1LỜI CẢM ƠN
Luận văn này được thực hiện tại Trung tâm hỗ trợ nghiên cứu khoa học
và chuyển giao công nghệ - Đại học Sư phạm Hà Nội 2 và phòng miễn dịch
học thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học Sự sống, Trường Đại học Khoa
học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội.
Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS. TS. Đỗ Ngọc
Liên giảng viên cao cấp khoa Sinh học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,
đã giao đề tài, tận tình giúp đỡ, động viên, khuyến khích tôi trong suốt quá
trình học tập, cũng như chỉ bảo, hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
tôi trong suốt quá trình thực hiện Luận văn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc Trung tâm hỗ trợ nghiên
cứu khoa học và chuyển giao công nghệ - Đại học Sư phạm Hà Nội 2, các cán
bộ và các em học viên – Phòng Miễn dịch học của Trung tâm nghiên cứu
khoa học Sự sống , Trường Đại học khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà
Nội đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện Luận văn.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới gia đình, bạn bè
và người thân, những người luôn quan tâm, chăm sóc, động viên, khích lệ,
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và làm việc.
Xin trân trọng cảm ơn !
Hà nội, ngày tháng năm
2011
Học viên
Phí Thị Phượng


1.2.3. Tannin 11
1.2.4. Alkaloid 13
1.3. BNH I THO NG (T) 14
1.3.1. Khỏi nim 14
1.3.2. Tiờu chun chn oỏn T 15
1.3.3. Phõn loi v c ch sinh bnh ca T 16
1.3.4. Tỡnh hỡnh bnh T trờn th gii 19
1.4. BNH BẫO PHè 20
1.4.1. Khỏi nim v phõn loi bnh bộo phỡ 20
1.4.2. Thc trng bộo phỡ trờn th gii v Vit Nam 21
1.4.3. Nguyờn nhõn gõy ra bộo phỡ 21
1.4.4. Tỏc hi ca bnh bộo phỡ 22
1.4.5. Ri lon trao i lipid mỏu 23
1.4.6. Mi quan h gia bộo phỡ vi ỏi thỏo ng 24

4

1.5 . CC THUC IU TR I THO NG 25
1.5.1. T theo quan nim ca Y hc c truyn 25
1.5.2. T vi y hc hin i 26
Chơng 2 : đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 28
2.1. Đối tợng nghiên cứu 28
2.1.1. Nguyên liệu thực vật 28
2.1.2 Nguyên liệu động vật 28
2.1.3. Dụng cụ, hoá chất thí nghiệm 30
2.2. Phơng pháp nghiên cứu 31
2.2.1 Phơng pháp chiết cao tổng số và các phân đoạn hợp chất tự nhiên 31
2.2.2. Khảo sát sơ bộ thành phần hoá học của vỏ quả quất cảnh 32
2.2.3. Nghiên cứu tác dụng hạ đờng huyết của các phân đoạn dịch chiết từ
vỏ quả quất cảnh 36


6DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Phân loại BMI của người châu Âu và người châu Á 20
Bảng 2.1. Thành phần thức ăn nuôi chuột béo phì 29
Bảng 2.2. Kết quả xây dựng đồ thị chuẩn acid gallic 35
Bảng 2.3. Điều trị chuột ĐTĐ bằng các phân đoạn dịch chiết vỏ quả quất cảnh 38
Bảng 3.1. Hiệu suất tách chiết các phân đoạn từ vỏ quả quất cảnh 42
Bảng 3.2. Thành phần một số hợp chất tự nhiên trong các dịch chiết vỏ quả
Cây quất cảnh(Fortunella japonia Thunb 43
Bảng 3.3. Hàm lượng hợp chất polyphenol tổng số trong các chế phẩm từ vỏ
quả Cây quất cảnh 45
Bảng 3.4. Đặc điểm các băng vạch của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả
quất trên sắc ký đồ 47
Bảng 3.5. Kết quả thử độc tính theo đường uống 48
Bảng 3.6. Trọng lượng tính theo (g) của các lô chuột sau 6 tuần tiến hành gây
mô hình béo phì thực nghiệm 50
Bảng 3.7. Một số chỉ số hoá sinh của chuột bình thường và chuột béo phì sau
6 tuần nuôi ở hai chế độ ăn khác nhau 52
Bảng 3.8. Nồng độ glucose huyết(mmol/l) của chuột trước và sau khi tiêm
STZ 55
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết đến nồng độ glucose
huyết(mmol/l) của chuột ĐTĐ type 2 59
Bảng 3.10. Nồng độ glucose huyết ( mmol/l) của chuột ĐTĐ type 2 sau 21
ngày điều trị 61

