ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
VI THỊ NHUNG

Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH VÀ RA RỄ CHỒI
CHUỐI TIÊU TỪ NGUỒN NHẬP NỘI BẰNG PHƯƠNG PHÁP
NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo: Chính quy
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Khoa: Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm
Khóa học: 2010-2014


1. PGS.TS. Ngô Xuân Bình
Khoa CNSH – CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
2. ThS. Lê Thị Hảo
Bộ môn Công nghệ tế bào, Viện Khoa học Sự Sống

Thái Nguyên, 2014 LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian vừa qua được sự nhất trí của nhà trường và quý thầy cô
trong khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, em đã hoàn thành
đề tài tốt nghiệp: “Nghiên cứu khả năng nhân nhanh và ra rễ chồi chuối
tiêu từ nguồn nhập nội bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào”.
Để đạt được kết quả như ngày hôm nay em xin chân thành cảm ơn Ban
giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa cùng các thầy cô giáo trong bộ
môn và các thầy cô Bộ môn Công nghệ tế bào đã tạo điều kiện giúp đỡ em
trong suốt thời gian qua.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS. Ngô Xuân
Bình và Th.S Lê Thị Hảo đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong thời gian
thực hiện đề tài.
Em xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, đến những người thân đã
luôn động viên và giúp đỡ tạo điều kiện cho em về cả vật chất lẫn tinh thần
trong thời gian qua. Cảm ơn tập thể 42 CNSH, những người bạn đã cùng học

chuối tiêu nhập nội 29 DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG KHÓA LUẬN

Trang
Hình 2.1. Quá trình phân hóa tế bào 7
Hình 2.2. Quá trình phản phân hóa tế bào 8
Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu 17
Hình 4.1. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi
chuối tiêu nhập nội 24
Hình 4.2. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh
chồi chuối tiêu nhập nội 25
Hình 4.3. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của sự kết hợp BAP và IAA đến khả
năng nhân nhanh chồi chuối tiêu nhập nội 26

NAA : Naphthaleneacetic acid
IBA : Indole-3-butyric acid
GA3 : Gibberellin MỤC LỤC

Trang
PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích của đề tài 2
1.3. Yêu cầu của đề tài 2
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Giới thiệu chung về cây chuối 3

4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng
đến khả năng ra rễ giống chuối tiêu nhập nội 27
4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây chuối
tiêu nhập nội nuôi cấy mô ngoài vườn ươm 30
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32
5.1. Kết luận 32
5.2. Kiến nghị 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO 33
I. Tài liệu tiếng Việt 33
II. Tài liệu tiếng Anh 35

1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Cây chuối có tên khoa học là Musa Paradisiaca L., thuộc họ chuối
Musacae [5]. Chúng gồm những cây thân thảo lớn có rễ, sống lâu năm, lá
mọc xoắn ốc có


phương pháp này để nhân nhanh giống chuối tiêu mới từ nguồn nhập nội là
một phương pháp có ý nghĩa quan trọng cho công tác giống cây trồng, mang
lại hiệu quả kinh tế cao. Nhằm đáp ứng nhu cầu thực tiễn trên, chúng tôi tiến
hành đề tài:“Nghiên cứu khả năng nhân nhanh và ra rễ chồi chuối tiêu từ
nguồn nhập nội bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào”.
2

1.2. Mục đích của đề tài
Nghiên cứu khả năng nhân nhanh và ra rễ chồi chuối tiêu từ nguồn
nhập nội bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào.
1.3. Yêu cầu của đề tài
Xác định được ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến
khả năng nhân nhanh chồi chuối tiêu từ nguồn nhập nội.
Xác định được ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến
khả năng ra rễ chồi chuối tiêu từ nguồn nhập nội.
Xác định được ảnh hưởng của một số giá thể đến sinh trưởng, phát
triển của cây chuối tiêu nhập nội giai đoạn sau nuôi cấy mô ở ngoài vườn ươm.
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
- Ý nghĩa khoa học
+ Sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào tìm được môi trường và
điều kiện thích hợp nhất cho phát triển giống chuối.
+ Kết quả nghiên cứu đưa ra một số kỹ thuật vi nhân giống cây chuối
tiêu nhập nội bằng phương pháp in vitro. Từ đó, đánh giá được tác động của
một số chất kích thích sinh trưởng trong nhân giống cây chuối tiêu mới.
+ Bổ sung nguồn tài liệu tham khảo phục vụ nghiên cứu, giảng dạy và
sản xuất giống chuối tiêu mới thương phẩm có năng suất cao.
- Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu góp phần hoàn thiện quy trình kỹ thuật nhân giống
cây chuối tiêu mới nhập nội nhằm cung cấp giống với số lượng lớn, chất
lượng đảm bảo, đồng thời giữ được đặc tính di truyền của cây chọn lọc.

