BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HỒ LƯƠNG NHẬT VINH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, TÁC
DỤNG ỨC CHẾ ENZYME α- AMYLASE VÀ α-
GLUCOSIDASE CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH
CHIẾT LÁ CÂY ĐINH LĂNG
POLYSCIAS FRUTICOSA (L.)HARMS) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HỒ LƯƠNG NHẬT VINH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, TÁC
DỤNG ỨC CHẾ ENZYME α- AMYLASE VÀ α-
GLUCOSIDASE CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH
CHIẾT LÁ CÂY ĐINH LĂNG
POLYSCIAS FRUTICOSA (L.)HARMS)

ọc và Công nghệ Việt
Nam đã hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian tôi làm thực
nghiệm tại cơ sở.
Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè - những người
đã luôn ở bên giúp đỡ, động viên, ủng hộ và tạo điều kiện tốt cho tôi trong suốt thời
gian học tập cũng như trong cuộc số
ng
Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó!

Thái Nguyên, ngày 26 tháng 8 năm 2014
Hồ Lương Nhật Vinh
MỤC LỤC

KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ
1
Chương 1. TỔNG QUAN
3
1.1. Tổng quan về thực vật
3
1.1.1. Tổng quan về chi Polyscias
3

2.1. Đối tượng nghiên cứu
20
2.2. Phương tiện nghiên cứu
20
2.2.1. Hóa chất, thuốc thử
20
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị chiết tách mẫu
20
2.2.3. Dụng cụ thiết bị xác định cấu trúc
20
2.2.4. Dụng cụ thiết bị thử hoạt tính in vitro
21
2.2.5. Dụng cụ và thiết bị thử loại hoạt tính in vivo 21
2.3. Phương pháp nghiên cứu
21
2.3.1. Nghiên cứu thành phần hóa học
21
2.3.1.1. Định tính một số nhóm chất hữu cơ chính
21
2.3.1.2. Chiết xuất và phân lập
21
2.3.1.3. Xác định cấu trúc
24
2.3.2. Nghiên cứu về tác dụng ức chế enzym α - amylase và α - glucosidase in
vitro
24
2.3.3. Nghiên cứu về tác dụng giảm sự gia tăng đường huyết in vivo
26
2.3.3.1. Mô hình chuột uống đường sucarose liều cao
27

3.5.1. Mô hình chuột dung nạp đường sucarose liều cao
41
3.5.2. Mô hình chuột gây tiểu đường bằng Streptozocin
43
Chương 4: BÀN LUẬN
46
4.1. Về phương pháp
46
4.2. Về thành phần hóa học
47
4.3. Về tác dụng sinh học 48
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
53
1. Kết luận
53
2. Đề xuất
54
TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Tóm tắt các saponin triterpenoid trong cây Đinh lăng
7
Bảng 1.2. Một số acid amin có trong cây Đinh lăng
8
Bảng 1.3. Một số vitamin có trong cây Đinh lăng
9
Bảng 1.4. Một số Polyacetylen có trong cây Đinh lăng
9
Bảng 1.5. Một số tinh dầu có trong cây Đinh lăng
10
Bảng 1.6. Một số hợp chất tự nhiên ức chế enzyme α - amylase
17
Bảng 1.7. Một số hợp chất tự nhiên ức chế enzyme α - glucosidase
18
Bảng 3.1. Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất trong lá Đinh lăng
29
Bảng 3.2. Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất trong phân đoạn F2
31
Bảng 3.3. Số liệu phổ
13
C - NMR của các hợp chất PFW1 32
Bảng 3.4. Số liệu phổ
13

