TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
- - - -
TRẦN THỊ THẮM NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY
ĐINH LĂNG (Polyscias fruticosa (L.) Harms)
BẰNG KĨ THUẬT IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật
HÀ NỘI, 2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
- - - -
Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình
của cô Mai Thị Hồng – Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật, thầy Ong Xuân
Phong - Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ đã
giúp đỡ, đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành đề tài khóa luận, nhân đây tôi cũng
xin gửi lời cảm ơn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Trung tâm Hỗ trợ Nghiên
cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ, Phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật,
Phòng thí nghiệm Thực vật- trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi
về thiết bị, phương tiện để tôi có thể hoàn thành khóa luận này.
Cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong qua
trình học tập và hoàn thành đề tài.
Hà Nội,10 tháng 04 năm 2014
Sinh viên
TRẦN THỊ THẮM
ii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nghiên cứu trong khóa luận là trung thực và chưa được ai công bố.
Hà Nội,10 tháng 04 năm 2014
Sinh viên
TRẦN THỊ THẮM iii
1.2.3.1. Giai đoạn 1: Khử trùng mô cấy 8
1.2.3.2. Giai đoạn 2: Tái sinh mô nuôi cấy 8
1.2.3.3. Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi 8
1.2.3.4. Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh 9
1.2.3.5. Giai đoạn 5: Đưa cây ra đất 9
1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô 9
1.2.4.1. Mô nuôi cấy 9
1.2.4.2. Vô trùng trong nuôi cấy 10
1.2.4.3. Điều kiện nuôi cấy 11
1.2.4.4. Môi trường nuôi cấy 13
1.2.4.5. Vai trò của chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy 13
1.2.4.6. Ảnh hưởng của pH và Agar 15
1.3. Các nghiên cứu in vitro về cây Đinh lăng 16
1.3.1. Tạo cây con 16
1.3.2. Tạo phôi soma 16
1.3.3. Tạo sẹo và phát sinh phôi soma 16
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 18
2.2. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 18
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu 18
2.2.2. Trang thiết bị và dụng cụ 18
2.2.3. Môi trường nuôi cấy 20
2.2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro 21
2.3. Phương pháp nghiên cứu 21
2.3.1. Phương pháp khử trùng mẫu 21
2.3.2. Bố trí thí nghiệm 22
2.3.2.1. Thí nghiệm 1: Tạo vật liệu in vitro chồi đỉnh Đinh lăng. 23
v
2.3.2.2. Thí nghiệm 2: Nhân nhanh cây Đinh lăng bằng phương pháp tạo
Bảng 2.1. Các công thức thí nghiệm xác định hiệu quả của chất khử trùng. 23
Bảng 2.2. Công thức thí nghiệm xác định ảnh hưởng của BAP đến khả 24
Bảng 2.3: Ảnh hưởng của NAA đến tạo rễ cây Đinh lăng in vitro 25
Bảng 3.1 Hiệu quả chất khử trùng trên mẫu đỉnh sinh trưởng cây Đinh lăng 29
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân chồi cây Đinh lăng 33
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ ở cây Đinh lăng 36
Bảng 3.4 Hàm lượng diệp lục a, diệp lục b và tổng số (a+b) 39
vii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Cây Đinh lăng – Polyscias fruticosa (L.) Harms 3
Hình 3.1 Hiệu quả chất khử trùng trên mẫu đỉnh sinh trưởng cây Đinh lăng 30
Hình 3.2 Đỉnh sinh trưởng cây Đinh lăng. (Trái) mẫu in vitro vô trùng sau 5
ngày nuôi cấy, (Phải) mẫu in vitro bị nhiễm sau 5 ngày nuôi cấy. 31
Hình 3.3 Các bước đơn giản tạo vật liệu in vitro từ đỉnh sinh trưởng của cây
Đinh lăng 33
Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân chồi cây Đinh lăng 34
Hình 3.5 Chồi Đinh lăng sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung BAP 35
Hình 3.6 Tạo rễ cây Đinh lăng in vitro 37
Hình 3.7. Hình thái chồi ngọn cây Đinh lăng 38
Hình 3.8 (A) Lát cắt ngang chồi đỉnh Đinh lăng tự nhiên, (B) Cắt ngang chồi
đỉnh Đinh lăng in vitro. 38
Hình 3.9 (A) Lát cắt ngang cuống lá Đinh lăng tự nhiên; (B)Lát cắt ngang cuống
lá Đinh lăng in vitro 39
Hình a: Thao tác trong box cấy vô trùng 45
Hình b: Kiểm tra mẫu nuôi cấy trong phòng cây tại Trung tâm Hỗ trợ Nghiên
Cây Đinh lăng - Polyscias fruticosa (L.) Harms thuộc họ Nhân sâm hay
Ngũ gia bì (Araliaceae) [1], là cây thuốc được sử dụng nhiều trong y học dân
gian Việt Nam và Trung Quốc. Theo nhiều nghiên cứu, cây Đinh lăng có nhiều
tác dụng dược lí giống Nhân sâm, đặc biệt dược liệu từ cây Đinh lăng có tác
dụng tăng cường thể lực, tăng sức đề kháng và tăng khả năng thích nghi [2].