8

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

BMI Chỉ số khối cơ thể ( Body Mass Index)
BPTN Béo phì thực nghiệm
CHCl
3
Chloroform
ĐC Đối chứng
ĐT Điều trị
ĐTĐ Đái tháo đường
EtOAc Ethylacetat
HDL - c High density lipoprotein – cholesterol ( Lipoprotein tỷ trọng
cao)
HFD Thức ăn có hàm lượng chất béo cao ( High Fat Diet)
KĐT Không điều trị
LDL – c Low denstity lipoprotein-cholesterol( Lipoprotein tỷ trọng thấp)
MeOH Methanol
Met Metformin
ND Thức ăn chuẩn ( Normal Diet)
PĐ Phân đoạn
TG Triglycerid
TC Cholesterol toàn phần
WHO Tổ chức y tế thế giới (Wold Health Organization) 9


10
điều trị béo phì và đáI tháo đờng ( ĐTĐ). Tuy nhiên, hầu hết các loại thuốc
tân dợc này đều có thể có tác dụng phụ nguy hiểm, cha kể tới việc hiện nay
trên thị trờng có nhiều loại thuốc đợc quảng cáo là có tác dụng chống béo
phì song những loại thuốc này đều không có cơ sở khoa học. WHO
Tổ chức y
tế thế giới ( Wold Health Organization)
cũng đã khuyến cáo nên nghiên cứu
phát triển các loại thuốc có nguồn gốc từ thảo dợc, đặc biệt là ở các nớc
nhiệt đới có tài nguyên thực vật phong, phú nền kinh tế đang phát triển vì
nguyên liệu sẵn có, rẻ tiền và ít tác dụng phụ.[23], [31], [32], [44], [54]
Cây quất cảnh Fortunella japonia (Thunb) đợc trồng rộng rãi ở
nớc ta, đặc biệt là vào dịp Tết Nguyên Đán. Nhân dân ta từ lâu đã biết sử
dụng quất trong các bài thuốc để chữa nhiều loại bệnh, trong đó có những bài
thuốc có tác dụng chống bệnh béo phì rất hiệu quả. Ngoài ra, các nhà khoa
học Nhật cho biết, ăn quất cả vỏ sẽ cho vitamin C, chất xơ rất có lợi cho tiêu
hóa và hạ đợc cholesterol, làm vững chắc thành mạch, chữa bệnh tăng huyết
áp. Tuy vậy, tác dụng chống béo phì của nó ít thấy đợc ghi nhận trong các tài
liệu nghiên cứu sinh dợc học.[2], [5]
Từ những thực tế nêu trên, nhằm góp phần tìm kiếm và nghiên cứu
thuốc điều trị béo phì và rối loạn trao đổi lipid - glucid, tìm hiểu thành phần
hoá học cơ bản của quả quất chúng tôi thực hiện đề tài mang tên: " Nghiên
cứu tác dụng hạ đờng huyết của dịch chiết từ vỏ quả quất cảnh
Fortunella japonia (Thunb) Swingle trên mô hình chuột thực nghiệm "
2. Mục đích nghiên cứu.
Nghiên cứu đặc tính sinh dợc học của một số hợp chất tự nhiên từ dịch
vỏ quả quất cảnh (Fortunella japonia (Thunb) Swingle) với tác động chính là
hạ đờng huyết trên mô hình chuột ĐTĐ thực nghiệm nhằm tạo cơ sở cho

11

- Thức ăn vỗ béo đợc phối chế từ thực phẩm giầu chất béo theo tiêu
chuẩn của viện Dinh dỡng Quốc gia và theo phơng pháp của Soon et al,
2002 [ 56], Srinivasan et al, 2005[57]
4.2. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu đặc tính sinh dợc học của một số phân đoạn dịch chiết (cao
ethanol, n- hexan, clorofom, ethlaxetate,) từ vỏ quả quất cảnh Fortunella
japonia trên mô hình chuột đã gây ĐTĐ phỏng theo type 2.[45],[57]
5. Phơng pháp nghiên cứu
5.1. Phơng pháp định tính thành phần hoá học của vỏ quả quất cảnh
5.2 Định lợng hợp chất phenolics tổng số theo phơng pháp Folin -
Ciocalteau
5.3 Phơng pháp phân lập các hợp chất bằng kỹ thuật sắc kí lớp mỏng
5.4 Xây dựng mô hình chuột thí nghiệm
- Chuột béo phì thực nghiệm, ĐTĐ type 2
5.5 Phơng pháp định lợng một số chỉ số hóa sinh.
5. 6 Phơng pháp xử lý thống kê.
6. Đóng góp mới của đề tài
- Đa ra quy trình tách chiết có hiệu quả các phân đoạn các hợp chất tự
nhiên từ vỏ quả quất cảnh
- Phân lập một số hợp chất bằng sắc ký mỏng, định tính, định lợng một
số hợp chất tự nhiên từ vỏ quả quất cảnh
- Đánh giá đợc tác dụng hạ glucose huyết của một số phân đoạn dịch
chiết từ vỏ quả quất cảnh Fortunella japonia lên mô hình chuột ĐTĐ mô
phỏng type 2 .

