TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

ĐINH THỊ PHƢƠNG

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU
CHỦNG VI KHUẨN LACTIC CÓ ĐẶC TÍNH
PROBIOTIC TỪ MẬT VÀ SÁP ONG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học

HÀ NỘI, 2014

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

Em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô giáo TS. Trần Thị Thúy,
ngƣời đã tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và
hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp này.
Em gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung, cô giáo đã
tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Em xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo công tác tại bộ môn Công nghệ
Sinh học- Vi sinh, khoa Sinh học, trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội, đã hết lòng tạo
điều kiện, giúp đỡ em thực hiện các nghiên cứu của mình.
Xin cảm ơn tới các anh, chị, các bạn sinh viên đang làm việc và học tập Bộ
môn Công nghệ Sinh học – Vi sinh, đã giúp đỡ em nhiệt tình trong suốt quá trình
làm đề tài này.
Cuối cùng em xin đƣợc cảm ơn những ngƣời thân, bạn bè, đã quan tâm giúp
đỡ em trong suốt thời gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2014
Sinh viên

Đinh Thị Phƣơng
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả

+
Gram dƣơng
G
-
Gram âm
VTM Vitamin
w/v Khối lƣợng/thể tích
STT Số thứ tự
ĐC Đối chứng
PTN Phòng thí nghiệm

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các chỉ tiêu để lựa chọn VSV làm probiotics 10
Bảng 3.2. Các mẫu phân lập vi khuẩn lactic 25
Bảng 3.3. Một số đặc điểm sinh học của 61 chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc
từ mật và sáp ong……………………………………………… 26

Hình 3.13. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự sinh trƣởng của chủng LT31 40
Hình 3.14. Ảnh hƣởng của pH đến sự sinh trƣởng của chủng LT31 41
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ……………………………………………………………………………1
1. Lí do chọn đề tài………………………………………………………………… 1
2. Mục đích nghiên cứu…………………………………………………………… 1

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 15
2.2.1. Phân lập vi khuẩn lactic từ mật và sáp ong 15
2.2.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn 16
2.2.2.1. Xác định hoạt tính kháng sinh bằng phƣơng pháp đặt khối thạch 16
2.2.2.2. Xác định hoạt tính kháng sinh bằng phƣơng pháp đục lỗ thạch 17
2.2.3. Xác định số lƣợng tế bào vi khuẩn 17
2.2.4. Xây dựng đồ thị chuẩn về mối tƣơng quan giữa số lƣợng tế bào vi
khuẩn trong dịch nuôi cấy với giá trị OD
620
18
2.2.5. Nghiên cứu đặc điểm của chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn 19
2.2.5.1. Phát hiện hoạt tính catalase 19
2.2.5.2. Phát hiện khả năng sinh khí từ glucose 19
2.2.5.3. Xác định lƣợng đƣờng còn lại trong dịch nuôi cấy 19
2.2.5.4. Xác định khả năng quần tụ của chủng vi khuẩn lactic theo phƣơng pháp
của Reniero và cộng sự (1992) 21
2.2.5.5. Kiểm tra khả năng đồng quần tụ với các chủng vi sinh vật kiểm định
theo phƣơng pháp của Kmet và cộng sự (1995) 21
2.2.5.6. Xác định khả năng chịu axit của chủng nghiên cứu 22
2.2.5.7. Xác định khả năng sinh trƣởng với mật lợn 22
2.2.6. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng đến khả năng
sinh trƣởng và phát triển của chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu 23
2.2.6.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ 23
2.2.6.2. Ảnh hƣởng của độ pH 23
2.2.6.3. Ảnh hƣởng của các môi trƣờng tự nhiên 23
2.2.7. Bảo quản chủng giống vi khuẩn trong dung dịch 30% glycerol 24
2.2.8. Phƣơng pháp thống kê và xử lí kết quả 24
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25
3.1. Phân lập vi khuẩn lactic từ mật ong, sáp ong 25
3.2. Tuyển chọn vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn 30

