Đặc điểm thực vật học và sinh thái cây hoa cúc
1.1.3.1. Đặc điểm thực vật học
- Rễ
Cúc thuộc loại rễ chùm, phần lớn phát triển theo chiều ngang phân bố ở
tầng đất mặt từ 5 - 20 cm, số lượng rễ lớn nên có khả năng hút nước và dinh
dưỡng mạnh.
- Thân
Cúc là cây thân thảo có nhiều đốt giòn, dễ gãy nên khi cây lớn phải làm
giàn để đỡ cây khỏi đổ.

C, cúc có thể chịu được nhiệt
độ từ 10 - 35
0
C, nhưng nhiệt độ trên 35
0
C và dưới 10
0
C sẽ làm cho cúc sinh
trưởng và phát triển kém. Ở thời kì cây con, cúc cần nhiệt độ cao hơn. Đặc
biệt trong thời kì ra hoa, đảm bảo cho cúc nhiệt độ cần thiết thì hoa sẽ to và
Phạm Thị Tươi 6 K36B - Sinh
đẹp. Ban ngày, cây cần nhiệt độ cao để quang hợp, còn ban đêm nếu nhiệt độ
cao sẽ thúc đẩy quá trình hô hấp làm tiêu hao chất dự trữ trong cây.
- Ánh sáng
Ánh sáng có sự ảnh hưởng rất lớn đến sự ra hoa và phân hóa mầm hoa
của cây hoa cúc. Tuy nhiên, ở mỗi thời kỳ sinh trưởng và phát triển cây có
yêu cầu ánh sáng khác nhau:
+ Thời kỳ cây con: khi mới ra rễ cây cần ít ánh sáng vì lúc này cây non
còn sử dụng các chất dinh dưỡng dự trữ.
+ Thời kỳ chuẩn bị phân cành: cây cần nhiều ánh sáng để quang hợp tạo
các chất hữu cơ cần thiết cho hoạt động sống của cây.
Cúc được xếp vào loại cây ngày ngắn, thời kỳ để phân hóa mầm hoa tốt
nhất là 10 giờ chiếu sáng/ngày với nhiệt độ là 20 - 25
0
C. Thời gian chiếu sáng
kéo dài thì thời gian sinh trưởng của cây hoa cúc dài hơn, thân cao, lá to, chất
lượng hoa tăng. Thời gian chiếu sáng ngắn thì sẽ kích thích phân hóa mầm
hoa sớm, cây ngắn, chất lượng hoa kém 12.
- Ẩm độ
Độ ẩm thích hợp nhất cho cây sinh trưởng phát triển là độ ẩm đất 60 -

nhu cầu trang trí vào những ngày lễ.
Một số loài khác của chi Chrysanthemum sp. như cúc vàng hay kim cúc
(C. indicum L.) có bông nhỏ hơn, dùng để pha chè, ngâm rượu, trồng làm
cảnh; cúc trắng hay bạch cúc (C. morfolium ramat) dùng để pha chè, ngâm
rượu hoặc làm thuốc chữa nhức đầu, đau mắt; rau cải cúc (C. coronarium L.)
thường trồng làm rau ăn 16.
1.3. Đặc điểm cây hoa cúc CN0l
Giống cúc CN01 (Chrysanthemum maximum Seiun - 3) là giống cúc đơn
10. Đây là giống nhập nội của Nhật Bản, được cung cấp từ Trung tâm
Phạm Thị Tươi 8 K36B - Sinh
Nghiên cứu và Phát triển Hoa - Cây cảnh, Viện Di truyền Nông nghiệp tháng
3 năm 2001.
Giống có đặc điểm cây cao 70 - 75 cm, thân mập cứng, lá dài xanh bóng,
bộ lá gọn, khả năng phân cành ít nên có thể
trồng dày 45 - 50 cây/m
2
. Hoa kép to, cánh
ngắn, cứng, xếp chặt, có màu vàng cam 10.
Thời gian sinh trưởng từ 85 - 95 ngày, độ
bền hoa cắt từ 10 - l2 ngày, được trồng chính
vào các vụ xuân hè, hè thu và thu sớm.
Theo số liệu thống kê chưa đầy đủ từ
Phòng Nông nghiệp các tỉnh phía Bắc, năm
2003, diện tích trồng cúc CN01 đã lên đến
6,3 ha; riêng Hà Nội có 4,9 ha 3.