13


Tết Nguyên Đán nên việc thu mẫu với số lợng lớn rất dễ dàng [2].
1.1.2. Thành phần hóa học
Lá và quả có chứa tinh dầu, dịch quả có chứa đờng và các acid hữu cơ.
Quả quất giàu pectin, vitamin C (tỷ lệ 0,13 0.24 mg).
Ngời ta đã tách và xác định đợc thành phần một số chất chứa trong
tinh dầu quất nh: linonene (93,73%), myrcene (1,84%), ethylacetate
(1,13%). Ngoài ra còn một số chất nh camphene, terpinen-4-ol, citronellyl
formate, citronellyl acetate [5], [10].
1.1.3. Công dụng của cây quất
Nhân dân ta từ xa đã biết sử dụng quất trong các bài thuốc dân gian để
chữa nhiều loại bệnh. Trong cuốn Việt Nam dợc học, Phó Đức Thành đã viết:
quất là loại thuốc có tác dụng chữa các bệnh về gan, dạ dày, thông xuất thủy
ách, tiêu hóa thực tích, trừ ách nghịch, chữa tiêu khát, giải tửu độc, trừ uế khí.
Về dợc tính, tiến sĩ Elzbieta Kurowska (làm việc cho một công ty dợc
của Canada tại Mỹ có tên là Synergize) và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm
trên những con chuột đồng đợc vỗ béo bằng một chế độ dinh dỡng giàu
cholesterol, rồi cho chúng hấp thu chất polymethoxylated flavones (PMF) (
thực chất là những yếu tố chống oxy hoá tích cực thuộc nhóm flavonoid) tách
từ vỏ quả cam, quất, quýt Kết quả cho thấy chỉ 1% PMF trong khẩu phần ăn
hàng ngày cũng làm giảm tới 40% lợng cholesterol độc hại LDL nguyên
nhân gây ra các bệnh tim mạch - ở số chuột thí nhiệm [5], [10].
1.2. Hợp chất phenolic
1.2.1. Phân loại và vai trò của hợp chất phenolic trong thực vật
Phân loại. Hợp chất phenolic là nhóm các chất khác nhau rất phổ biến
trong thực vật. Đặc điểm chung của chúng là trong phân tử có vòng thơm 16

(benzen) mang một, hai hay ba nhóm hydroxyl (OH) gắn trực tiếp vào vòng

17

chất phenol tác dụng nh chất điều hoà các chất điều khiển sinh trởng ở thực
vật.
- Hợp chất phenol có tính chất kháng khuẩn. Những hợp chất phenol
bảo vệ thờng không đợc tổng hợp ở cây khỏe. Nó đợc hình thành nh
những phản ứng tự vệ đối với các vết thơng do vi khuẩn gây bệnh gây nên
tơng tự nh phản ứng kháng nguyên - kháng thể ở ngời và động vật. Các
hợp chất phenol có vai trò quan trọng trong việc liền sẹo do vết thơng cơ học
ở thực vật. Nó có tác dụng đẩy nhanh quá trình tái sinh, chống bức xạ, gốc tự
do, tác nhân gây đột biến và các chất gây oxy hoá.
- Hàm lợng và thành phần các polyphenol phụ thuộc nhiều vào nhân tố
sinh thái. Ví dụ: trong điều kiện lạnh, cây tích luỹ nhiều antoxyan xanh và
tím. Các flavonoid nh flavonol và antoxyan có vai trò trong việc điều chỉnh
sự phân bố năng lợng ánh sáng ở lá cây, làm tăng hiệu quả quang hợp. Một
số hợp chất polyphenol tạo màu sắc tự nhiên của hoa quả, hấp dẫn côn trùng
thụ phấn cho hoa.
1.2.2. Flavonoid thực vật
Trong số các chất polyphenol tự nhiên, flavonoid là nhóm chất quan
trọng vì chúng phổ biến ở hầu hết các loài thực vật và có nhiều hoạt tính Sinh -
dợc học có giá trị [3], [7], [12], [18], [29], [30], [33], [42].
1.2.2.1. Cấu tạo hoá học
`Các flavonoid là dẫn xuất của 2-phenyl chroman (flavan). Chúng là các
hợp chất có cấu tạo gồm 2 vòng benzen A, B đợc kết hợp bởi một dị vòng C
với khung cacbon C
6
-C
3
-C
6