Các kết quả nghiên cứu trước đây cho thấy, trong Đinh lăng có chứa
alkaloid, saponin, acid amin, vitamin và trong Nhân sâm, Tam thất thì
saponin được coi là một trong những thành phần hóa học có tác dụng chính của
dược liệu. Đồng thời ở cây Đinh lăng, rễ là nơi có hàm lượng saponin cao nhất
và cũng thể hiện các tác dụng dược lý mạnh hơn so với các bộ phận khác (lá,
thân) [3], [4], [23].
Đinh lăng thể hiện nhiều ưu điểm như dễ trồng, dễ sử dụng, nhưng việc sử
dụng dược liệu hiện nay còn hạn chế do chưa được chú ý trồng trọt, khai thác,
bào chế. Mặt khác, Đinh lăng có nhiều loại khác nhau như: Đinh lăng lá nhỏ
(Polyscias fruticosa (L.) Harms), Đinh lăng lá tròn (Polyscias balfouriana),
Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei) [1]. Sự khác biệt về điều kiện dinh dưỡng
và địa lí có thể làm thay đổi hình thái và chất lượng của Đinh lăng.
Để góp phần việc đẩy mạnh việc sử dụng có hiệu quả nguồn dược liệu
trong nước, khai thác vốn quý của y học dân tộc, cụ thể là đối với cây Đinh lăng
nói riêng và các cây trong họ Nhân sâm nói chung. Một hướng nghiên cứu mới
đã và đang được quan tâm đó là áp dụng công nghệ sinh học thực vật để tạo
nguồn giống đồng nhất, năng suất cao, thời gian thu hoạch ngắn hơn so với
trồng ngoài tự nhiên.
Việc tạo ra cây Đinh lăng ổn định và đồng nhất là vấn đề cần thiết để
phục vụ cho nhu cầu trồng trọt và nghiên cứu khai thác, bào chế các sản phẩm
2
từ Đinh lăng. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu nhân
giống cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) bằng kĩ thuật in vitro.”
2. Mục đích nghiên cứu
Họ: Araliaceae (Nhân sâm hay Ngũ gia bì)
Loài: Polyscias fruticosa (L.) Harms (Đinh lăng, cây gỏi cá, Nam dương
lâm, ) [1].
1.1.2. Mô tả
Cây Đinh lăng - Polyscias
fruticosa (L.) Harms là cây bụi cao
0,5 – 2 m. Thân tròn sần sùi, không có
gai. Rễ phù như củ. Lá kép mọc cách,
có bẹ, phiến lá xẻ lông chim 2 – 3 lần,
dài 20 – 40 cm. Lá chét có cuống gầy
dài 3 -10 mm, phiến lá chét có răng
cưa không đều, chóp nhọn các đoạn
đều có cuống, lá có mùi thơm. Cuống
lá dài, tròn, màu xanh sậm, đáy cuống
phình to thành bẹ lá. Cụm hoa hình
thùy ngắn 7 - 18 mm ở ngọn, gồm
nhiều tán mang nhiều hoa nhỏ, màu
trắng xám. Tràng 5, nhị 5, bầu hạ 2 ngăn có dìa trắng nhạt. Quả hình trứng, dẹt,
dài 3 -4 mm, màu trắng bạc [1].
