BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG NGUYỄN VĂN AN

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH PHÁT SINH HÌNH THÁI
MÔ RONG SỤN (Kappaphycus alvarezii) TRONG
ĐIỀU KIỆN IN VITRO
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành: Công nghệ sinh học Nha Trang - 2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG


Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, cùng
toàn thể các thầy, cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học và Môi trường đã tận tình
chỉ dạy và cho tôi nhiều kiến thức quý báu trong những năm học vừa qua.
Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS. Khúc Thị An và ThS. Văn Hồng Cầm
đã định hướng ý tưởng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm, sửa
luận văn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành cuốn
luận văn này.
Cảm ơn chị Nguyễn Minh Nhật, cán bộ quản lý phòng thí nghiệm Công nghệ
sinh học, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về thời gian, cơ sở vật chất cho tôi trong suốt
quá trình thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, tập thể lớp
52CNSH, những người luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh
thần rất lớn giúp tôi hoàn thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian học
tập và thực hiện đồ án vừa qua.

Nha Trang, tháng 6 năm 2014
Sinh viên
Nguyễn Văn An
ii

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC BẢNG v
DANH MỤC HÌNH vi
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii
MỞ ĐẦU ix
Chƣơng 1- TỔNG QUAN 1
1.1 Đặc điểm sinh học của rong sụn Kappaphycus alvarezii 1

(IAA, NAA, BAP) 22
Chƣơng 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23
3.1 Quy trình khử trùng mẫu 23
3.2 Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng 26
3.3 Ảnh hƣởng của kích thƣớc mẫu cấy 29
iv

3.4 Ảnh hƣởng của các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật (IAA, NAA,
BAP) 30
Chƣơng 4- KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37
4.1 Kết luận 37
4.2 Kiến nghị 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO 39
PHỤ LỤC 1 – Thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng và hóa chất khử trùng A
1
48
PHỤ LỤC 2 – Bảng số liệu kết quả khử trùng mẫu 53
PHỤ LỤC 3 – Bảng số liệu kết quả ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng 54
PHỤ LỤC 4 – Bảng số liệu kết quả ảnh hƣởng của kích thƣớc mẫu cấy 55
v

DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1 Sản lượng rong sụn trên toàn thế giới năm 2006 (Hurtado, 2007) 3
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng
thực vật (IAA, NAA, BAP) lên quá trình phát sinh hình thái rong
sụn 31
vi

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.3 Ảnh hưởng của các môi trường dinh dưỡng đến quá trình nuôi cấy mô
rong sụn 26
Hình 3.4 Mẫu mới cấy vào các môi trường (a), Mẫu sau 8 ngày nuôi trên môi
trường CW (b) 27
Hình 3.5 (a) Mẫu bị chết có hiện tượng tẩy trắng (bleach); (b) Mô sẹo dạng sợi,
hình thành sau 25 ngày nuôi cấy; (c) (- ->) là mẫu mô không phát triển,
() là mẫu mô hình thành mô sẹo sợi sau 27 ngày nuôi cấy; (d) Mẫu cấy
sau 20 ngày; (e, f) Chồi hình thành trên bề mặt mẫu. 28
Hình 3.6 Ảnh hưởng của kích thước mẫu cấy lên sự phát sinh hình thái của mô
rong sụn 32
Hình 3.7 (a) Filamentous callus phát triển xung quanh vết cắt, bên trong môi
trường ở ngày thứ 60; (b, c, d) Giải phẫu lát cắt ngang mẫu thân rong
phát sinh filamentous callus ở độ phóng đại 40X, 400X, 1000X. 34
Hình 3.8 (a, b) Mẫu phát sinh compact callus tại vị trí vết cắt ở ngày thứ 50; (c,
d) Giải phẫu lát cắt ngang compact callus ở độ phóng đại 100X, 400X. 35
Hình 3.9 (a, b) Chồi phát sinh xung quanh bề mặt vết cắt; (c, d) Chồi phát sinh
trên bề mặt mẫu cấy ở ngày thứ 40. 36

viii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Ký hiệu
Chữ viết tắt
2,4-D
2,4-dichlorophenoxyacetic acid
BAP
6-Benzylaminopurin
CW
Conwy (Môi trường Conwy)

