TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
- -  - -

HOÀNG THỊ HUYỀN

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH PHÁTSINH
HÌNH THÁI MÔ SẸO CỦACÂY ĐINH LĂNG
(Polyscias fruticosa (L.) Harms)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
TH.S LA VIỆT HỒNG

HÀ NỘI, 2015

i


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Th.s La Việt Hồng – Khoa Sinh
KTNN Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn tới các Ban Giám hiệu trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ
nhiệm khoa Sinh – KTNN trƣờng ĐHSP Hà Nội đã tạo mọi điều kiện để tôi
hoàn thành khóa luận này.
Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận đƣợc sự giúp đỡ tận tình
của cô Mai Thị Hồng – Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật, thầy Ong Xuân
Phong - Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ

HOÀNG THỊ HUYỀN

3


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1.Cây Đinh lăng –Polyscias fruticosa (L.) Harms [18] ........... 3
Hình 3.1.1. Hình thái lá Đinh lăng ở các công thức khác nhau sau 2
tuần .................................................................................................. 32
Hình 3.1.2. Hình thái lá Đinh lăng ở các công thức khác nhau sau 4
tuần .................................................................................................. 34
Hình 3.1.3. Hình thái lá Đinh lăng ở các công thức khác nhau sau 8
tuần .................................................................................................. 36
Hình 3.1.4. (a) Mô sẹo Đinh lăng ở các công thức sau 14 tuần ở các
công thức ......................................................................................... 37
Hình 3.1.4. (b) Hiệu quả các môi trƣờng tạo mô sẹo từ lá non và thân
cây Đinh lăng ................................................................................... 38
Hình 3.2. (a) giai đoạn phôi hình cầu ............................................... 40
Hình 3.2. (b) giai đoạn phôi hình tim ............................................... 41
Hình 3.2. (c) giai đoạn phôi “cá đuối” .............................................. 42
Hình 3.2. (d) giai đoạn phôi trƣởng thành ........................................ 44
Hình 3.2. Sự phát sinh hình thái từ mô sẹo lá cây Đinh lăng sau 7 tuần
ở các công thức: (e) CT T1, (f) CT T2, (g) CT T3, (h) CT T4 .......... 45
Hình 3.2. (i) hình thái chồi Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo ở công thức
CT4 sau 14 tuần ............................................................................... 46
Hình 3.3. (a) Chồi Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo trên môi trƣờng NAA
0,3 mg/l ............................................................................................ 48
Hình 3.3. (b) Chồi Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo trên môi trƣờng NAA
0,5 mg/l ............................................................................................ 48



2,4-Dichlorophenoxy acetic acid

GA3:

Gibbrellin

BAP:

6-Benzyl amino purin

MS:

Murashige và Skoog

Nxb:

Nhà xuất bản

Tp.HCM:

Thành phố Hồ Chí Minh

6


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................ 1

1.2.5.2. Giai đoạn 2 ...................................................................................... 16
1.2.5.3. Giai đoạn 3 ...................................................................................... 16
1.2.5.4. Giai đoạn 4 ...................................................................................... 17
1.2.5.5. Giai đoạn 5 ...................................................................................... 17
1.2.6. Các giai đoạn phát sinh phôi soma ...................................................... 18
1.2.7. Các nghiên cứu in vitro về cây Đinh lăng ........................................... 20
1.2.7.1. Tạo cây con ..................................................................................... 20
1.2.7.2. Tạo phôi soma ................................................................................. 21
1.2.7.3. Tạo mô sẹo và phát sinh phôi soma ................................................. 21
1.2.7.4. Nhân nhanh chóng phôi soma thứ cấp của cây Đinh lăng ................ 22
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .......................................... 24
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.......................................................... 24
2.2. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu ............................................................... 24
2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ......................................................................... 24
2.2.2. Trang thiết bị và dụng cụ .................................................................... 24
2.2.3. Môi trƣờng nuôi cấy ........................................................................... 25