1.1.3. Nguồn gốc, phân bố
Cây Đinh lăng có nguồn gốc từ các đảo Thái Bình Dương. Cây phân bố ở
Malayxia, Indonexia, Lào, miền Nam Trung Quốc Ở Việt Nam, hiện có hơn
Hình 1.1: Cây Đinh lăng –
Polyscias fruticosa (L.) Harms [25]
4
10 loài Đinh lăng [1], được trồng làm cảnh ở khắp nơi hoặc trồng làm thuốc ở
quy mô nhỏ theo từng hộ gia đình, loài Đinh lăng được sử dụng làm thuốc phổ
biến nhất là Polyscias fruticosa (L.) Harms. Đây là loài có nhiều tác dụng dược
dụng kháng khuẩn mạnh và chống một số dạng ung thư [3].
1.1.5. Tác dụng dược lý của cây Đinh lăng
Qua nghiên cứu và thử nghiệm, Viện Y học quân sự đã tìm được từ cây
Đinh lăng những tính chất của Nhân sâm: Rễ Đinh lăng có tác dụng làm tăng
cường sức dẻo dai và sức đề kháng của cơ thể, chống hiện tượng mệt mỏi, giúp
ăn ngủ ngon, tăng khả năng lao động, lên cân và chống độc. Ngoài ra, theo Y
học cổ truyền, Hải Thượng Lãn Ông đã dùng rễ Đinh lăng sao vàng, sắc cho
5
phụ nữ uống sau khi đẻ để chống bệnh đau dạ con và làm tăng tiết sữa. Đinh
lăng còn được dùng chữa ban sởi, ho ra máu, kiết lỵ. Phối hợp với sữa ong chúa
là thuốc bổ rất tốt [23].
1.2. Sơ lược về nhân giống cây in vitro
1.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật
Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào in vitro là học
thuyết về tính toàn năng (totipotence) của tế bào. Theo Haberlandt G. (1902),
nhà thực vật học người Đức, tất cả các tế bào của cây đều mang toàn bộ lượng
thông tin di truyền của cơ thể, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có
khả năng tái sinh và phát triển thành cá thể hoàn chỉnh [5]. Thực tế đã chứng
minh được khả năng tái sinh của một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào
riêng rẽ. Hàng trăm loài cây trồng đã được nhân giống trên quy mô thương mại
bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành
cây với hệ số nhân giống vô cùng lớn [20].
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là kết quả
của quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào. Trong đó:
Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô
chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau.
Khi các tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng riêng biệt,
chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình mà trong trường hợp
cần thiết, ở điều kiện thích hợp chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và
- Hệ số nhân giống cực cao, rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản
xuất đại trà [8].
Về phương diện hệ số nhân giống, nhân giống in vitro là phương pháp
không gì có thể so sánh kịp, kể cả phương pháp nhân giống bằng hạt. Thí dụ:
Mai Thị Tân và cộng sự đã đạt được hệ số nhân 5
32
trong vòng một năm đối với
cây khoai tây bằng phương pháp này [9]. Đặc biệt, cây Cọ dầu thường phải mất
7
10 – 15 năm mới cho thu hoạch, việc chọn, tạo và nhân nhanh được một giống
mới rất khó khăn [5]. Bằng phương pháp nhân nhanh in vitro, người ta có thể
cung cấp được 500000 cây con giống hệt nhau trong vòng một năm [21].
1.2.2.2. Nhược điểm
Nhược điểm chính của phương pháp nuôi cấy in vitro là đòi hỏi trang thiết
bị đắt tiền và kĩ thuật cao nên chỉ có hiệu quả đối với những cây có giá trị cao
hoặc khó nhân giống bằng phương pháp khác [22]. Ngoài ra, phương pháp này
còn có những nhược điểm sau:
- Mặc dù số lượng cây giống thu được có thể rất cao nhưng cây non có
kích thước nhỏ, đòi hỏi phải có chế độ chăm sóc đặc biệt ở giai đoạn sau
ống nghiệm.