về nuôi trồng rong biển như Công ty Trí Tín (Rong nho – Khánh Hòa), Capital
Seaweed (Rong sụn Khánh Hòa). Chính vì vậy, nghề nuôi trồng rong sụn tại Việt Nam
đang có cơ hội rất lớn để phát triển và đưa nghề trồng rong sụn thành ngành “Công
nghiệp” sản xuất rong sụn, nhằm đem lại hiệu quả kinh tế - xã hội cho ngư dân, doanh
nghiệp và đất nước.
Thế nhưng, những năm trở lại đây do ảnh hưởng biến đổi khí hậu, điều kiện
trồng không thuận lợi cho việc phát triển cây rong sụn. Đồng thời do chịu ảnh hưởng
lớn từ thời tiết, khí hậu, và các loại sâu bệnh, dẫn đến nhiều vấn đề như tốc độ tăng
trưởng, bệnh tật, suy thoái giống làm giảm chất lượng carrageenan và thiếu nguồn
cung cấp nguyên liệu (Ask và Azanza, 2002; Ask, 2006; Hurtado và Critchley, 2006;
Hurtado và cs., 2007). Do đó, việc sản xuất ở quy mô lớn đang gặp nhiều khó khăn,
không đảm bảo và chủ động về số lượng và chất lượng giống cung cấp cho thị trường
khi gặp các điều kiện khắc nghiệt của thời tiết và mùa vụ.
Chính vì thế, nghề trồng rong biển vẫn chưa phát triển xứng tầm với tiềm năng
vốn có của nó và luôn tiềm ẩn những rủi ro (giá cả, thị trường, bệnh tật, thời tiết, mùa
vụ…). Để phát triển được nghề nuôi trồng rong với quy mô đại trà, chúng ta phải chủ
động tạo được nguồn giống. Do vậy, việc nghiên cứu và ứng dụng các công nghệ mới
x

để phát triển các giống rong biển nói chung và rong sụn nói riêng là để tạo tiền đề cho
việc phát triển nghề trồng rong sụn thương mại và phục hồi nguồn lợi rong tự nhiên là
việc vô cùng cấp thiết hiện nay.
Kỹ thuật vi nhân giống sử dụng những mẫu cấy rất nhỏ (explant) như đoạn
thân, đoạn rễ (rong sụn không có rễ), chồi, phôi mầm nhờ đó có thể bảo tồn được cây
mẫu cũng như cung cấp nhiều mẫu giống hơn với một số ít mẫu ban đầu. Do dễ dàng
điều chỉnh các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cây, như nồng độ
dinh dưỡng, chất điều hòa sinh trưởng nên dễ dàng nhân giống quanh năm mà không
hề bị ảnh hưởng bởi yếu tố mùa vụ. Ngoài ra, nhờ vào điều kiện sinh trưởng lý tưởng,
hệ số nhân giống cũng cao hơn rất nhiều so với các phương pháp khác, làm cho nhân
giống in vitro rất thích hợp khi cần sản xuất một lượng lớn cây giống.

một số nhánh cụt hay nhánh nhỏ, trên bề mặt các nhánh có các u lồi hay mấu
nhỏ. Các nhánh mọc cách không đều. Tản rong màu xanh lục hay nâu vàng tùy
a.
b.
Hình 1.1 (a) Mẫu rong K. alvarezii nuôi ngoài tự nhiên. (b) Giải phẫu lát
cắt ngang thân rong (Độ phóng đại 100X)
2

điều kiện sống, giai đoạn sinh trưởng và độ sâu phân bố. Soi trên kính giải phẫu
một lát cắt ngang thân cho thấy bên trong lát cắt ngang có chứa các tế bào hình
tròn lớn nằm rải rác xen lẫn các tế bào nhỏ có vách ngăn dày (Hình 1.1).