gà, tôm, cua, cá,…).
Mật và sáp ong từ lâu đã đƣợc nhân dân ta sử dụng nhƣ một bài thuốc dân
gian để phòng trị nhiều bệnh, từ các bệnh đƣờng hô hấp đến các bệnh đƣờng tiêu
hóa, nhiễm trùng da. Một số nhóm nghiên cứu trên thế giới cũng đã báo cáo những
phát hiện về khu hệ VSV có ích trong tổ ong, sáp và mật ong.
Từ thực tiễn nghiên cứu và ứng dụng của vi khuẩn lactic làm chế phẩm
probiotics đã nêu trên, chúng tôi lựa chọn thực hiện đề tài: “Phân lập, tuyển chọn và
nghiên cứu chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic từ mật và sáp ong”
2. Mục đích nghiên cứu
Tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotics từ mật và sáp
ong.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ mật ong và sáp ong.
3.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn.
3.3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng tuyển chọn.
3.4. Nghiên cứu một số đặc tính probiotics của chủng tuyển chọn.
3.5. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng tới sinh trƣởng của chủng
vi khuẩn lactic.
2

4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
Các chủng vi khuẩn lactic từ mật và sáp ong thu đƣợc ở một số khu vực
phía bắc Việt Nam.
5. Phƣơng pháp nghiên cứu
5.1. Phƣơng pháp vi sinh học: phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic từ mật và sáp
ong; các phƣơng pháp quan sát, nghiên cứu đặc điểm sinh học và xác định số
lƣợng tế bào vi khuẩn trong môi trƣờng nuôi cấy; các phƣơng pháp nghiên cứu
ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng và dinh dƣỡng tới sinh trƣởng và phát
triển của VSV; các phƣơng pháp bảo quản chủng giống VSV.
5.2. Phƣơng pháp hóa sinh: xác định hàm lƣợng đƣờng sót, định lƣợng axit tổng số.

thành công vi khuẩn lactic từ sữa chua và đặt tên là Bacterium lactis, nay gọi là
Streptococus lactis.
Từ đó đến nay, các nhà khoa học đã phát hiện rất nhiều loài vi khuẩn lactic
khác nhau trong nhiều loại cơ chất, từ thực phẩm lên men chua đến các loại hoa quả
tự nhiên và cả trên niêm mạc của ngƣời và động vật [3].
1.1.1. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn lactic
Căn cứ vào đặt điểm hình thái tế bào, ngƣời ta chia vi khuẩn lactic thành hai
nhóm: Hình que và hình cầu.
 Nhóm hình que có hình dạng tế bào thay đổi từ que ngắn (0.5 – 0.7 m)
đến que dài (3 – 8 m). Các tế bào này có thể ở dạng đơn, đôi hay tạo thành chuỗi
(ngắn, dài tùy loài). Thuộc về nhóm này là các loài thuộc chi Lactobacillus,
Bifidobacterium.
 Nhóm hình cầu có hình dạng tế bào biến đổi từ hình cầu đến hình ovan,
đƣờng kính khoảng 0.5 – 1 m. Các tế bào cũng có thể ở dạng đơn, đôi, tạo tứ cầu
hoặc tạo chuỗi ngắn hay chuỗi dài (tùy loài). Nhóm này gồm các loài thuộc chi
Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Enterococcus [5].
4

1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dƣơng, nói chung là bất động,
không sinh nội bào tử, catalaza và nitrate reductaza âm.
Vi khuẩn lactic lactic là các vi khuẩn hoá dị dƣỡng hữu cơ. Khả năng sinh
tổng hợp nhiều hợp chất cần cho sự sống của chúng rất yếu, cho nên, chúng là
những VSV khuyết dƣỡng đối với nhiều axit amin, bazơ nucleic và vitamin… Vi
khuẩn lactic không có khả năng tổng hợp các porphyrin (nhƣ Hem), bình thƣờng
chúng không có cytocrom. Song, một số vi khuẩn lactic khi sinh trƣởng trên các
môi trƣờng chứa máu có thể tạo thành các cytocrom và có thể tiến hành cả quá trình
phosphoryl hoá trong chuỗi hô hấp. Khi bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy các
porphyrin thì một số vi khuẩn lactic cũng có thể tổng hợp các sắc tố hemin tƣơng
ứng [3].