không chỉ ở nơi phát sinh nguồn

gốc mà còn ở khu vực Nam Mỹ, Đông và
Tây Phi [4].
2.1.2. Phân loại
Theo phân loại của Võ văn Chi (1978) [5] các loài chuối thuộc:
Ngành ngọc Lan (Mangolophya),
Lớp hành (Liliopsida),
Phân lớp hành (Lilidae),
Bộ gừng (Zingibereles),
Họ chuối (Musacea).
Họ chuối gồm 2 chi với 70 loài, trong đó chi Ensete gồm 10 loài, phân
bố chủ yếu ở vùng Châu Phi; chi Musa gồm 60 loài phân bố ở các vùng
nhiệt đới.

2.1.3. Đặc điểm hình thái
- Rễ
Rễ chùm, có 2 loại là rễ ngang và rễ thẳng.
Rễ ngang: Mọc xung quanh củ chuối và phân bố ở lớp đất mặt từ 0 -
30cm, phần nhiều tập trung ở độ sâu 0,15cm, bề ngang rộng tới 2 - 3cm loại
rễ này sinh trưởng khỏe, phân bố rộng, đó là loại rễ quan trọng nhất để hút
nước và dinh dưỡng nuôi cây.
4

Rễ thẳng: Mọc ở phía dưới củ chuối, ăn sâu 1 - 1,5cm, tác dụng chủ
yếu giữ cây đứng vững. Rễ chuối chứa nhiều nước, giòn, mềm, dễ gãy, sức
chịu hạn, chịu úng đều kém so với nhiều loại cây ăn trái khác [7], [20].
Nhiệt độ tốt nhất cho rễ sinh trưởng ở ban ngày là 25°C - 33°C, ban
đêm là 18°C - 26°C [7].
- Thân chuối

triển, dài bằng nhị cái. Loại hoa đực không thể hình thành trái được sau này
sẽ khô đi và rụng dần [20].
- Quả chuối
Cây chuối cho quả ăn là chuối tam bội nên không có hạt. Có loại chuối
hột là chuối nhị bội 2n và chuối tứ bội 4n. Đối với cây chuối cho quả ăn tam
bội, muốn có hạt thì phải lai giữa các dạng đã lưỡng bội hóa. Bằng cách này,
nhìn chung hạt chuối nảy mầm thường yếu và hạt dễ mất sức nảy mầm nên
phải nuôi cấy trong môi trường nhân tạo [7].
2.1.4. Giá trị của cây chuối
- Giá trị dinh dưỡng
Chuối là một trong 5 loại quả trao đổi chủ yếu trên thị trường thế giới,
bên cạnh giá trị là loại quả cho khối lượng sản phẩm lớn, chuối còn có hàm
lượng dinh dưỡng khá cao, tại một số nước Châu Á, Châu Phi, chuối là loại
lương thực chủ yếu, được sử dụng như khoai tây ở các nước có khí hậu ôn
đới [15].
Trong quả chuối có một lượng vitamin khá lớn, đặc biệt là các vitamin
nhóm A và C. Tuỳ thuộc vào giống, hàm lượng vitamin có thể thay đổi, các
giống chuối ăn được thường giàu vitamin C và B6, còn các giống chuối trong
nhóm chuối nấu lại giàu vitamin A. Nói chung, hàm lượng vitamin trong
chuối phong phú và cao hơn một số loại quả khác như cam, táo…
Tác giả Champion J. cho rằng quả chuối có giá trị dinh dưỡng cao, thể
hiện khi ăn 100g thịt quả chuối cho mức năng lượng 110 - 120 calo. Trong khi
đó, 100g táo chỉ cho mức năng lượng 64 calo, 100g cam cho 52 calo, 100g
đào cho 45 calo… Mặt khác, các thành phần dinh dưỡng trong quả chuối được
cơ thể hấp thụ nhanh. Vì vậy, chuối được coi là loại quả lý tưởng cho người
già, sức khỏe yếu, suy dinh dưỡng, mệt mỏi… Ngoài ra, quả chuối cũng có vị
trí đặc biệt trong khẩu phần ăn giảm mỡ, Cholesterol và muối Natri… [4], [5].
Đặc biệt trong chuối có nhiều Pectin, là 1 glucid không có giá trị về
mặt năng lượng nhưng là chất giúp cho sự tiêu hóa hấp thu tốt, chống nhiễm
trùng đường ruột. Chuối cung cấp nhiều năng lượng nhất vì chuối chứa nhiều