- Cây có thể có những đặc tính không mong muốn.
- Khả năng tạo đột biến tăng.
- Khả năng tái sinh có thể bị mất đi do cấy truyền callus, hay huyền phù tế
bào nhiều lần.
- Cây giống có thể bị nhiễm bệnh đồng loạt.
Tuy vậy phương pháp nhân giống in vitro ngày càng được sử dụng rộng rãi
để phục vụ những mục đích sau:
- Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu cho công tác
chọn giống.
1.2.3.3. Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi
Toàn bộ quá trình nhân giống in vitro xét cho cùng là nhằm mục đích tạo
ra hệ số nhân cao nhất. Chính vì vậy, giai đoạn này được xem là giai đoạn then
chốt của quá trình.
Để tăng hệ số nhân người ta thường phải đưa thêm vào môi trường dinh
dưỡng nhân tạo các chất điều hòa sinh trưởng (Auxin, Cytokinin, Gibberelin),
các chất bổ sung khác như nước dừa, nước chiết giấm men, dịch thủy phân
9
Casein kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp. Tùy thuộc vào
từng đối tượng nuôi cấy người ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình
thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay sự phát triển của chồi nách (vi giâm
cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính.
1.2.3.4. Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh
Khi đạt kích thước nhất định các chồi được chuyển từ môi trường ở giai
đoạn 3 sang môi trường tạo rễ. Thường sau từ 2 - 3 tuần, từ những chồi riêng lẻ
này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này, người ta
thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các Auxin, các chất IAA, IBA, α-
NAA và 2,4-D được sử dụng, nghiên cứu nhiều nhất.
1.2.3.5. Giai đoạn 5: Đưa cây ra đất
Ở giai đoạn này, đưa cây hoàn chỉnh (có đủ thân, rễ, lá) từ ống nghiệm ra
đất là bước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định
khả năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất.
Cây lấy ra từ ống nghiệm phải được rửa sạch agar bám trên bề mặt rễ, để
tránh sự xâm nhập của côn trùng và nấm mốc. Để đảm bảo cho cây có tỷ lệ
sống cao thì cần phải đưa cây ra vườn ươm, ươm trên các giá thể thích hợp từ
10 - 15 ngày, lúc này rễ mới sinh ra, lá non bắt đầu hình thành. Sau đó chuyển
cây ra đất với chế độ chăm sóc bình thường [7].
1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô
1.2.4.1. Mô nuôi cấy
với môi trường bên ngoài mà các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn, nấm.
Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng các chất hóa học có
hoạt tính diệt nấm, khuẩn. Hiệu lực diệt nấm, khuẩn của các chất này phụ thuộc
vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng trên bề mặt mô
cấy [13].
Street (1974), đưa ra khái niệm về nồng độ và thời gian sử dụng các chất
diệt nấm khuẩn để xử lý mô cấy như sau [13]:
11
Tác nhân vô
trùng
Nồng độ (%)
Thời gian xử
lý (phút)
Hiệu quả
Hypochlorite canxi
9 – 10
5 – 30
Rất tốt
Hypochlorite natri
2
5 – 30
Rất tốt
Hydroperoxid
(H
2
O
o
C [13].
Có nhiều đề nghị cho rằng nên tránh nhiệt độ cao, bởi vì nhiệt độ cao có thể làm
cho chức năng kích thích tạo chồi của Cytokinin giảm. Hầu hết, những thí
nghiệm nuôi cấy mô thực vật được thực hiện trong phòng thí nghiệm khống chế
nhiệt độ. Những người trồng cây công nghiệp cũng sử dụng nhiệt độ để duy trì
khả năng sinh trưởng khi yêu cầu nhiệt cho cây non còn thấp. Nuôi cấy ở ngăn
lạnh làm giảm sinh trưởng và làm giảm giá thành cần thiết do cấy truyền.