8


2.2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro ................................................................. 26
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................... 26
2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu ................................................................................ 27
2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................... 27
2.3.2.1. Thí nghiệm 1: Tạo mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng ............ 27
2.3.2.2. Thí nghiệm 2: Quá trình phát sinh hình thái mô sẹo ở cây Đinh lăng
từ lá non và thân cây..................................................................................... 28
2.3.2.3. Thí nghiệm 3: Tạo rễ cây Đinh lăng tái sinh (Ảnh hƣởng của NAA
đến khả năng tạo rễ ở chồi tái sinh của cây Đinh lăng) ................................. 29
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 30

gia bì (Araliaceae) [4], các kết quả nghiên cứu cho thấy cây Đinh lăng có
nhiều tác dụng dƣợc lí giống Nhân sâm, và Tam thất nhƣ chứa saponin đƣợc
coi là một trong những thành phần hóa học có tác dụng chính của dƣợc liệu,
đồng thời ở cây Đinh lăng, rễ là nơi có hàm lƣợng saponin cao nhất và cũng
thể hiện các tác dụng dƣợc lý mạnh hơn so với các bộ phận khác (lá, thân) [8],
[1], [19]. Ngoài ra trong Đinh lăng chứa alkaloid, acid amin, vitamin,... đặc
biệt dƣợc liệu từ cây Đinh lăng có tác dụng tăng cƣờng thể lực, tăng sức đề
kháng và tăng khả năng thích nghi [3].
Đinh lăng có nhiều loại khác nhau nhƣ: Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias
fruticosa (L.) Harms), Đinh lăng lá tròn (Polyscias balfouriana), Đinh lăng
trổ (Polyscias guilfoylei)... [4]. Mặc dù dễ trồng, dễ sử dụng nhƣng sự khác
biệt về điều kiện dinh dƣỡng và địa lí có thể làm thay đổi hình thái và chất
lƣợng của Đinh lăng mặt khác việc sử dụng dƣợc liệu hiện nay còn hạn chế
do chƣa đƣợc chú ý trồng trọt, khai thác, bào chế.Để góp phần việc đẩy mạnh
việc sử dụng có hiệu quả nguồn dƣợc liệu trong nƣớc, khai thác vốn quý của y
học dân tộc, cụ thể là đối với cây Đinh lăng nói riêng và các cây trong họ
Nhân sâm nói chung. Một hƣớng nghiên cứu mới đã và đang đƣợc quan tâm
đó là áp dụng công nghệ sinh học thực vật để tạo nguồn giống đồng nhất,
năng suất cao, thời gian thu hoạch ngắn hơn so với trồng ngoài tự nhiên.
Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:“Nghiên cứu quá trình
phát sinh hình thái mô sẹo của cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.)
Harms)” là cần thiết để ứng dụng vào phục vụ cho nhu cầu trồng trọt, sản

1


xuất cây giống có hiệu quả cao, chất lƣợng tốt, góp phần nâng cao hiệu quả
nghiên cứu khai thác, bào chế các sản phẩm từ Đinh lăng.
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu hình thái đƣợc phát sinh từ mô sẹo của cây Đinh

có gai. Rễ phù nhƣ củ. Lá kép mọc
cách, có bẹ, phiến lá xẻ lông chim 2
– 3 lần, dài 20 – 40 cm. Lá chét có
cuống gầy dài 3 -10 mm, phiến lá
chét có răng cƣa không đều, chóp
nhọn các đoạn đều có cuống, lá có
mùi thơm. Cuống lá dài, tròn, màu
xanh sậm, đáy cuống phình to thành
bẹ lá. Cụm hoa hình thùy ngắn 7 -

Hình 1.1.Cây Đinh lăng –

18 mm ở ngọn, gồm nhiều tán mang

Polyscias fruticosa (L.) Harms [18]

nhiều hoa nhỏ, màu trắng xám. Tràng 5, nhị 5, bầu hạ 2 ngăn có dìa trắng
nhạt. Quả hình trứng, dẹt, dài 3 -4 mm, màu trắng bạc [4].

3


1.1.3. Nguồn gốc, phân bố
Cây Đinh lăng có nguồn gốc từ các đảo Thái Bình Dƣơng. Cây phân bố
ở Malayxia, Indonexia, Lào, miền Nam Trung Quốc,... Ở Việt Nam, hiện có
hơn 10 loài Đinh lăng [4], đƣợc trồng làm cảnh ở khắp nơi hoặc trồng làm
thuốc ở quy mô nhỏ theo từng hộ gia đình, loài Đinh lăng đƣợc sử dụng làm
thuốc phổ biến nhất là Polyscias fruticosa (L.) Harms. Đây là loài có nhiều
tác dụng dƣợc lý giống Nhân sâm [8].
1.1.4. Hợp chất tự nhiên trong cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa(L).

