Bộ giáo dục và đào tạo
Trờng đại học vinh
------------------

Xây dựng quy trình nhân giống
khoai lang tím Nhật (Beniazuma) nhập nội
bằng phơng pháp nuôi cấy mô in vitro

Luận văn thạc sĩ nông nghiệp
Chuyên ngành: Trồng trọt
Mã số: 60.62.01

Ngời thực hiện

: nguyễn ngọc khuê

Ngi hng dn khoa hc: pgs.ts. nguyễn đình san

Nghệ An - 2012


i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là
trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị, một công trình
nghiên cứu nào.
Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này
đều đã được cảm ơn. Trong luận văn tôi có sử dụng các thông tin từ nhiều
nguồn khác nhau, các thông tin trích dẫn được sử dụng đều được ghi rõ các
nguồn gốc, xuất xứ.
Tác giả luận văn

KI
mg/l
MS

Cộng sự
Công thức
Gibberellic acid
Indol acetic acid
Kinetine
Milligram/lít
Môi trường dinh dưỡng Murashige

MT
NCMTB
α - NAA

& Skoog 1962
Môi trường
Nuôi cấy mô tế bào
α - Naphlene acetic acid


iv
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các mốc quan trọng trong lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực
vật......................................................................................................15
Bảng 3.1.1. Ảnh hưởng của H2O2 10% và thời gian khử trùng đến tỉ
lệ sống của mẫu nuôi cấy..................................................................38
Bảng 3.1.2. Ảnh hưởng của HgCl2 0,1% và thời gian khử trùng
đến tỉ lệ sống của mẫu cấy................................................................40

Hình 3.1.3. Sự phát sinh chồi từ đốt thân ở giai đoạn vào mẫu........43
Hình 3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng tái sinh chồi
..........................................................................................................46
Hình 3.2.2. Ảnh hưởng tổng hợp của nước dừa và GA3 đến...........48
khả năng tái sinh chồi.......................................................................48
Hình 3.2.3. Chồi in vitro ở giai đoạn tái sinh chồi............................50
Hình 3.3.1. Ảnh hưởng của Kinetine đến khả năng bật chồi và.......51
hệ số nhân chồi khoai lang...............................................................51
Hình 3.3.2. Ảnh hưởng của IAA đến khả năng bật chồi và .............54
hệ số nhân chồi khoai lang................................................................54
Hình 3.3.3. Chồi khoai lang in vitro trong giai đoạn nhân nhanh....57
Hình 3.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ α - NAA đến hiệu quả ra rễ....59
của cây khoai lang in vitro................................................................59
Hình 3.4.2. Ảnh hưởng của α – NAA và than hoạt tính đến hiệu quả
ra rễ của cây khoai lang in vitro........................................................62
Hình 3.4.3. Chồi khoai lang Beniazuma trong giai đoạn ra rễ.........64
Hình 3.5.1. Ảnh hưởng của các loại giá thể đến sức sống của cây ex
vitro...................................................................................................66
Hình 3.5.2. Cây khoai lang ex vitro ở giai đoạn huấn luyện............68


vii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN................................................................................i
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT....................iii
DANH MỤC BẢNG.........................................................................iv
DANH MỤC HÌNH...........................................................................vi
MỤC LỤC........................................................................................vii
MỞ ĐẦU............................................................................................1
1. Lý do chọn đề tài....................................................................................................1

CHƯƠNG III....................................................................................38
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN................................38
3.1. Giai đoạn vào mẫu............................................................................................38
3.2. Giai đoạn tái sinh chồi......................................................................................44
3.3. Giai đoạn nhân nhanh.......................................................................................50
3.5. Giai đoạn huấn luyện thích nghi.......................................................................65
3.6. Một số lưu ý trong quá trình nhân giống khoai lang Nhật Beniazuma bằng
phương pháp in vitro.......................................................................................70
3.6.1. Vô trùng......................................................................................................70
3.6.2. Giai đoạn ở phòng thí nghiệm....................................................................70
3.6.3. Giai đoạn huấn luyện thích nghi.................................................................71

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..........................................................72
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................74