Hình 1.2. Công thức saponin triterpenoid của cây Đinh lăng
6
Hình 1.3. Sơ đồ chuyển hóa đường trong cơ thể
17
Hình 2.1. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn nghiên cứu
22
Hình2.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất PFW1, PFW2, PFW8
24
Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của chất PFW1
35
Hình 3.4. Tương tác HMBC của hợp chất PFW1
35
Hình 3.5. Cấu trúc hóa học của chất PFW8
37
Hình 3.6. Cấu trúc hóa học của chất PFW2
39
Hình 3.7. Biểu đồ so sánh hoạt tính ức chế α - amylase của cao chiết và chất
PFW1
40
Hình 3.8. Biểu đồ so sánh hoạt tính ức chế α - glucosidase của cao chiết và chất
PFW1
41
Hình 3.9. Biểu đồ so sánh nồng độ glucose trong huyết thanh chuột trên mô hình
chống dung nạp sucarose liều cao tại các thời điểm nghiên cứu
42
Hình 3.10. Biểu đồ so sánh nồng độ glucose trong huyết thanh chuột trên mô hình
gây tăng đường huyết bằng STZ tại các thời điểm nghiên cứu
44
nhiều nghiên cứu trên bộ phận lá mặc dù lá Đ
inh lăng cũng có thành phần hóa học
giống rễ [12], mà đây lại là nguồn dược liệu phong phú, dễ khai thác. Trong chương
trình sàng lọc tìm kiếm các hoạt chất có tác dụng chữa bệnh tiểu đường từ nguồn
dược liệu thiên nhiên, chúng tôi đã phát hiện dịch chiết toàn phần lá Đinh lăng thể
hiện hoạt tính ức chế α-amylase và α-glucosidase, đây là những enzyme đóng vai
trò thủy phân carbohydrate có liên quan trực tiếp đến việ
c tăng đường huyết.

2
Với mong muốn nghiên cứu ra các loại thuốc điều trị ĐTĐ mới có nguồn gốc
từ dược liệu với tác dụng điều trị bệnh ĐTĐ hiệu quả, an toàn, giá rẻ và ít tác dụng
phụ mà vẫn bảo tồn được nguồn dược liệu quý trong nước, đề tài “Nghiên cứu
thành phần hóa học, tác dụng ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase của
phân đ
oạn dịch chiết lá cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms)” được
thực hiện với các mục tiêu chính sau:
1. Nghiên cứu thành phần hóa học của lá Đinh lăng và một phân đoạn dịch
chiết lá Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms)
2. Thử tác dụng ức chế α-amylase và α-glucosidase in vitro của phân đoạn
nghiên cứu
3. Thử tác dụng giảm sự gia tăng đường huyết của ch
ất phân lập được từ phân
đoạn nghiên cứu.
Để đạt được 3 mục tiêu trên, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:
¾ Nghiên cứu về thành phần hóa học:
- Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong dịch chiết tổng và một phân đoạn
dịch chiết của lá Đinh lăng.
- Chiết xuất và phân lập một số hợp chất từ phân đoạn dịch chi
ết nghiên cứu.

n nhiệt đới, nhiều nhất là ở vùng đảo Thái Bình Dương [13]. Ở Việt Nam, hiện
nay có hơn 10 loài Đinh lăng [16], đa số Đinh lăng hiện này được sử dụng làm cây
cảnh, chỉ có vài loài được sử dụng làm thuốc, loài Đinh lăng được sử dụng làm
thuốc phổ biến nhất là Polyscias fruticosa (L.) Hams. Đây là loài có nhiều tác dụng
dược lý giống Nhân sâm [2].

4
1.1.2. Tổng quan về loài Polyscias fruticosa (L.) Harms
1.1.2.1. Nguồn gốc, phân bố và đặc điểm thực vật
Cây Đinh lăng còn có tên khác là cây gỏi cá, nam dương lân [18].
Tên khoa học: Polyscias fruticosa (L.) Hams.
Tên đồng nghĩa: Panax fruticosum L, Nothopanax fruticosum (L.) Miq,
Tieghenopanax fruticosus (L.) R. Vig [18].
Họ Ngũ gia bì (Araliaceae).
Cây nhỏ quanh năm xanh tốt, cao 0,8-2m [3], [13]. Thân nhẵn, không gai, ít
phân nhánh, mang nhiều vết sẹo to, màu xám [3], [8]. Lá kép lông chim 3 lần xẻ,
mọc so le, dài 20-40cm, không có lá kèm rõ; lá chét có cuống gầy dài 3 - 10mm,
phiến lá chét có răng cưa không đều, đôi khi chia thùy, gốc và
đầu thuôn nhọn, có
mùi thơm, cuống lá dài phát triển thành bẹ to ở phần cuối [3, 18]. Hoa thường nở
vào tháng 4-7; cụm hoa hình chùy ngắn mang nhiều tán ở ngọn, lá bắc rộng, sớm
rụng, hoa nhỏ, màu lục nhạt hoặc trắng xám, đài hợp, mép uốn lượn, tràng năm
cánh dài trái xoan, nhọn đầu, nhị năm với chỉ nhị gầy, bầu hạ 2 ngăn [13], [18]. Quả
dẹt, hình trứng rộng, có vòi, màu trắng bạc [16], [18]. Rễ cong queo, dài kho
ảng 30
cm, rộng khoảng 2,5 cm, đầu trên to, đầu dưới thuôn; mặt ngoài màu trắng xám, có
nhiều nếp nhăn dọc, nhiều lỗ bì nằm ngang, nhiều vết tích của rễ con và các đoạn rễ
con còn sót lại [4].
Rễ Đinh lăng nên thu hoạch vào mùa đông ở những cây trồng từ 3 năm trở lên
(trồng càng nhiều năm thì hệ rễ càng phát triển và lượng hợp chất thu được càng