1.4. Tình hình sản xuất và thương mại cây hoa cúc trên thế giới và Việt
Nam
1.4.1. Tình hình sản xuất và thương mại cây hoa cúc trên thế giới
Tuy cây hoa cúc có nguồn gốc từ lâu đời nhưng đến năm 1688, Jacob

lên đáng kể. Tuy nhiên, lượng hoa sản xuất ra thực sự còn rất hạn chế so với
nhu cầu rất cao của thị trường, cũng như tiềm năng kinh tế to lớn mà cây hoa
cúc có thể mang lại nếu được đầu tư phát triển.
Hiện nay ở Việt Nam, việc nhân giống cây hoa cúc chủ yếu bằng phương
pháp vô tính gồm hai biện pháp:
- Nhân giống bằng giâm cành: chọn cành bánh tẻ, to khoẻ, không sâu
bệnh làm cành giâm. Cành giâm có chiều dài 6 - 8 cm, có 3 - 4 lá, sau khi
giâm phải che nắng, che mưa, giữ ẩm 70% - 80%.
- Nhân giống bằng nuôi cấy in vitro: là phương pháp được dùng phổ biến
hiện nay ở các nước trồng cúc bởi cây cúc dễ nhân giống trong ống nghiệm,
hệ số nhân giống cao, giá thành hạ, cây con sạch bệnh. Đặc biệt, phương pháp
Phạm Thị Tươi 10 K36B - Sinh
này có thể duy trì và nhân giống quanh năm, không phụ thuộc vào điều kiện
ngoại cảnh. Từ các mô, các cơ quan khác nhau qua nuôi cấy người ta có thể
tạo ra những cây hoàn chỉnh, hoàn toàn sạch bệnh và đồng nhất về mặt di
truyền.
1.5. Tình hình nghiên cứu cây hoa cúc trên thế giới và ở Việt Nam trong
lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào
Do giá trị kinh tế cũng như giá trị sử dụng của cây hoa rất cao mà trên
thế giới có rất nhiều nước đi sâu nghiên cứu kỹ thuật trồng hoa, kỹ thuật nhân
và tạo giống hoa mới.
1.5.1. Tình hình nghiên cứu cây hoa cúc trên thế giới
Năm l974, Asjes và cộng sự (Hà Lan) đã chứng minh rằng có thể sử
dụng nhiều bộ phận của cây hoa cúc để làm vật liệu nuôi cấy mô. Ông đã ứng
dụng thành công kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để tạo ra các giống cúc
sạch bệnh.
Việc sử dụng đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy in vitro cũng được thực hiện
thành công bởi Fukai, Goi và Tanaka (1991) [19]. Các tác giả đã nghiên cứu
phương pháp tối ưu để tạo mẫu vô trùng có tỷ lệ sống và tái sinh chồi cao
nhất. Kết quả thí nghiệm cho thấy, bảo quản chồi đỉnh cúc trước nuôi cấy 2