* Ảnh hưởng của nồng độ oxy
Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn kỵ khí tuỳ nghi và vi hiếu khí. Chúng thực
hiện quá trình lên men lactic cả trong điều kiện vi hiếu khí cũng nhƣ kỵ khí. Trong
quá trình lên men lactic, sự có mặt của oxy phân tử không gây độc với vi khuẩn
nhƣng sự lên men diễn ra thuận lợi hơn trong điều kiện yếm khí.
1.1.4. Trao đổi chất của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic có khả năng chuyển hóa kị khí đƣờng và tạo ra một lƣợng
axit lactic lớn thông qua quá trình lên men lactic. Lên men lactic là quá trình chuyển
hóa sinh hóa kị khí các hợp chất cacbonhydrat tạo năng lƣợng, axit lactic và một số
sản phẩm khác với sự tham gia của nhóm vi khuẩn lactic [3], [5].
Tùy theo cách chuyển hóa các hợp chất cacbonhydrat mà quá trình lên men
lactic có thể xảy ra theo phƣơng thức lên men đồng hình, lên men dị hình hoặc kết
hợp cả hai phƣơng thức trên.
 Lên men lactic đồng hình
Khi lên men đồng hình, vi khuẩn lactic phân giải cacbonhydrat theo con
đƣờng EMP (Embden – Meyerhof – Parnas) và cho sản phẩm chủ yếu là axit lactic
(90 – 98%) [6], do đó lên men lactic đồng hình rất có ý nghĩa trong công nghiệp sản
xuất axit lactic.
Phƣơng trình phản ứng tổng quát của quá trình lên men lactic đồng hình:
6 C
6
H
12
O
6
+ 2 ADP + 2 Pv 2CH
3

3
H
6
O
3
+ C
2
H
4
O
2
+ C
2
H
5
OH + 2CO
2
+ H
2
O + Q
Glucose Axit lactic Axit axetic Rƣợu ethylic
Các vi khuẩn lactic lên men dị hình là: Leuconostoc mensenteroides,
L.cremoris, Lactobacillus brevis, L. fermentum, L. viridescens, Bifidobacterium
bifidum, Leuconostoc, Weissella ….
1.1.5. Sự phân bố của vi khuẩn lactic
Các vi khuẩn lactic rất phổ biến trong tự nhiên. Chúng có trên bề mặt rau, củ,
quả, thịt, cá, tôm, sữa …. ; trong đất, phân, rác, xác động vật, thực vật. Trên niêm
mạc miệng, ruột của ngƣời, gia súc, gia cầm, ngƣời ta cũng phát hiện thấy sự có mặt
của vi khuẩn lactic. Vi khuẩn lactic có mặt nhiều nhất trong các loại thức ăn ủ chua
Vi khuẩn lactic

(*) Có khả năng ngăn cản đƣợc bệnh tiêu chảy. Cơ chế chống tiêu chảy có
thể đƣợc giải thích là do vi khuẩn laclic (1) tạo ra sự cân bằng cho khu hệ vi sinh
vật đƣờng ruột. (2) cạnh tranh về dinh dƣỡng và nơi khu trú với các vi sinh vật gây
bệnh. (3) tạo ra các sản phẩm trao đổi chất có tác dụng chống lại mầm bệnh. VD các
8

chủng L. casei, L. acidophilus, và L. bulgaricus có khả năng sản sinh ra các chất kháng
khuẩn nhƣ acidophilin, bulgarican có tác dụng kìm hãm sự sinh trƣởng của vi sinh vật
gây bệnh. (4) tăng cƣờng miễn dịch cho cơ thể vật nuôi, phòng chống đƣợc tiêu
chảy.
(**) Ngoài khả năng sinh axit lactic, làm giảm pH môi trƣờng, vi khuẩn
lactic còn sinh nhiều loại chất kháng khuẩn khác:
- Axit hữu cơ và ethanol: Các axit hữu cơ nhƣ axit lactic, axit formic, axit
propionic…và ethanol là các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic. Các sản
phẩm này có tác dụng làm giảm pH môi trƣờng đến mức có thể ức chế và tiêu diệt
một số VSV gây bệnh.
- Hydroperoxit (H
2
O
2
): Whater và cs (1951) đã chứng minh đƣợc
Lactobacilus lactic có khả năng tạo ra H
2
O
2
nên chúng kháng đƣợc Staphylococcus
aureus
- Diacetyl: có khả năng ức chế mạnh các vi khuẩn Gram âm, nấm mốc, đặc
biêt là vi khuẩn gây bệnh lao (Micrococcus tubeculosis).
- Bacteriocin: là các phân tử protein mang điện tích dƣơng, kích thƣớc nhỏ