3
và nhóm cacbonyl ở C
4
mà có thể phân biệt
flavonoid thành các nhóm phụ sau: flavon, flavonol, flavanon, chalcon và
auron, antoxyanidin, leucoantoxyanidin, catechin, isoflavonoid, rotenoid,
neoflavonoid. Trong đó nhóm có độ oxy hóa cao nhất là flavonol, nhóm có độ
oxy hóa thấp nhất là catechin.
Flavonoid tồn tại ở hai dạng: dạng tự do gọi là aglycon và dạng liên
kết với đờng gọi là glycoside. Các glycoside khi bị thuỷ phân bằng acid
hoặc enzyme sẽ giải phóng ra đờng và aglycon tơng ứng. Trong tự nhiên
trừ catechin và leucoantoxyanidin, phần lớn flavonoid đều tồn tại dới
dạng glycoside. Có 2 dạng glycoside là O-glycoside và C-glycoside. Đối
với O-glycoside, phân tử đờng liên kết với flavonoid thông qua nhóm
hydroxyl nh rutin, đối với C-glycoside liên kết với đờng thông qua
nguyên tử cacbon nh saponin .

OH
O
OH
Glucose

Rutin
Saponin
Hình 1.3. Rutin và saponin
1.2.2.2. Tính chất vật lý
ở dạng tinh khiết flavonoid là chất kết tinh hay vô định hình và có nhiệt
độ nóng chảy nhất định. Chúng có màu vàng nh flavon, flavonol, chalcon
hoặc không màu nh isoflavonoid, catechin. Các aglycol của flavonoid hoà
tan tốt trong dung môi hữu cơ nh: ether, EtOH (ethanol), acetone và hầu nh

Phản ứng Shinoda: đây là phản ứng khử có sự tham gia của kim loại
nh Zn, Mg, Fe và HCl cho sản phẩm màu da cam, hồng hay đỏ.
Phản ứng tạo phức với kim loại.
1.2.2.4. Tác dụng sinh học
- Tác dụng chống oxy hoá (antioxydant): Flavonoid có khả năng kìm
hãm các quá trình oxy hoá dây chuyền sinh ra bởi gốc tự do hoạt động.
Những flavonoid có các nhóm hydroxyl sắp xếp ở vị trí octo dễ dàng bị oxy
hoá dới tác dụng của các enzyme polyphenoloxydase và peroxydase tạo
thành dạng semiquinon hoặc quinon.

O
2
+ Flavonoid (dạng khử)

Flavonoid (dạng oxy hóa)

H
2
O
2
+ Flavonoid (dạng khử)

Flavonoid (dạng oxy hóa)

(Dạng Hydroquinon)

(Semiquinon hoặc Quinon)

1.2.3. Tannin
1.2.3.1. Cấu trúc hoá học và phân loại
Tannin là hợp chất phenol có trọng lợng phân tử cao, có chứa các nhóm
chức hydroxyl và các nhóm chức khác (nh cacboxyl), có khả năng tạo phức với
protein và các phân tử lớn khác trong điều kiện môi trờng đặc biệt [24].
Tannin đợc cấu tạo dựa trên gallic acid và tanic acid. Tannin có 2
nhóm chính: tannin thuỷ phân và tannin ngng tụ.
- Tannin thuỷ phân: Gồm có các tannin mà thành phần chính để tạo
polyme thờng là este của gallic acid với gốc đờng, các este không mang
đờng của phenolcacbonic acid và este của ellagovic acid với đờng. 21

- Tannin ngng tụ: là các oligome hay polyme của các đơn vị flavonoid
(flavan 3-ol) nối với các dây nối C - C không bị cắt khi thuỷ phân nh
catechin, epicatechin hoặc các chất tơng tự. Tannin ngng tụ có thể có từ 2
tới 50 hay hơn các đơn vị flavonoid. Tannin ngng tụ đợc xếp vào nhóm
flavonoid theo nghĩa rộng vì có nguồn gốc giống nh của flavonoid [24].
1.2.3.2. Tính chất vật lý
Tannin thờng là hợp chất vô định hình hoặc tinh thể, không màu,
có tính quang học, vị chát. Tannin tan trong nớc tạo dung dịch keo và độ
hoà tan thay đổi tuỳ thuộc vào mức độ polyme hoá. Chúng tan tốt trong
ethanol, acetone.
1.2.3.3. Tính chất hóa học
- Tannin dễ bị oxi hóa khi đun nóng hay để ngoài ánh sáng. Khi bị oxy
hóa, tannin biến thành chất màu đỏ hoặc màu nâu hoặc màu đen xám.
- Tannin phản ứng với sắt clorid. Chúng cũng tủa với muối kim loại
nặng và gelatin. Ngời ta dựa vào tính chất này để tách tannin.
- Tannin có thể tạo phức với protein, tinh bột, cellulose, muối khoáng