Hình 1.2 Các loài Kappaphycus spp. đƣợc nuôi trồng thƣơng mại trên thế giới
(Hurtado và cs., 2008)

K. alvarezii (tambalang)
yellow-green
K. alvarezii (tambalang milo)
K. alvarezii
(adik kalas)
K. alvarezii
(tambalang) green
K. alvarezii
(adik goma)
K. alvarezii
(vanguard)
K. alvarezii
(tambalang) brown
K. alvarezii
(tambalang) dark red

10
o
Nam
4

Hình 1.4 Vòng đời của rong sụn Kappaphycus alvarezii
1.1.4 Hình thức sinh sản và vòng đời
Theo Luxton (1999), rong sụn trong điều kiện tự nhiên tồn tại ở 3 dạng
cây: cây giao tử đực (male gametophyte), cây giao tử cái (female gametophyte)
và cây bào tử bốn (tetrasporophyte) đồng nhất về hình dạng. Theo Azanza và
Aliaza (1999), trong tự nhiên rong sụn sinh sản theo các kiểu sau:
– Sinh sản vô tính bằng đoạn thân, nhánh (từ một đoạn thân, nhánh dù là
ở dạng cây giao tử đực, giao tử cái hay cây bào tử bị đứt gãy hay tách ra có thể
sinh trưởng và phát triển thành một cây mới).
– Sinh sản vô tính bằng bào tử (ở cây bào tử bốn)
– Sinh sản hữu tính bằng sự kết hợp giữa tinh tử của cây giao tử đực với
trứng của cây giao tử cái qua quá trình kết hợp, phát triển phóng thích, bám,
sinh trưởng để trở thành các cây bào tử mới, từ cây bào tử qua quá trình sinh sản
bằng bào tử sẽ cho ra các cây giao tử đực và giao tử cái.
5

Các hình thức sinh sản này luân phiên xảy ra trong điều kiện tự nhiên và
các dạng cây khác nhau của rong sụn cùng đồng thời tồn tại và phát triển (Hình
1.4).
1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng của rong sụn
1.1.5.1 Độ mặn
Rong sụn sinh trưởng và phát triển tốt ở vùng nước có độ mặn cao
(27–35psu); ở độ mặn thấp (18–20psu) rong chỉ có thể tồn tại trong thời
gian ngắn (5–7 ngày), sau đó rong sẽ ngừng phát triển và chết (Rolando và
Oliver, 2009).

đòi hỏi phải cung cấp chất dinh dưỡng; nhưng trong các điều kiện không
thuận lợi (nhiệt độ cao, nồng độ muối thấp, nước ít lưu chuyển…) rong
sụn đòi hỏi dinh dưỡng (các muối amoni, photphat) cao hơn cho sự sinh
trưởng bình thường.
1.1.6 Địch hại đối với rong sụn
Theo Nguyễn Hữu Dinh (1995-1996), vấn đề lớn nhất trong nuôi trồng
rong sụn là cá ăn rong. Hiện tượng này diễn ra phổ biến và xảy ra quanh năm
song đặc biệt tập trung vào các tháng 3 và 5, khi có những đàn cá con của các
loài cá dò, cá dìa (Siganus sp.). Trong thời gian này, mức độ rong sụn bị cá ăn là
rất lớn, chủ yếu là ăn các mầm và nhánh non làm cho tốc độ tăng trọng và khả
năng phát triển của rong sụn ảnh hưởng đáng kể. Vào các tháng 10 và 12, trùng
với mùa gió Bắc, các đàn cá lớn tập trung vào chỗ cạn hơn (nơi trồng rong sụn)
cùng với việc thiếu thức ăn mùa đông, cá tập trung ăn rong sụn ở mức độ cao từ
các nhánh cho đến cả thân chính của cây rong làm cho cây rong không chỉ cùi
cụt mà mất cả lớp tế bào vỏ dẫn đến tình trạng đứt gãy và nhũn nát, rong không
phát triển được mà còn bị hao hụt đáng kể.
1.1.7 Bệnh trên rong sụn và thực vật phụ sinh (Epiphytes)
"Bệnh ice-ice" (ngư dân thường gọi là bệnh nhũn thân hay trắng thân) và
nhiễm trùng thực vật phu
̣
sinh là hai y ếu tố được quan sát thường xuyên trong
khu canh tác thương mại có mật độ cao (Vairappan Charles và cs., 2009).
Theo Doty (1987), bệnh ice-ice có biểu hiện là xuất hiện những điểm hay
vùng có màu trắng ở trên thân chính hay nhánh của cây rong, kèm theo sự mất
đi của các sắc tố, các phần này bắt đầu mềm và lủn dần khiến cho cây và nhánh
rong bị đứt gãy (Hình 1.5). Theo Hurtado và cs. (2001), bệnh ice – ice thường
7