 Tăng hấp thụ chất khoáng.
 Làm giảm cholesterol trong huyết thanh.
 Giảm tỉ lệ còi cọc và làm tăng năng suất vật nuôi.
 Giảm hàm lƣợng amoniac và ure trong chất thải.
 Phòng bệnh tiêu chảy cho vật nuôi, làm giảm tỉ lệ nhiễm bệnh, rút ngắn thời
gian bị bệnh, giảm tỉ lệ tái phát, giảm tỉ lệ chết…
10

1.2.4. Các chỉ tiêu để lựa chọn VSV làm probiotics
Bảng 1.1. Các chỉ tiêu để lựa chọn VSV làm probiotics
STT
Chỉ tiêu lựa chọn
Mục đích
1
Chịu đƣợc pH thấp
Sống đƣợc khi đi qua dạ dày và tá
tràng
2
Chịu đƣợc trong môi trƣờng có
nồng độ axit mật cao
Sống đƣợc khi đi qua phần ruột non
phía trên
3
Sản sinh axit từ glucose và lactose

Tăng hiệu suất tiêu hóa của vật nuôi
10
An toàn không gây bệnh cho vật chủ
Trên thực tế khó có chủng VSV nào đáp ứng đầy đủ các chỉ tiêu trên vì thế khi
tuyển chọn phải dựa vào mục đích cụ thể. Cân nhắc các tính chất của chủng để thu
đƣợc các chủng theo mục đích phù hợp [9], [21].
1.2.5. Nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm probiotics
 Trên thế giới
Công trình nghiên cứu đầu tiên ứng dụng probiotics đƣợc tiến hành trên lợn
do Pollman và cs công bố năm 1959 mang tên “Giá trị dinh dƣỡng và phòng trị
bệnh của việc cấy những chủng vi khuẩn lactic vào lợn con”. Tiếp theo năm 1987,
11

Nielsen và Trine đã nghiên cứu “Tác dụng ngăn chặn bệnh colibacilosis ở lợn sau
cai sữa của 5 chủng Lactobacillus” cho kết quả rất khả quan trong việc ngăn chặn
bệnh colibacilosis và giúp tăng trọng cho vật nuôi.
Tardani (1996) [25] và Zani (1998) [26] đã thí nghiệm chế phẩm B.cereus
trên lợn sau cai sữa thấy rằng tốc độ tăng trƣởng, hệ số thức ăn và tỷ lệ tiêu chảy
đƣợc cải thiện rất rõ.
Năm 1998, Oh Tae – Kwang đã sử dụng probiotics từ Lactobacillus sp. TSC
– 66 cho lợn [20]. Kết quả cho thấy chế phẩm probiotics từ VSV sống này có tác
dụng chống bệnh và kích thích sinh trƣởng cho vật nuôi.
Đến nay, trên thế giới đã có khá nhiều nƣớc sản xuất và ứng dụng rộng rãi
chế phẩm probiotics không những cho động vật mà còn cả ngƣời. Nhìn chung, tất
cả các công trình nghiên cứu đó chú trọng chủ yếu vào phòng, trị bệnh tiêu chảy và
giúp tăng trọng ở động vật nuôi.
 Ở Việt Nam
Probiotics đƣợc ứng dụng trong ngành chăm nuôi ở Việt Nam khá muộn, vào
những năm cuối của thế kỷ 19. Tuy vậy trên thị trƣờng hiện nay cũng đã xuất hiện
ngày một nhiều các chế phẩm probiotics cho ngƣời và vật nuôi.