1.2. Nhân giống cây trồng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.1. Cơ sở khoa học
Haberlandt G. (1902) là ngƣời đầu tiên đề xƣớng ra phƣơng pháp nuôi
cấy tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn thế của tế bào. Theo ông mỗi
một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để
phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh[13]. Nhƣ vậy mỗi tế bào riêng rẽ của
một cơ thể đa bào đều chứa đầy đủ toàn bộ lƣợng thông tin di truyền cần thiết
của cả sinh vật đó và nếu gặp điều kiện thích hợp thì mỗi tế bào có thể phát
triển thành một cơ thể sinh vật hoàn chỉnh.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro)đƣợc thực hiện dựa trên tính toàn
năng của tế bào, đƣợc thể hiện khi nuôi cấy mô và các tế bào cách li trong
môi trƣờng thích hợp thì có khả năng phát triển thành cây hoàn chỉnh đặc
trƣng cho loài và ra hoa tạo quả bình thƣờng, do trong nhân tế bào có chứa bộ
AND(NST) hoàn chỉnh chứa toàn bộ thông tin di truyền cho một chu kì sống
hoàn chỉnh.
ADN→ARN→Protein→Tính trạng
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào in vitro là kết
quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào. Trong đó:

5


Tính phân hóa của tế bào là sự biến đổi của các tế bào phôi sinh thành
các tế bào của các mô chuyên hóa đảm nhận các chức năng khác nhau. Trong
cơ thể thực vật có khoảng 15 loại mô khác nhau đảm nhận các chức năng
khác nhau (mô giậu, mô dẫn, mô bì, mô khuyết,…) nhƣng chúng đều có
nguồn gốc từ tế bào phôi sinh đã trải qua giai đoạn phân hóa để hình thành
các mô riêng biệt.
Tính phản phân hóa của tế bào: các tế bào khi đã đƣợc phân hóa thành
các mô có chức năng riêng biệt, nhƣng trong những điều kiện nhất định chúng

của các loại cây trồng khác nhau.
- Bảo quản các tập đoàn gen, đặc biệt với các loài cây dễ bị nhiễm bệnh
trong điều kiện tự nhiên.
1.2.3. Ưu, nhược điểm của nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế
bào
1.2.3.1. Ưu điểm
Theo E.F.Gerge (1993) cho biết ƣu điểm của nhân giống in vitro
- Phƣơng pháp nhân giống in vitrocó khả năng hình thành một số lƣợng
lớn cây giống từ một mô, cơ quan với kích thƣớc nhỏ 0,1-10 mm.
- Hoàn toàn tiến hành trong điều kiện vô trùng nên cây giống tạo đƣợc
hoàn toàn sạch bệnh.
- Sử dụng vật liệu sạch virus và có khả năng nhân nhanh các giống sạch
bệnh.
- Hoàn toàn có khả năng điều chỉnh các tác nhân điều chỉnh khả năng tái
sinh của cây nhƣ thành phần ding dƣỡng, nhiệt độ, các chất điều tiết sinh
trƣởng,… theo ý muốn.
- Hệ số nhân giống cao, có khả năng sản xuất số lƣợng lớn cây giống
trong một thời gian ngắn. Hệ số nhân giống trong khoảng 36 đến 1012 cây
giống/năm.
- Có thể tiến hành quanh năm không chịu sự chi phối của các nhân tố
môi trƣờng.
7


- Cây giống in vitro nếu chua có nhu cầu sử dụng có thể bảo quản trong
một thời gian dài trong điều kiện in vitro.
1.2.3.2. Nhược điểm
- Mặc dù có hệ số nhân giống cao nhƣng cây giống có kích thƣớc nhỏ
khó trồng trong điều kiện tự nhiên, đôi khi xuất hiện các cây không mong
muốn (do biến dị, mọng nƣớc).