giống là giai đoạn đưa cây in vitro ra ngoài đất cũng rất quan trọng. Đây là
bước quyết định hiệu quả của toàn bộ quá trình vi nhân giống vào thực tiễn
sản xuất. Roberts và Smith (1990) [28] đã nghiên cứu bảo vệ rễ bằng chất
đệm cellulose sorbarods trong môi trường nuôi cấy dạng lỏng, làm giảm thiệt
hại trong quá trình đưa cây ra ngoài.
1.5.2. Tình hình nghiên cứu về cây hoa cúc ở Việt Nam
Ở Việt Nam, mặc dù cây hoa cúc đã được nhập nội vào nước ta từ lâu
nhưng sự hiểu biết cũng như kết quả nghiên cứu về cây hoa này còn chưa
nhiều. Nhìn chung, các kết quả nghiên cứu thường tập trung chủ yếu vào việc
tập hợp các kinh nghiệm trồng hoa và các phương pháp nhân giống.
Từ năm l992, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Hoa - Cây cảnh, Viện
Di truyền Nông nghiệp kết hợp với Bộ môn nuôi cấy mô tế bào của Viện đã
tiến hành nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cây hoa cúc bằng
Phạm Thị Tươi 12 K36B - Sinh
phương pháp nuôi cấy in vitro. Tiến hành thu thập, khảo sát và đánh giá một
số giống cúc mới, kết quả là từ 2/1993 đến tháng 2/1999, giống cúc CN93 và
CN98 đã được Hội đồng khoa học Bộ Nông nghiệp cho phép khu vực hóa,
đến tháng 4/1996 và 9/2000 lần lượt hai giống cúc CN93 và CN98 đã được
công nhận là giống cúc quốc gia.
Năm 1988, Nguyễn Quang Thạch và cộng sự [14] đã xây dựng hoàn
chỉnh quy trình nhân giống bằng nuôi cấy mô cho một số giống cúc đang
được trồng phổ biến ở miền Bắc nước ta như cúc CN93, vàng Đài Loan, đỏ
Hà Lan.
Theo Nguyễn Quang Thạch và các cộng sự (1998) [14] để nâng cao tỷ lệ
sống và ra rễ của cành giâm trong nhân giống vô tính có thể sử dụng IBA
hoặc  - NAA với nồng độ 1000 ppm bằng cách nhúng phần gốc của cành
khoảng 0,5 - 1 cm vào dung dịch thuốc từ 3 - 5 giây rồi cắm vào đất hoặc cát.
Điều tra về sâu bệnh hại trên cây hoa cúc, các tác giả của Trung tâm
Nghiên cứu và Phát triển Hoa - Cây cảnh, Viện Di truyền Nông nghiệp đã đề
xuất các biện pháp phòng trừ và xác định trên cúc có 9 loại bệnh hại bao gồm

cây mẹ.
1.6.2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào
Sự phân hoá là sự chuyển các tế bào từ dạng phôi sinh sang tế bào
chuyên hoá để đảm nhận chức năng sinh lý, sinh hoá khác nhau.
Sự phản phân hóa là sự chuyển từ tế bào chuyên hóa sang tế bào phôi
sinh để thực hiện chức năng phân chia.
Phạm Thị Tươi 14 K36B - Sinh
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là kết quả
của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào dựa trên tính toàn năng của tế
bào thực vật.
1.7. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.7.1. Vật liệu nuôi cấy
Cơ thể thực vật đa bào đều có tính toàn năng nghĩa là đều có khả năng
phân hóa tái sinh thành một cây hoàn chỉnh từ một tế bào, mô, cơ quan trong
môi trường dinh dưỡng nhân tạo và môi trường có điều kiện thích hợp. Do
vậy về nguyên tắc bất kỳ một bộ phận nào của cây cũng có thể sử dụng làm
vật liệu nuôi cấy, có thể là cơ thể thực vật nguyên vẹn như cây con, mầm non,
các mô sẹo, các tế bào đơn, tế bào trần,
Tuy nhiên, khả năng này phụ thuộc vào từng loài, có loài dễ tái sinh từ
mô nuôi cấy như khoai tây, cà chua, thuốc lá, có loài rất khó như hoa đồng
tiền, trầm hương, Thông thường các giai đoạn sinh trưởng khác nhau của
mô cũng như các bộ phận khác nhau của cây, khi nuôi cấy sẽ cho những kết
quả khác nhau 5 6. Điều đáng chú ý là những mô nuôi cấy có nguồn gốc từ
cây in vitro có khả năng phát sinh, phát triển tốt hơn so với những mô nuôi
cấy có nguồn gốc là những cây ngoài tự nhiên hay trong nhà kính. Nhìn
chung, tất cả các bộ phận như thân, lá, rễ, cuống lá, đều có thể sử dụng để
nuôi cấy, nhưng các cơ quan này do có sự chuyển hoá khác nhau nên quá
trình giải mã các thông tin di truyền trong đó để tạo mô, tạo chồi, tạo rễ, tái
sinh cây, là cũng rất khác nhau.
Kích thước mô nuôi cấy khác nhau sẽ cho các phản ứng không giống