hợp với nhiều vị thuốc khác để chữa trị những căn bệnh từ thông thƣờng đến nguy
hiểm.
Theo nhƣ phân tích thì mật ong là sản phẩm tự nhiên rất bổ dƣỡng với
khoảng 75-80% đƣờng (đƣờng trong mật ong là fructose và glucose, loại đƣờng
đƣợc hấp thụ trực tiếp vào máu); mật ong cũng rất giàu chất khoáng: phốt pho,
canxi, magiê…vài loại axit amin và enzyme…
Từ xa xƣa, mật ong đã đƣợc sử dụng nhƣ là một loại thuốc kháng khuẩn,
dùng để băng bó vết thƣơng và điều trị những bệnh liên quan đến rối loạn chức
năng cơ thể. Trong mật ong có chứa chất bảo vệ các vết thƣơng không bị nhiễm
trùng. Ðể giải thích cơ chế làm cho vết thƣơng lành bệnh khi dùng mật ong có nhiều
ý kiến cho rằng: Thứ nhất, trong mật ong có mặt hai loại đƣờng là glucose và
fructose, hai loại đƣờng này thƣờng thu hút nƣớc mạnh, mật ong sẽ hấp thụ nƣớc ở
vết thƣơng, làm khô vùng thƣơng tích, chính điều kiện này làm môi trƣờng không
thuận lợi cho các vi khuẩn và nấm phát triển (VSV thƣờng phát triển mạnh trong
một môi trƣờng ẩm). Ðiều quan trọng thứ hai là mật ong có chứa một enzyme gọi là
glucose oxidase, khi kết hợp với nƣớc, sản xuất hydrogen peroxide, một chất có tính
khử trùng cao. Một nghiên cứu của trƣờng Ðại Học Bonn (Ðức) đã xác nhận đặc
13

tính kháng khuẩn kỳ diệu của mật ong, nhƣ y học dân gian đã khẳng định. Sáp ong
có rất nhiều tác dụng trong y dƣợc học, điển hình nhƣ: (1) Làm giảm cholesterol
trong máu và giảm đau; (2) chống viêm, chống loét (VD: viêm loét dạ dày, tiêu
chảy…); (3) kháng nấm và kháng sinh tự nhiên; (4) điều hòa hệ miễn dịch, ức chế
và kích thích hệ miễn dịch [29].
Sáp ong có khả năng điều trị bỏng da hiệu quả, giúp làm mềm và giữ ẩm cho
da. Trong công nghệ bào chế dƣợc phẩm, sáp ong còn đƣợc sử dụng làm tá dƣợc.
Trong công nghiệp, sáp ong là một chất nhũ hóa hiệu quả hay đƣợc sử dụng nhƣ là
một loại hƣơng liệu trong sản xuất xà phòng và nƣớc hoa.
(Nhật), FeSO
4
.7H
2
O (Merck, Đức), NaOH (Merck, Đức), NaCl (Việt
Nam), MgSO
4
.7H
2
O (Trung Quốc), Glucose (Việt Nam), CH
3
COONa (Trung Quốc),
MnSO
4
.4H
2
O (Anh), CaCO
3
(Việt Nam), (NH
4
)
3
C
6
H
5
O
7
(Trung Quốc), Na
2

.4H
2
O 0.05
Glucose 20.0 CH
3
COONa 5.0
Aga 20.0 Tween 80 1.0 ml
Nƣớc cất 1000 ml NaH
2
PO
4
2.0
2.1.4.2. Môi trường nuôi cấy và giữ giống VSV kiểm định – MPA
Thành phần (g/l)
Cao thịt 5.0
Pepton 5.0
NaCl 5.0
Aga 20.0
Nƣớc cất 1000ml
2.1.4.3. Môi trường thay thế nuôi cấy vi khuẩn lactic
Nghiền nhỏ 250g nguyên liệu hữu cơ (bắp cải, rau má, cải ngọt, hành) trong
1l nƣớc, lọc lấy dịch trong, thu đƣợc 1l dịch chiết tự nhiên 25%.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phân lập vi khuẩn lactic từ mật và sáp ong
Phân lập trực tiếp trên môi trƣờng MRS có CaCO
3

 Nguyên tắc
Dựa vào đặc tính sinh axit của các chủng vi khuẩn lactic, làm tan CaCO
3