▪
Acid 3-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1→2), β-D-glucopyranosyl(1→4)]-β-D-

6
glucuronopyranosyloleanolic (4)
▪ Acid 3-O-[β-D-galactopyranosyl-(1→2), β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D-
glucuronopyranosyloleanolic (5)
▪ 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→ 4)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic 28-O-β-
D-glucopyranosyl ester (6)
▪ 3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2),β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-β-D-
glucuronopyranosyloleanolic 28-O-β-D-glucopyranosyl ester (7)
▪ 3-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1→2), β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-β -D-
glucuronopyranosyloleanolic 28-O-β-D-glucopyranosyl ester (8)
▪ 3-O-[β-D-galactopyranosyl-(1→2), β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β -D-
glucuronopyranosyloleanolic 28-O-β-D-glucopyranosyl ester (9)
▪
3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic 28-O-α-
L-rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl ester (10)
▪ 3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2),β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-β-D-
glucuronopyranosyloleanolic 28-O-[ α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-β -D-
glucopyranosyl ester. (11)
▪ Acid 3-O-[β-D-galactopyranosyl (12)-β-D-glucopyranosyl] oleanolic (12)
▪ Acid 3-O-[α-rhamnopiranosyl-(1-4)-β-D-glucopyranosyl]-28-O-β-D-
glucopyranosyl] oleanolic (13)

Hình 1.2. Công thức saponin triterpenoid của cây Đinh lăng

7
Bảng 1.1. Tóm tắt các saponin triterpen trong cây Đinh lăng
(Công thức chung ở hình 1.2)

Glc-(1Æ4)
Glc-
(9)
Gal-(1Æ2) Glc-
Glc-(1Æ3)
Glc-
(10)
Glc-(1Æ4)-Gla- Rha-(1Æ3)-Glc-

(11)
Glc-(1Æ2) Glc-
Glc-(1Æ4)

Rha-(1Æ3)-Glc-
(12)
Gal-(1Æ2)-Glc- H
(13)
Rha-(1Æ4)-Glc- Glc-

8

Bảng 1.2. Một số acid amin có trong cây Đinh lăng [23] Arginin
Lysin

Phenylalanin

Prolin

Metionin
Threonin


H
3
C
OH
O
O
OH
OH
HO

Vitamin B2 Vitamin C
Vitamin B6
(Pyridoxamine) Vitamin B6
(Pyridoxine) Vitamin B6
(Pyridoxal)

Bảng 1.4. Một số Polyacetylen có trong cây Đinh lăng [31]