1
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Khoai lang (Ipomoea batatas. L) là một loài cây lương thực với các rễ củ
lớn, chứa nhiều tinh bột, có vị ngọt, củ khoai lang là nguồn cung cấp rau ăn
củ quan trọng. Nó đóng vai trò cả rau và lương thực. Khoai lang được trồng
và phân bố rất nhiều nơi trên thế giới như Châu Á, Châu Phi, Châu Mỹ
Latinh.
Trong số các cây lương thực, cây có củ giữ một vai trò quan trọng trong
sản xuất lương thực ở những nước nghèo, chậm và đang phát triển (Trịnh
Xuân Ngọ, Đinh Thế Lộc, 2004). Theo số liệu thống kê của Tổ chức Nông
lương Liên Hợp Quốc năm 2010 trên thế giới 77% khoai lang sử dụng làm
lương thực, 13% làm thức ăn gia súc, 6% làm nguyên liệu chế biến thành
nhiều sản phẩm khác nhau như luộc để ăn sáng, làm mứt, làm bánh kẹo, nước

biến sản phẩm. Thực tế sản xuất cho thấy, sau vài vụ trồng bằng dây giống
của vụ trước và trồng nhiều vụ trên một chân đất nên năng suất đã giảm rõ rệt.
Để cải thiện chất lượng giống nông dân phải mua giống gốc để trồng, rất thụ
động và tốn kém. Nếu cải tiến giống khoai lang theo phương pháp truyền
thống bằng cách gơ củ giống cũng phải mất đến hai năm mới khôi phục gần
như hoàn toàn đặc tính của giống gốc.
Vì vậy, để cây khoai lang thực sự có vị trí xứng đáng trong sản xuất
nông nghiệp ở nước ta thì định hướng đẩy mạnh công tác chọn tạo, bình tuyển
các giống khoai lang ngắn ngày có năng suất cao, phẩm chất củ ngon để sử
dụng làm lương thực, thực phẩm và các giống có sinh khối cao để phục vụ
chăn nuôi, mở rộng diện tích trồng tập trung tại các vùng sản xuất nông
nghiệp gắn với chế biến, đẩy mạnh công nghệ chế biến các sản phẩm từ khoai


3
lang đang được các nhà nghiên cứu quan tâm và là yêu cầu cấp thiết của sản
xuất.
Xuất phát từ thực tiễn sản xuất nhằm cải tiến sự thoái hóa giống nhanh
chóng ảnh hưởng đến năng suất, chất lượng cây khoai lang, đồng thời đưa ra
những nghiên cứu ban đầu phục vụ cho các công tác giống sau này, chúng tôi
tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng quy trình nhân giống khoai lang tím
Nhật (Beniazuma) nhập nội bằng phương pháp nuôi cấy mô in vitro”
2. Mục đích nghiên cứu của đề tài
Bằng phương pháp nuôi cấy mô xây dựng quy trình nhân giống khoai
lang tím Nhật nhập nội, tạo ra cây giống có chất lượng cao đưa vào sản xuất.
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
- Kết quả nghiên cứu sẽ đưa ra được một quy trình nhân giống cây khoai
lang Nhật bằng phương pháp in vitro. Đánh giá được tác động của một số chất
điều tiết sinh trưởng trong nhân giống khoai lang.

nhiệt đới và ôn đới ấm với lượng nước đủ để hỗ trợ sự phát triển của nó [8].
1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây khoai lang
1.1.2.1. Đặc điểm phân loại
Theo hệ thống phân loại thực vật của Linnea thì khoai lang thuộc cây hai
lá mầm Magnoliopsida, bộ cà Solanales, họ bìm bìm Convolvovulaceae, thuộc
chi Ipomoea. Trong chi Ipomoea có khoảng 500 loài chia thành 13 phân chi,
khoai lang được xếp trong phân chi Batatas [8].


6
1.1.2.2. Đặc điểm hình thái
Khoai lang là loài cây thân bò sống lâu năm, bộ phận sử dụng chủ yếu là
rễ củ phình to, có thể ăn lá và thân non.
- Thân: Có thể là dạng bò hay đứng thẳng, nửa đứng nửa bò. Trên thân
khoai lang một số giống có lông tơ. Thân có nhiều loại màu sắc khác nhau
như tím, xanh, đỏ… và có nhiều lông, các giống tốt cho mục đích lấy củ
thường có đốt ngắn và to. Trên mỗi đốt thân có các rễ bất định mọc ra. Vì vậy,
khoai lang chủ yếu được trồng bằng đoạn thân [8].
- Lá: Gồm cuống lá và phiến lá (gân và thịt lá). Lá đơn, mọc cách,
mỗi mắt trên thân mọc một lá. Lá có cuống dài 6 – 20 cm, có lợi cho việc
sử dụng ánh sáng. Lá khoai lang có dạng hình tim hoặc xẻ thùy [7]. Màu
sắc lá thay đổi từ màu xanh đến màu xanh tím, tím. Sự sinh trưởng của lá
ảnh hưởng lớn đến năng suất. Chỉ số diện tích lá 4 - 4,5 giúp hiệu suất
quang hợp cao nhất [6].