callus, nuôi
cấy

phôi,
nuôi cấy rễ tơ, nuôi cấy tế bào trần… con người đã
thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh
hơn,
gấp nhiều lần tốc độ vốn có trong tự
nhiên. Điều này sẽ góp phần tạo ra hàng loạt các cá thể
mới
giữ nguyên các
tính trạng di truyền của cơ thể mẹ và rút ngắn thời gian để đưa một giống
mới
và
sản xuất với quy mô lớn
[
21
].

7

2.2.2. Cơ sở của nuôi cấy mô tế bào thực vật
- Tính toàn năng của tế bào thực vật:
Năm 1902, Nhà Sinh lý thực vật học người Đức Haberlandt, đã tiến
hành nuôi cấy các tế bào thực vật để chứng minh tế bào là toàn năng.
Haberlandt cho rằng mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều có khả năng
tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Ông nhận thấy, mỗi tế
bào của cơ thể đa bào đều phát sinh từ hợp bào thông qua quá trình phân bào
nguyên nhiễm. Điều đó có nghĩa là mỗi tế bào của một sinh vật sẽ chứa toàn
bộ thông tin di truyền cần thiết của một cơ thể hoàn chỉnh. Khi gặp điều kiện

8

trường thích hợp, chúng lại quay trở lại dạng tế bào phôi sinh ban đầu lại có
khả năng phân chia mạnh mẽ và phân hoá để tái sinh cây hoàn chỉnh. Quá
trình này gọi là phản phân hoá.
Hình 2.2. Quá trình phản phân hóa tế bào
Về bản chất sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá,
phân hoá gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có
một số gen được hoạt hoá (mà trước đây bị ức chế) để cho biểu hiện trạng thái
mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một
chương trình đã được mã hoá trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào.
Mặt khác, khi tế bào nằm trong khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các
tế bào xung quanh. Khi tách riêng tế bào tạo điều kiện thuận lợi cho các gen
được hoạt hoá [22].
2.2.3. Các nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống cây chuối tiêu
nhập nội
- Điều kiện vô trùng
Điều kiện vô trùng là yêu cầu quan trọng nhất quyết định trước tiên đến
sự thành bại của việc nuôi cấy. Toàn bộ quá trình nuôi cấy in vitro cần đảm bảo
điều kiện vô trùng tuyệt đối. Vô trùng bao gồm: Vô trùng phòng nuôi cấy, vô
trùng dụng cụ và môi trường, vô trùng mẫu cấy [2], [17], [14].
Buồng nuôi cấy: Là buồng đặt các mẫu nuôi cấy. Buồng này cần đảm
bảo các điều kiện: Nhiệt độ 25-28
o