α-Bergamoten 11
1.1.2.3. Tác dụng sinh học
Cây Đinh lăng được coi như nhân sâm Việt Nam vì nó có rất nhiều tác dụng
tương tự như nhân sâm: làm tăng cường sức dẻo dai và nâng cao sức đề kháng của
cơ thể, chống được hiện tượng mệt mỏi, bổ dưỡng, làm cho cơ thể ăn ngon, ngủ
yên, tăng khả năng lao động và làm việc bằng trí óc, lên cân và chống độc…[12],
[18]. Cụ thể các nghiên cứu cho thấy:
Nước s
ắc rễ Đinh lăng có tác dụng làm tăng sức dẻo dai của cơ thể trên thí
nghiệm cấp tính tương tự như nhân sâm [18].
Các thí nghiệm trên chuột cho thấy cây Đinh lăng có tác dụng lợi tiểu, làm
tăng tiết niệu gấp năm lần so với bình thường, làm tăng sức đề kháng của chuột đối
với các bức xạ siêu cao tần [3], [18].
Cây Đinh lăng có tác dụng tăng lực, tă
ng cân, tăng khả năng chịu đựng của bộ
đội, vận động viên thể thao [17], [17].
Các hợp chất polyacetylen như (8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol
phân lập được từ cây Panax vietnamensis và Polycias fruticosa cho thấy có hoạt
tính kháng vi khuẩn Gram (+), kháng nấm Candida albican nhưng không kháng
được vi khuẩn Gram (-) [31].
Năm 2001, Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự đã dùng chuột nhắt trắng để
thử nghiệm tác dụng chống trầm cảm và stress của Đinh lăng. Kết quả cho thấy cao
Đinh lăng có tác dụng chống trầm cảm và phục hồi thời gian ngủ bị rút ngắn bởi

Theo dân gian, rễ Đinh lăng được dùng làm thuốc bổ, chữa cơ thể suy nhược,
gầy yếu mệt mỏi, tiêu hóa kém, ho, ho ra máu, đau tử cung, kiết lỵ, làm thuốc lợi
tiểu. Thân và cành dùng chữa phong thấp, đau lưng. Lá dùng chữa cảm sốt, mụn
nhọt sưng tấy, sưng vú [13]. Dưới đây là một số bài thuốc dân gian có Đinh lăng:
Chữa mệt mỏi, biếng hoạt động: Rễ Đinh lăng phơi khô thái mỏng 0,50 g thêm
100 ml nước, đun sôi trong 15 phút, chia 2-3 lần uống trong ngày [18].
Thông tia sữa, căng vú sữa: Rễ Đinh lăng 30-40g. Thêm 500ml nước sắc còn
250 ml. Uống nóng. Uống luôn 2-3 ngày, vú hết nhức, sữa chảy ra bình thường [18].
Chữa vết thương: Giã nát lá Đinh lă
ng đắp lên [18].
Lợi sữa: Lá Đinh lăng tươi 50-100g, bong bóng lợn 1 cái, băm nhỏ, trộn với
gạo nếp, nấu cháo ăn. Hoặc rễ Đinh lăng tươi 30-40g, thêm 500 ml nước, sắc còn
250 ml, uống nóng, ngày uống 1-2 lần, uống trong 2-3 ngày [12], [16].
Lá Đinh lăng phơi khô đem lót gối hoặc trải giường cho trẻ em nằm giúp
phòng bệnh kinh giật [18].
Ở Ấn Độ, người ta cho là cây có tính làm săn, dùng trong điều trị sốt [13].
Ở
Campuchia, người ta dùng lá phối hợp với các cây thuốc khác làm bột hạ
nhiệt, thuốc giảm đau. Lá dùng xông để ra mồ hôi và chữa chứng chóng mặt, dùng
tươi giã nát đắp ngoài trị viêm thần kinh khớp và vết thương. Lá nhai nuốt với chút
phèn giúp trị hóc xương cá [13].
13
1.2. Tổng quan về enzyme α- amylase và enzyme α-glucosidase
1.2.1. Khái niệm enzyme [15]
Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra quá trình trao đổi chất. Sự trao
đổi chất ngừng thì sự sống không còn tồn tại. Quá trình trao đổi của một chất là tập
hợp của rất nhiều các phản ứng hóa học phức tạp. Các phản ứng này có liên quan


chế

có

thể

ngăn

chặn

một

chất

nền

đi

vào

tâm

hoạt

động

của

enzyme


chế

có

thể

liên

kết

với

enzyme

thuận

nghịch

hoặc

không

thuận

nghịch.

Chất

ức


hóa

học.