xuyên xuất hiện chủ yếu trong mùa nắng nóng. Hiện tượng bệnh xuất hiện
thường liên quan đến các điều kiện sau:

nhất (Critchley và Ohno, 1998).
Theo Lindsey Zemke-White và Ohno (1999), kappa–carrageenan là
nguồn nguyên liệu trong các ngành công nghiệp: làm kem, sữa, nước chấm,
mứt, bánh kẹo (công nghệ thực phẩm); các loại xà phòng, các loại kem mỹ
phẩm (công nghiệp mỹ phẩm); giấy, da, in, sơn, nhuộm (công nghiệp nhẹ); cố
định enzyme và nấm men, nuôi cấy mô thực vật và nuôi cấy vi sinh (công nghệ
sinh học).
1.2.2 Ứng dụng trong xử lý môi trường
Rong sụn có khả năng hấp thụ cao các chất thải dinh dưỡng trong môi
trường nước phú dưỡng (sau 45 ngày thí nghiệm, hàm lượng nitơ tổng số có thể
giảm đến 80%) (Huyên và cs. , 2005).
9

Theo nghiên cứu của Huỳnh Quang Năng (2005), với ao nuôi tôm có
trồng luân canh rong sụn, kết quả nghiên cứu cho thấy chỉ cần khoảng 60 ngày
có thể xử lý ô nhiễm phú dưỡng đáy ao bởi những cặn bã hữu cơ tích tụ qua vụ
nuôi tôm trước đó. Trong khi ở ao không có rong, để làm sạch đáy ao phải mất
130 ngày thay rửa tự nhiên liên tục.
1.2.3 Chiết xuất lectin
Lectin (còn gọi hemagglutinins hoặc agglutinins) là các protein hoặc
glycoprotein có ít nhất một vùng không xúc tác sinh học; tương tác thuận nghịch
với một monoor cụ thể của oligosaccharide (Peumans và Van Damme, 1995;
1998). Lectin là đối tượng nghiên cứu tuyệt vời trong lĩnh vực nghiên cứu sinh
hóa và y sinh học như miễn dịch học, sinh học tế bào, nghiên cứu cấu trúc
màng, nghiên cứu ung thư và kỹ thuật di truyền (Minko, 2004; De Mejia và
Prisecaru, 2005; Balzarini, 2006).
Boyd và cs. (1966) lần đầu tiên báo cáo sự xuất hiện của lectin trong tảo
biển. Ở loài tảo đỏ như chi Eucheuma (hoặc Kappaphycus) có chứa một lượng
lớn các lectin có hoạt tính sinh học tốt (Kawakubo và cs., 1997; Kawakubo và
cs., 1999; Sugawara và cs., 2001; Liao WR và cs., 2003; Hori và cs., 2007).

1986), sử dụng hỗn hợp kháng sinh (như Penicillin G, Streptomycin, Neomycin,
Kanamycin ) để khử trùng mẫu. Kết quả bước đầu đã xác định được khả năng nuôi
cấy in vitro trên đối tượng rong biển.
Ask và Azanza (2002) cũng đã báo cáo về việc nhân giống Kappaphycus
alvarezii bằng bào tử trong phòng thí nghiệm. Kết quả cho thấy, các bào tử được phóng
thích trong 1 tháng với số lượng 4.4 x 10
4
tế bào/g. Tỷ lệ nảy mầm của các bào tử
11