(1962); Knop (1974) … [23].
* Thành phần vô cơ
Thành phần vô cơ bao gồm các muối khoáng đa lượng và vi lượng.
Thành phần muối khoáng đa lượng: Các nguyên tố cần phải cung cấp là
nitơ, phospho, kali và sắt, lưu huỳnh, magie, với hàm lượng thay đổi tuỳ loại
môi trường và đối tượng nuôi cấy [28].
Các loại muối khoáng vi lượng: Là những nguyên tố thường được sử
dụng ở hàm lượng thấp hơn 30mg/l dung dịch nhưng rất nhiều nguyên tố vi
lượng được chứng minh là không thể thiếu đối với sự phát triển của mô: Fe,
Cu, Zn, Mn, Mo, I, Bo, Co. Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong
hoạt động của enzym, chúng được sử dụng ở hàm lượng thấp hơn nhiều so
với các chất đa lượng [28].
* Thành phần hữu cơ
Các vitamin: Ảnh hưởng của các vitamin đến sự phát triển của tế bào
nuôi cấy in vitro ở các loài khác nhau là khác nhau.
10

Hầu hết tế bào nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại
vitamin cơ bản nhưng với số lượng dưới mức yêu cầu. Để mô có thể sinh
trưởng, tốt nhất phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin
và amino axít. Trong các loại vitamin, B1 được xem là vitamin quan trọng
nhất cho sự phát triển của thực vật. Axit nicotinic (B3) và pyridoxune (B6)
cũng có thể được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng cường sức sống
cho mô.
Các thành phần hữu cơ phức hợp:
Cazein thủy phân (CH, casein hydrolysate) có chứa nhiều aminoacid.
Cazein thủy phân có chứa khoảng 18-20 aminoaxit. Hàm lượng sử dụng
cazein thủy phân trong nuôi cấy là 0,05-0,1% (W/v).
Nước dừa (CM, coconut milk): Là nội nhũ lỏng cung cấp các chất
dinh dưỡng nuôi phôi dừa. Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật thường sử

nhu cầu về thời gian chiếu sáng, cường độ và ánh sáng khác nhau. Thời gian
chiếu sáng với đa số các loài cây thích hợp là 12-18h/ngày.
Cường độ ánh sáng: Là yếu tố quan trọng tác động đến quá trình phát
sinh hình thái của mô nuôi cấy, với những cường độ ánh sáng khác nhau. Để
kích thích mô nuôi cấy tạo mô sẹo có thể chiếu sáng hoặc không cần chiếu
sáng (để trong tối), để mô sẹo sinh trưởng mạnh có thể chiếu sáng thấp.
PH của môi trường: pH của đa số các môi trường nuôi cấy được điều
chỉnh trong phạm vi 5,5-6,0. pH < 5,5 làm cho agar khó chuyển sang trạng
thái gel, còn pH > 6,0 agar có thể rất cứng [22].
- Các chất điều tiết sinh trưởng
+ Nhóm các auxin
Môi trường nuôi cấy được bổ sung các auxin khác nhau như: IAA,
NAA, IBA, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) và naphthoxyacetic acid.
IAA là auxin tự nhiên có trong mô thực vật; còn lại NAA, IBA, 2,4-D là các
auxin nhân tạo, thường thì các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn vì do
đặc điểm phân tử của chúng nên các enzyme oxy hóa auxin (auxin-oxydase)
không có tác dụng. Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế
bào. Các hormone thuộc nhóm này có các hoạt tính như: tăng trưởng chiều
dài thân, lóng (gióng), tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ, và
phân hóa mạch dẫn. Nói chung, các auxin được hòa tan hoặc trong ethanol
hoặc trong NaOH loãng [18].
Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng
thường xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Hàm lượng auxin sử dụng
trong môi trường nuôi cấy thường từ 0.001 - 10mg/l [23].
Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trường dinh
dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều
12

hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được phối hợp sử dụng với các
cytokinin [18].

lây nhiễm qua nguồn đất (tuyến trùng). Vì vậy, tiết kiệm được chi phí hóa
chất cho xử lý đất.
13