7
Hình 1.1. Cây khoai lang và các bộ phận
- Rễ và rễ củ: Rễ khoai lang mọc ở các mắt đốt. Có ba loại rễ là rễ con, rễ
dày hay còn gọi là rễ củ và rễ đực. Rễ củ quan trọng nhất, quyết định năng

Ngày dài và đêm ngắn sẽ thúc đẩy sinh trưởng dây lá hơn là củ và ngược lại.
Ở Việt Nam khoai lang trồng vào mùa khô, các tỉnh duyên hải miền Trung và
đồng bằng sông Cửu Long có điều kiện ánh sáng tốt, thâm canh cao và đủ ẩm,
khoai dễ đạt năng suất cao [4].
- Nước: Theo Miller, trong thời kỳ phát triển dây lá mà thiếu nước năng
suất sẽ giảm, trong 40 ngày đầu của quá trình sinh trưởng khoai lang cần
nhiều nước nhất. Khi củ phình to, cây cần nước, độ ẩm thích hợp 65 – 80%. Ở
nước ta khả năng cung cấp nước cho khoai lang là khác nhau với các mùa vụ
khác nhau. Điều kiện ngày ngắn đêm mưa hay mưa phùn vụ xuân miền Bắc
khoai sinh trưởng thân lá tốt hơn củ. Vụ khoai mùa cho năng suất và phẩm
chất củ cao hơn vì khoai trồng vào cuối mùa mưa thu hoạch vào đầu mùa khô,
độ ẩm thích hợp cho khoai lấy củ. Các tỉnh Bắc Trung Bộ cũng có mùa vụ sản
xuất khoai lang phần lớn tương tự như vùng đồng bằng Bắc Bộ. Miền Nam
khoai lang được trồng chủ yếu trong vụ Đông Xuân khi nước lụt đã rút [5].
- Đất đai: Khoai lang dễ tính không kén đất lắm, có tính thích ứng rộng
với tất cả các loại đất không ngập nước. Tuy nhiên, khoai lang sinh trưởng và
phát triển tốt nhất trên đất tơi xốp và nhẹ, tầng đất mặt sâu, thích hợp nhất là
đất cát pha. Trồng khoai lang nhất thiết phải có luống, đối với trồng lấy củ
luống phải cao rộng. Khoai lang thích cọ xát cơ giới, thích đất có kết cấu [7].
Khoai lang cũng có rất ít kẻ thù tự nhiên nên thuốc phòng trừ dịch hại ít
khi phải dùng tới. Do thân phát triển nhanh che lấp và kìm hãm sự phát triển
của cỏ dại nên việc diệt trừ cỏ cũng đỡ tốn thời gian hơn. Trong khu vực nhiệt


9
đới, khoai lang có thể để ở ngoài đồng và thu hoạch khi cần thiết còn tại khu
vực ôn đới thì nó được thu hoạch khi sương giá bắt đầu.


10

phòng chữa bệnh thận, táo bón đã được dùng từ lâu trong dân gian, có nơi gọi
nó là “Sâm Nam” [28].
Theo Đông Y, khoai lang có nhiều tên gọi như Cam thử, Phiên chử. Củ
khoai lang tính bình, vị ngọt, vào hai kinh tỳ và thận. Có tác dụng bồi bổ cơ
thể, ích khí, cường thận, kiện vị, tiêu viêm, thanh can, lợi mật, sáng mắt, chữa
vàng da, ung nhọt, viêm tuyến vú, phụ nữ kinh nguyệt không đều, trẻ em cam
tích, lỵ. Rau lang bổ hư tổn, ích khí lực, kiện tỳ vị, tư thận âm. Kiêng kị với
các trường hợp thấp trệ, tiêu chảy, viêm dạ dày đa toan, đường huyết thấp.
Khoai lang đỏ vàng có tính chất bổ nhiều hơn công, còn khoai lang trắng thì
công nhiều hơn bổ. Đặc điểm này phần nào đã được chứng minh qua thành
phần hóa học của chúng [28].
1.1.3.2. Giá trị kinh tế và khả năng phát triển cây khoai lang ở nước ta
Ngày nay khi nền công nghiệp chế biến phát triển với rất nhiều các sản
phẩm có giá trị sử dụng và tính tiện ích cao thì những nguồn nguyên liệu như
khoai lang là vô cùng quan trọng.
Từ củ khoai lang người ta đã cho ra nhiều sản phẩm như bột khoai để
làm bánh, mứt ..., rượu Sochu. Khoai lang còn là nguyên liệu chế biến tinh
bột, cồn, nước giải khát, mì, miến, phụ gia dược phẩm, màng phủ sinh học
[29]. Tại Nam Mỹ, nước lấy từ khoai lang đỏ trộn lẫn với nước chanh để làm
một loại thuốc nhuộm vải bằng cách thay đổi tỉ lệ thành phần của các loại
nước này mà người ta thu được các tông màu từ hồng tới tía hay đen [29].
Khoai lang là cây rau lương thực được trồng trên nhiều chân đất và dễ
thích nghi với điều kiện thời tiết khí hậu từ Bắc vào Nam. Đẩy mạnh phát
triển khoai lang có mấy tác dụng sau:
- Góp phần giải quyết vững chắc vấn đề lương thực cho con người do
có khả năng cho năng suất cao tới 30 tấn/ha khoai tươi.