Những

chất

ức

chế

đó

làm

thay

đổi

dư

lượng

các

acid

amin


nghịch

liên

kết

không

đồng

hóa

trị

và

theo

những

kiểu

khác

nhau

tùy

thuộc


thuận

nghịch

liên

kết

với

enzyme

bằng

các

tương

tác

không

đồng

hóa

trị

chẳng


Nhiều

liên

kết

yếu

giữa

các

chất

ức

chế

và

tâm

hoạt

tính

mạnh

mẽ


thuận

nghịch,

các

chất

ức

chế

thuận

nghịch

thường

không

trải

qua

phản

ứng

hóa


pha

loãng

hoặc

thẩm

tách.

Có

4

kiểu

của

ức

chế

enzyme

thuận

nghịch,

chúng


của

enzyme

trên

chất

ức

chế:

-
Ức

chế

cạnh

tranh

(competitive

inhibition):

chất

nền


thể

là

do

chất

ức

chế

có

ái

lực

với

tâm

hoạt

động

của

một


cạnh

tranh

vào

tâm

hoạt

động

của

enzyme.

Đây

là

loại

ức

chế

có

thể


ức

chế

cạnh

tranh

thường

có

cấu

trúc

tương

tự

như

cấu

trúc

của

chất



với

phức

enzyme-chất

nền

mà

không

kết

hợp

với

enzyme

tự

do.

Đây

là

một


hoạt

tính

của

nó

nhưng

không

ảnh

hưởng

đến

liên

kết

của

enzyme-chất

nền.

Kết


chất

ức

chế.

-
Ức

chế

không

cạnh

tranh

(noncompetitive

inhibition):

chất

ức

chế

kết


tạo

thành

phức

enzyme-chất

nền-chất

ức

chế

không

bị

chuyển

hóa

tiếp.

Như

vậy,

enzyme


và

chất

ức

chế

không

cạnh

tranh

với

nhau

để

kết

hợp

với

enzyme

và


nền.

-
Ức

chế

hỗn

tạp

(mixed

inhibition):

là

chất

ức

chế

không

những

liên

kết


thành

phức

hợp

enzyme-chất

ức

chế-chất

nền

nên

không

tạo

được

sản

phẩm.

Hiện

ức

chế

cực

đại

đo

được

khi

không

có

chất

ức

chế

là

cao

hơn

tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide
1.2.3.1. Đặc tính của enzyme α-amylase [33]
Enzyme α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết 1,4-glucoside nằm bên
trong của phân tử cơ chất (tinh b
ột, glycogen) một cách ngẫu nhiên và vì thế gọi là
enzyme nội bào. Enzyme α-amylase không chỉ có khả năng phân hủy hồ tinh bột mà
còn có khả năng phân hủy các hạt tinh bột nguyên vẹn song với tốc độ rất chậm.
Quá trình thủy phân tinh bột bởi enzyme α-amylase là quá trình đa giai đoạn
+ Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy
phân tạo thành một lượng l
ớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin).
16
+ Giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy
phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không màu với iode. Các chất này bị thủy
phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới tác
dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-
7 gốc glucose
+ Sau đó, các polyglucose này bị phân cách tiếp tục tạo nên các mạch
polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải tới maltotetrose và maltotriose và
maltose.
Qua một thời gian tác dụng dài sản ph
ẩm thủy phân của amylose chứa 13%
glucose và 87% maltose. Tác dụng của enzyme này với amylopectin cũng tương tự
nhau nhưng vì không phân cắt được liên kết 1,6-glucoside nên sản phẩm sẽ là 72%
maltose, 19% glucose, dextrin thấp phân tử và 8% isomaltose.
Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành
maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp.


thuộc

nhóm

hydrolase

(nhóm

enzyme

xúc

tác

các

phản

ứng

thủy

phân). Khi thức ăn được hấp
thu vào cơ thể thì các carbohydrat trong thức ăn được thủy phân thành những
phân tử đường nhỏ hơn bởi những enzyme ở ruột non. Tiến trình phân hóa này
đòi hỏi tụy tạng phải tiết ra enzyme α-amylase dùng để phá vỡ các phân tử
carbohydrat lớn thành olisaccharid. Enzyme α-glucosidase ở màng ruột non lại
tiếp tục phân hóa các olisaccharid thành các phân tử đường nhỏ hơn nữa rồi mới
thẩm thấu vào máu.