khoảng 41%, tốc độ tăng trưởng của các bào tử tốt nhất đạt được ở ngày thứ 10 của
tháng là 2.5%.
Reddy và cs. (2003) đã thành công trong việc nuôi cấy phôi in vitro và tái sinh
cây từ phôi vô tính của loài Kappaphycus alvarezii (Hình 1.7). Kết quả nghiên cứu cho
thấy mô sẹo được tạo thành ở hơn 80% từ các mảnh cấy được nuôi trong môi trường
PES (Provasoli, 1968) có bổ sung 1.5% agar. Sự tạo thành phôi vô tính còn được quan
sát khi nuôi cấy lớp mỏng tế bào của các mảnh mô sẹo trong môi trường có bổ sung hỗn
hợp các chất điều hòa sinh trưởng thực vật là NAA (1- naphtalene acetic acid) và BAP
(6 –benzylaminopurine).
Muñoz Julieta và cs. (2006) đã thành công trong quá trình vi nhân giống rong
sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) trong các thiết bị lên men sinh học (bioreactor) có sử
dụng các chất điều hòa sinh trưởng. Kết quả nghiên cứu cho thấy các mô sẹo được cảm
ứng hình thành sau 30 ngày nuôi cấy khi sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng là
kinetin, 1mg/L BAP, 1mg/L NAA và 0.018mg/L spermine.
Hurtado và Biter (2007) cũng đã tái sinh cây giống rong sụn Kappaphycus
alvarezii var.adik-adick thành công bằng phương pháp nuôi cấy mô tại Philippines. Kết
quả nghiên cứu cho thấy các mẫu cấy vô trùng được nuôi cấy trong môi trường ESS/2 +
Hình 1.7 Mẫu mô sẹo phát triển sau 60 ngày nuôi cấy. (a) mô sẹo phát triển
trên bề mặt lát cắt. (b) mô sẹo phát triển xung quanh mẫu. (c) mô
sẹo phát triển từ đỉnh sinh trƣởng của mẫu. (Reddy và cs., 2003)

với PGR để khảo sát hiệu quả hình thành chồi của 7 chủng rong K. alvarezii. Kết quả
cho thấy, chồi đã phát triển thành công ở cả 7 loài với tỷ lệ đáp ứng và tạo chồi ở các
nồng độ AMPEP khác nhau là khác nhau với từng loài. Nhanh nhất là 19 ngày ở chủng
TGR (Kappaphycus alvarezii var. tungawan green). Một điều đáng chú ý là ở nồng độ
AMPEP cao (3-5 mg/L) khi không sử dụng PGR thì hiệu quả tạo chồi tương đương như
khi sử dụng AMPEP thấp có bổ sung PGR, và hiệu quả hơn khi dùng môi trường
ESS/2+ PGR.
Sulistiani và cs. (2012), đã nghiên cứu ảnh hưởng riêng lẻ hoặc phối hợp của
các chất điều hòa sinh trưởng thực vật: IAA (nồng độ 0, 0.5, 1 mg/L), NAA (nồng độ 0,
2.5, 5 mg/L), BAP (nồng độ 0, 0.5, 1 mg/L) trên 2 môi trường dinh dưỡng PES và CW
13

(Liao và cs., 1983) lên khả năng hình thành mô sẹo. Kết quả cho thấy mô sẹo hình thành
và phát triển tốt nhất trên môi trường PES bổ sung 1 mg/L BAP.
Tại Việt Nam chưa có công bố chính thức nào về nuôi cấy mô, tế bào rong sụn.
1.4 Nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.4.1 Khái niệm
Nuôi cấy mô tế bào thực vật hay còn gọi là nuôi cấy in vitro là công cụ
cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành công
nghệ sinh học. Nhờ áp dụng kĩ thuật nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực
vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần so với tự nhiên. Do đó tạo ra hàng loạt cá
thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian
đưa giống mới vào sản xuất. Hơn nữa dựa vào kĩ thuật nuôi cấy mô có thể duy
trì và bảo quản nhiều giống cây trồng quí hiếm để phục tráng giống cây trồng.
Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật bắt đầu từ một mảnh nhỏ thực vật vô
trùng được đặt trong môi trường dinh dưỡng thích hợp. Chồi mới hay mô sẹo
mà mẫu cấy này sinh ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền để
nhân giống.
1.4.2 Sự phát sinh hình thái thực vật
Phát sinh hình thái thực vật là những phát triển của cơ thể thực vật: tế