Nicotin
Hình 1.4. Cafein và nicotin
1.2.4.1. Tính chất vật lý
ở nhiệt độ thờng, đa số các alkaloid trong công thức cấu tạo có oxy
thờng ở thể rắn (ví dụ cafein), alkaloid không có oxy thờng ở thể lỏng dễ
bay hơi (ví dụ nicotin). Đa số các alkaloid không màu, không mùi, vị đắng.
Một số alkaloid có màu vàng nh berberin, palmitin.
Alkaloid ở dạng bazo thờng không tan trong nớc mà tan trong dung
môi hữu cơ ít phân cực nh: ether, CHCl
3
, benzen, EtOH. Trái lại, các alkaloid
ở dạng muối thờng dễ tan trong nớc và hầu hết không tan trong dung môi
không phân cực [37].
1.2.4.2. Tính chất hóa học 23

Tính chất quan trọng nhất của các alkaloid là tính kiềm, tính chất
này là do mạch cacbon chứa nitơ quyết định.

Ngời ta thấy các amin mạch
thẳng hoặc vòng bão hoà có tính bazo mạnh, nhóm amin nằm trong nhân
thơm có tính bazo yếu.
Alkaloid có tính kiềm yếu nên có thể giải phóng alkaloid ra khỏi
muối của nó bằng kiềm mạnh hay trung bình nh: NH
4
OH, MgO, NaOH. Khi
tác dụng với acid, alkaloid tạo muối tơng ứng.
Alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, Pb) tạo ra muối phức.

Theo định nghĩa của các chuyên gia thuộc Ủy ban chẩn đoán và
phân loại ĐTĐ tháng 1 năm 2003, thì ĐTĐ hay bệnh tiểu đường là một
bệnh rối loạn chuyển hóa, được đặc trưng bởi sự tăng đường huyết mãn
tính do hậu quả của sự thiếu hụt hoặc giảm hoạt động của insulin hoặc kết
hợp cả hai. Tăng glucose máu mãn tính thường kết hợp với sự hủy hoại,
rối loạn chức năng của nhiều cơ quan đặc biệt là mắt, thận, thần kinh, tim,
và mạch máu [1], [23].
1.3.2. Tiêu chuẩn chẩn đoán ĐTĐ
Theo tổ chức Y tế thế giới, ĐTĐ được chẩn đoán xác định khi có ít nhất
một trong ba tiêu chuẩn sau:
- Mức glucose huyết tương ở thời điểm bất kỳ ≥ 11,1 mmol/l
(200mg/dl)
- Mức glucose huyết tương lúc đói ≥ 7,0 mmol/l (126mg/dl)
- Mức glucose huyết tương ≥ 11,1 mmol/l (200mg/dl) ở thời điểm sau
nghiệm pháp dung nạp glucose bằng đường uống 75 g đường uống (loại khan)
hoặc 82,5 g đường (loại một phân tử nước) [1,63,64].
1.3.3. Phân loại và cơ chế sinh bệnh của ĐTĐ
Trước đây, bệnh ĐTĐ được phân loại thành ĐTĐ phụ thuộc insulin
(loại bắt buộc phải dùng insulin) và ĐTĐ dùng thuốc chữa (theo cách phân
loại của Tổ chức Y tế thế giới năm 1985). Nhưng từ năm 2000 trở lại đây, lại
có khuynh hướng ưa dùng ĐTĐ týp 1 và ĐTĐ týp 2 dựa trên những hiểu biết
về nguyên nhân gây bệnh.
1.3.3.1. ĐTĐ týp 1 (ĐTĐ phụ thuộc insulin) (IDDM: insulin-dependent
diabetes mellitus) [1],[15],[63],[64]. 25

ĐTĐ týp 1 là do tế bào β của tụy bị tổn thương, không sản xuất ra được
insulin dẫn đến hiện tượng thiếu hụt insulin hoàn toàn. Đây là týp ĐTĐ nặng