1.2.4.2. Phòng nuôi cấy mô
Các thiết bị quan trọng nhất của phòng nuôi cấy mô gồm nồi hấp vô
trùng, dụng cụ nuôi cấy, máy cấy vô trùng, phòng nuôi cấy đủ ánh sáng nhân
tạo, điều hòa nhiệt độ, tủ sấy, tủ ấm, máy đo pH, các loại cân phân tích,…
Trƣớc khi cấy, thí nghiệm viên cần rửa tay bằng xà phòng và lau kỹ đến
khuỷu tay bằng cồn 90%. Để đảm bảo mức độ vô trùng cao cần có một đèn tử
ngoại treo trên trần. Phòng cấy lớn đƣợc khử trùng tiện nhất là bằng đèn cực
tím.Thời gian khử trùng tùy theo kích thƣớc của phòng và đèn cực tím chỉ
đƣợc sử dụng khi không có ngƣời. Phòng cũng có thể đƣợc khử trùng bằng
cách lau rửa hai lần/tháng với các dung dịch chống nấm. Phòng nhỏ hơn và tủ
cấy cũng đƣợc khử trùng bằng tia cực tím hay các dung dịch khử trùng. Tủ
cấy thổi gió đƣợc khử trùng bằng cách mở quạt gió và lau tất cả các bề mặt
bằng cồn 95% trong 15 phút trƣớc khi bắt đầu làm việc. Phòng nuôi cũng
đƣợc khử trùng trƣớc hết là bằng xà bông bột. Sau đó lau bằng dung dịch
hypoclorit sodium 2% hoặc bằng cồn 95%. Tất cả sàn, trần đều đƣợc lau nhƣ
vậy mỗi tuần. Cẩn thận không nên khuấy động những nơi bị nhiễm để tránh
phát tán bào tử.Cần giảm sự chuyển động của không khí trong buồng cấy đến
mức tối thiểu vì vậy tất cả các dụng cụ phục vụ việc cấy đều phải chuẩn bị
đầy đủ để trong khi cấy tránh đi lại ra vào buồng cấy nhiều lần.
1.2.4.3. Thành phần môi trường dinh dưỡng
Đến nay có hàng trăm môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo đã đƣợc xây
dựng và thử nghiệm có kết quả. Hầu hết các môi trƣờng nuôi cấy đều bao
gồm các nhóm chất sau:
9


- Các loại muối khoáng.
- Nguồn cacbon hữu cơ.
- Vitamin.
- Chất điều hòa sinh trƣởng.

thể sử dụng đƣờng glucozo, maltozo, galactozo,…
 Vitamin
Mặc dù tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro đều có khả năng tự tổng
hợp các loại vitamin cần thiết, nhƣng thƣờng không đủ lƣợng. Do đó, phải bổ
sung từ môi trƣờng ngoài, đặc biệt là vitamin thuộc nhóm B với nồng độ 1
ppm.
 Nhóm chất tự nhiên
Các nhà nuôi cấy mô và tế bào đã khẳng định môi trƣờng chỉ bao gồm
muối khoáng và đƣờng chƣa đủ cho tế bào sinh trƣởng tốt. Vì vậy, ngƣời ta
bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy một số nhóm chất tự nhiên nhƣ: Nƣớc dừa,
dịch chiết nấm men, dịch chiết mần lúa mì, một số dịch chiết rau, quả tƣơi,...
nhằm làm tăng thành phần dinh dƣỡng và cũng có các chất hoạt tính sinh học
giúp kích thích sự sinh trƣởng, phát triển của cây in vitro.
 Chất làm đông môi trƣờng
Thạch Agar – là một loại polysacarit của tảo (chủ yếu là tảo hồng
Rhodophyta), trong đó có rau câu mọc ở vùng đầm phá Việt Nam. Agar khi
ngâm nƣớc ở 80oC sẽ chuyển sang dạng sol và ở 40oC thì trở lại trạng thái gel.
Khả năng ngậm nƣớc của agar cao khoảng 6 – 12 g/l nƣớc. Tuy ở trạng thái
gel nhƣng agar vẫn đảm bảo cho các ion vận chuyển dễ dàng.
 Chất điều hòa sinh trƣởng
Các chất điều hòa sinh trƣởng có vai trò quan trọng nhất quyết định đến
kết quả nuôi cấy in vitro. Những chất điều hòa sinh trƣởng đó thuộc các nhóm
sau:

11


Nhóm các Auxin
Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trƣởng thực vật đƣợc sử dụng thƣờng
xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các