12
Ánh sáng:
Ảnh hưởng của ánh sáng có thể được chia ra trong sự tác động của cường
độ ánh sáng (bức xạ hoạt động quang hợp), thời gian chiếu sáng (quang chu kỳ)
và chất lượng ánh sáng đến sinh trưởng, phát triển của thực vật. Cường độ ánh
sáng là nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng đến khả năng nuôi cấy
in vitro ở những cây có diệp lục tố, mức cường độ ánh sáng điển hình cho vi
nhân giống là từ 40 – 80 μmol/m
2
/giây trong nuôi cấy vươn thân, nhưng cường
độ ánh sáng bên trong các bình nuôi cấy có thể thấp hơn nhiều.
Kiểu nút đậy kín có thể làm giảm sự truyền ánh sáng vào trong bình cấy,
các loài cây khác nhau thì yêu cầu mức độ ánh sáng khác nhau, biên độ ánh
sáng này rất thấp so với bức xạ bên ngoài và trong nhà kính (600 – 1200
μmol/m
2
/giây).
Chất lượng ánh sáng là chức năng của đèn chiếu sáng trong nuôi cấy và
kiểu bình cấy được sử dụng. Thông thường trong các phòng nuôi cấy mô sử
dụng đèn ánh sáng trắng hoặc ánh sáng trắng pha đỏ. Chất lượng ánh sáng cũng
- Môi trường giàu chất dinh dưỡng: MS (Murashige – Skoog).
1.2.4.5. Vai trò của chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy mô
Chất điều hoà sinh trưởng là những chất với liều lượng thấp hiệu ứng sinh
học cao, được tổng hợp tại một cơ quan và gây ảnh hưởng điều tiết đến các quá
trình sinh lý, trao đổi chất nào đó trong những cơ quan khác. Chất điều hoà sinh
trưởng là sản phẩm trao đổi chất bình thường của cơ thể thực vật. Nó đóng vai
trò chủ đạo trong quá trình sinh trưởng, phát triển và những quá trình sinh lý,
hoá sinh khác cũng như trong phản ứng thích nghi của thực vật đối với điều kiện
của môi trường [15].
14
Auxin:
Auxin hoạt hoá sự phân bào, sinh trưởng kéo dài, cần cho sự tạo mạch
dẫn và ra rễ, tăng trưởng của quả, tạo quả không hạt, kích thích sinh trưởng của
ống phấn [15].
Sự vận chuyển auxin có vai trò quan trọng trong sự tăng trưởng và phân
hoá, auxin giúp kéo dài và phân chia tế bào, các hiện tượng hướng động, ưu thế
ngọn, rụng, đậu, tăng trưởng và chín của quả….
Auxin kích thích mạnh sự kéo dài tế bào diệp tiêu. Sự kéo dài của tế bào
rễ cần những nồng độ auxin thấp hơn nhiều so với thân và chồi. Hiệu ứng auxin
giảm khi nồng độ auxin nhỏ hơn nồng độ tối ưu và trở nên độc ở các nồng độ
quá cao.
Tất cả cây trồng đều tổng hợp được chất auxin (dạng tổng hợp) tuỳ theo
giai đoạn phát triển của chúng. Ngay từ khi chất auxin được nhận dạng, có nhiều
chất có cấu trúc gần nhau và giống nhau về mặt hoá học đã được thí nghiệm.
Một vài chất này đã thể hiện các đặc tính tương tự như các đặc tính của
chất auxin, nhưng thường với các liều lượng thấp hơn, hơn nữa chúng ít bị kiểm
màu khác.
- Hấp thụ các hợp chất hữu cơ khác (auxin, cytokinin, ethylene, vitamin,
chelate Fe và Zn…).
- Thúc đẩy sự tạo phôi soma.
- Ổn định độ pH.
1.2.4.6. Ảnh hưởng của pH và Agar
pH của môi trường nuôi cấy thường ở khoảng 5,8 – 6 thì tốt trong nuôi
cấy mô. Nếu pH môi trường thấp hơn 4,5 hoặc cao hơn 7 đều ức chế sự phát
triển của mô [10], [14].
Agar xuất phát từ rong biển, được sử dụng như là chất keo trong hầu hết
môi trường dinh dưỡng. Agar là polysaccharide, trọng lượng phân tử cao có khả
năng làm đông môi trường. Agar hoà tan hình thành chất keo kết dính với nước
Copyright: Tài liệu đại học ©