- Cây nuôi cấy mô có thể trồng một vụ với mức độ thâm canh cao, thời
gian sinh trưởng ngắn, có thể điều khiển được thời gian thu hoạch.
- Tỷ lệ cây sống cao trên điều kiện đồng ruộng (>98%), khả năng sinh
trưởng nhanh hơn cây có nguồn gốc từ chồi nách.
- Cây giống in vitro phát triển đồng đều, ra hoa đồng loạt và thời gian
thu hoạch ngắn.
- So với cây giống từ chồi nách, cây nuôi cấy mô có giá thành rẻ, dễ
vận chuyển, dễ nhân giống.
- Tiện lợi cho việc trao đổi nguồn gen quốc tế.
Tại Viện nghiên cứu chuối

Đài Loan đã ứng dụng kỹ thuật nuôi
cấy mô chuối trên quy mô lớn để sản

xuất cây thương mại từ năm 1983.
Sau 10 năm đã có khoảng 15 triệu cây

được sản xuất bằng phương pháp
nuôi cấy in vitro cung cấp cho sản xuất.

Cũng nhờ ứng dụng công nghệ
nuôi cấy mô, một lượng rất lớn cây giống sạch

các bệnh nguy hiểm như
BBTV (Banana Bunchy Top Virus), Fusarium wilt,


2.3.2. Tình hình nghiên cứu biện pháp kỹ thuật nhân giống chuối ở
Việt Nam
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về nhân giống chuối trước đây chỉ chú
trọng các biện pháp kỹ thuật nhân bằng củ và tách chồi. Những kỹ thuật này
hiện còn được áp dụng khá phổ biến ở nhiều vùng miền và nhất là quy mô
sản xuất nhỏ.
Quy trình nhân giống chuối in vitro đầu tiên ở nước ta (Trần

Văn
Minh và Nguyễn Văn Uyển, 1993) [13] bao gồm 6 công đoạn

chính sau:
đưa mẫu vào nuôi cấy; tạo và nhân nhanh chồi chuối; tạo rễ cây;

ươm
chuối trong vườn ươm; bầu chuối và trồng ra ruộng sản xuất.
Theo Trịnh Thị Nhất Chung ( 2010) sản xuất cây chuối thương

phẩm sạch bệnh gồm 4 bước: 1. Tái sinh chồi; 2. Nhân cụm chồi; 3. Tái
sinh

cây hoàn chỉnh; 4. Ra ngôi cây trong nhà lưới. Thời gian cần cho 3
giai đoạn

đầu (1,2,3) là 5-6 tháng, giai đoạn 4 cần 2 tháng, tổng cộng là 8
tháng. Đó là

khoảng thời gian nhà vườn trồng chuối thương phẩm dự tính
trong kế hoạch


3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Giống chuối tiêu nhập nội nuôi cấy mô đang
trong giai đoạn nhân nhanh tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Tế bào,
Viện Khoa học Sự sống, Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết
sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh và ra rễ chồi chuối tiêu nhập nội bằng
phương pháp nuôi cấy mô và nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá thể đến
sinh trưởng, phát triển của cây chuối tiêu nhập nội giai đoạn sau nuôi cấy mô
ở ngoài vườn ươm.
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm: Đề tài được tiến hành tại Bộ môn Công nghệ Tế bào thực
vật, Viện Khoa học Sự sống, Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
- Thời gian: Từ tháng 12 năm 2013 đến tháng 5 năm 2014.
3.3. Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh
trưởng đến khả năng nhân nhanh của chồi chuối tiêu nhập nội.
+ Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả
năng nhân nhanh chồi chuối tiêu nhập nội.
+ Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả
năng nhân nhanh chồi chuối tiêu nhập nội.
+ Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và
IAA đến khả năng nhân nhanh chồi chuối tiêu nhập nội.
- Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh
trưởng đến khả năng ra rễ chồi chuối tiêu nhập nội.
+ Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ
chồi chuối tiêu nhập nội.
+ Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của
chồi chuối tiêu nhập nội.
17


Giai đoạn
tái sinh chồi Giai đoạn tạo
vật liệu khởi đầu
Giai đoạn
nhân nhanh chồi
Mẫu: Chồi in vitro
Giai đoạn
tạo cây hoàn chỉnh
Mẫu: Chồi in vitro
Giai đoạn
vườn ươm
Mẫu: Cây con
in vitro
Cây chuối tiêu
nhập nội nuôi
cấy mô