12
- Tạo điều kiện thuận lợi giải quyết thức ăn cho gia súc, đẩy mạnh phát

thì nó được thu hoạch sớm trước khi sương giá bắt đầu.
1.2. Nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng trong tạo giống cây trồng
1.2.1. Khái niệm và cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.1.1. Khái niệm
Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật (NCMTB) hay nhân giống in
vitro đều là thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật
(tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng
thích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng
thực vật trong điều kiện vô trùng (Bùi Văn Thế Vinh, 2009).
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật nói chung và kĩ thuật nhân giống
vô tính in vitro nói riêng đều dựa vào cơ sở khoa học là tính toàn năng, sự
phân hoá và phản phân hoá của tế bào.
1.2.1.2. Cơ sở khoa học
- Tính toàn năng của tế bào
Theo Haberland (1902) mỗi một tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa
bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh.
Theo quan điểm sinh học hiện đại thì mỗi một tế bào đã chuyên hoá đều
chứa một lượng thông tin di truyền (bộ ADN) tương đương với lượng thông
tin di truyền của một cơ thể trưởng thành. Vì vậy, trong điều kiện nhất định
một tế bào bất kì đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Đặc tính
đó của tế bào gọi là tính toàn năng của tế bào.
Quá trình phát sinh hình thái trong NCM-TB thực chất là kết quả của sự
phân hoá và phản phân hoá .
- Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào


14
Cơ thể sinh vật trưởng thành bao gồm nhiều cơ quan có chức năng khác
nhau được hình thành từ nhiều loại tế bào. Tất cả các tế bào đó đều bắt nguồn
từ một tế bào ban đầu (tế bào hợp tử).

Bảng 1.1. Các mốc quan trọng trong lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật
Năm

Sự kiện
Haberlandt lần đầu tiên thực hiện nuôi cấy mô tế bào thực vật,

1902

ông nhận thấy có sự ảnh hưởng của muối khoáng tới sự chuyển
hóa tế bào.
Kotte và Robins nuôi cấy đỉnh sinh trưởng của rễ một cây hòa

1922

thảo và nhận thấy sự ảnh hưởng của khoáng và glucose. Tuy
nhiên, sự sinh trưởng ngừng lại sau đó dù đã được cấy chuyền.
White nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua trong thời gian vô
hạn trên môi trường chứa khoáng, glucose và dịch chiết nấm

1934

men. Sau đó, phát hiện ra sự ảnh hưởng của các vitamin nhóm
B (B1, B6) và acid nicotinic và sử dụng để thay thế cho dịch

1938
1939

1948

1954

Bergman tiến hành thu tế bào đơn bằng lọc đơn giản và đưa ra
kỹ thuật gieo tế bào đơn.
Cooking tạo ra các tế bào trần bằng enzym cellulase.
Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy và môi

1962

1966

1970

1980 –
1992

trường của họ được dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều
loại cây khác nhau cây khác nhau.
Guha và Maheswari công bố nuôi cấy thành công túi phấn của
cà độc dược và tạo thành các cây đơn bội.
Nagata và Takebe tái tạo thành công vách tế bào trần cây thuốc
lá và mở rộng ra khả năng lai các giống khác nhau của cùng
một loài thực vật và tái sinh cây mới bằng các kỹ thuật dung
hợp tế bào trần.
Sử dụng kỹ thuật gen vào việc nghiên cứu và lai tạo nhiều loại
thực vật khác nhau.

Và kết quả cho đến nay, các kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật vẫn
đang phát triển và được áp dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân
giống cây trồng; sản xuất các sản phẩm thứ cấp có hoạt tính sinh học nhằm
đáp ứng một phần tương đối lớn cho nhu cầu nhiều mặt của con người. Sự
phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật vẫn đang tiếp tục hứa hẹn