Dichlorophenoxyaxetic axid) rất có hiệu quả đối với môi trƣờng tạo và phát
triển callus. NAA chủ yếu sử dụng cho môi trƣờng ra rễ và phối hợp với
cytokinin sử dụng cho môi trƣờng ra chồi.
Nhóm các cytokinin
Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormone liên quan
chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ƣu thế ngọn và phân hóa chồi
trong nuôi cấy mô. Các cytokinin đƣợc sử dụng thƣờng xuyên nhất là
6-benzylaminopurine (BAP) hoặc 6- benzyladenin (BA), 6-γ-γ-dimethylaminopurine (2-iP), N-(2-furfurylamino)-1-H-purine-6- amine (kinetin), và 6(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino)purine (zeatin).
Cytokinin liên quan tới sự phân chia tế bào, phân hóa chồi v.v… Trong môi
trƣờng nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào và phân hóa chồi
từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cƣờng phát sinh
chồi phụ. Chức năng chủ yếu của các cytokinin đƣợc khái quát nhƣ sau:
12


- Kích thích phân chia tế bào
- Tạo và nhân callus
- Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô
- Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hƣởng ƣu thế của chồi
đỉnh
- Làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào
- Có thể làm tăng sự mở của khí khổng ở một số loài
- Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao)
- Ức chế sự hình thành rễ
- Ức chế sự kéo dài chồi
- Ức chế quá trình già (hoá vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục
Gibberellin
Nhƣng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật tác dụng của gibberellic
acid chƣa thật rõ ràng. Nhiều tác giả có sử dụng và coi đó là thành phần
không thể thiếu của một loại môi trƣờng chuyên dụng nào đó. Trong số hơn

- Hấp thụ độc tố nâu/đen (hợp chất phenol và melanin) và các độc tố
không màu khác.
- Hấp thụ các hợp chất hữu cơ khác (auxin, cytokinin, ethylene, vitamin,
chelate Fe và Zn,…).
- Thúc đẩy sự tạo phôi soma.
- Ổn định độ pH.
 Độ pH của môi trƣờng
Độ pH của môi trƣờng dinh dƣỡng ảnh hƣởng trực tiếp tới quá trình thu
nhận các chất dinh dƣỡng từ môi trƣờng vào tế bào.
Độ pH của môi trƣờng cấy hầu hết đƣợc chỉnh ở 5,5 ± 0,1 trƣớc khi hấp
khử trùng. Độ pH ảnh hƣởng đến khả năng hòa tan của các ion trong môi
trƣờng khoáng, khả năng đông tụ agar và sự tăng trƣởng của tế bào. Vì vậy
xác định chính xác độ pH là cần thiết. Murashige và Shoog nhận thấy rằng pH
5,7-5,8 thích hợp để duy trì sự hòa tan các chất khoáng trong môi trƣờng MS.
14


Nếu môi trƣờng MS đƣợc sử dụng ở dạng lỏng thì có thể chỉnh pH ở 5, môi
trƣờng cấy huyền phù có pH thấp phần nào giảm bớt tính trạng nhiễm. Độ pH
của môi trƣờng thƣờng đƣợc điều chỉnh bằng NaOH hoặc HCl sau khi đã pha
xong môi trƣờng và chuẩn bị đƣa và hấp khử trùng. Có thể chỉnh pH bằng pH
kế để bàn, pH kế cầm tay hoặc giây đo pH. Thƣờng thì nhiệt độ cao sẽ làm
tăng tính axit của môi trƣờng. Mann và cộng sự nhận thấy rằng nếu trƣớc khi
hấp pH=5,7 thì sau khi hấp pH = 5, nếu muốn pH =5,7-5,9 thì trƣớc khi hấp
khử trùng cần điều chỉnh pH đến 7.
Ngoài ra môi trƣờng cần có nƣớc hoàn toàn sạch ion, thƣờng sử dụng
nƣớc cất 2 lần.
1.2.5. Các giai đoạn nhân giống in vitro
1.2.5.1. Giai đoạn 1:Tạo vật liệu khởi đầu in vitro (Khử trùng mô cấy)
Lựa chọn mẫu và đƣa mẫu vào nuôi cấy cần đảm bảo các yêu cầu sau: