1
Bộ giáo dục và đào tạo
Trờng đại học s phạm hà nội 2

Nguyễn huy trí
Phân tách bằng các phơng pháp sắc ký và
nghiên cứu một số tính chất của ribonuclease
từ nọc rắn hổ mang

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30 Luận văn thạc sĩ sinh học
Ngời hớng dẫn khoa học: NCVC. TS NGUYễN VĂN THIếT

thống chống virus ở người như 2 enzyme RNase 2 và RNase 3 do các bạch cầu ưa
eosin (bạch cầu ưa acid) tiết ra.
Những năm gần đây ngoài việc tìm ra một số RNase nguồn gốc tự nhiên có
đặc điểm như onconase & BS-RNase, các nhà khoa học còn nghiên cứu tạo ra các
chế phẩm RNase nhân tạo có hoạt tính chống ung thư, nhờ vận dụng các phương
pháp sinh học phân tử và công nghệ gen. Dạng biến thể của RNase được tạo ra bằng
cách thay thế một hoặc một vài gốc amino acid cần cho tương tác với protein ức chế
(RI) hoặc tạo thêm liên kết disunfide làm tăng độ bền vững cấu trúc và giảm bớt sự
nhạy cảm với protein trong tế bào. Các nghiên cứu này đã mở ra một hướng nghiên

3
cứu mới trong lĩnh vực hóa dược nhằm sản xuất ra những chế phẩm dược cao cấp
trên cơ sở RNase để phòng chống ung thư.
Nọc rắn là nguồn dược liệu cổ truyền quý, không phải ngẫu nhiên mà biểu
tượng của toàn ngành Y trên thế giới là hình ảnh con rắn đang nhả nọc.
Nọc rắn xử lý hết độc có tác dụng:
- Chống đông, chống hình thành huyết khối, giảm fibrinogen, độ dính của
máu, độ ngưng kết của tiểu cầu.
- Có tác dụng giảm đau rõ rệt: Nọc độc rắn với liều 0,188 mg/kg có tác dụng
giảm đau 3 - 4 lần morphin với liều 1mg/kg mà không gây nghiện. Có thể trị các
loại đau thần kinh, ung thư.
- Có tác dụng chống ung thư.
(Theo kết quả nghiên cứu dược lý hiện đại).
Đáng chú ý là những chất mới được phát hiện trong nọc rắn, nuôi dưỡng sự
hình thành các tế bào thần kinh mới có ý nghĩa với các bệnh nhân mắc bệnh
Alzheimer và những bệnh khác mà tế bào thần kinh trong não chết đi.
Để góp phần tìm hiểu thêm về các RNase tự nhiên có khả năng có hoạt tính
cytotoxin trong nguồn tài nguyên đa dạng và phong phú của Việt Nam. Chúng tôi
chọn đề tài nghiên cứu RNase từ nọc rắn nhằm tìm hiểu tính chất của enzyme này.
Luận văn của tôi có tiêu đề: “Phân tách bằng các phương pháp sắc kí và

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ NHÓM RNASE
1.1. Lịch sử nghiên cứu
RNase (RNase) bắt đầu được nghiên cứu từ năm 1920 khi Walter Jones phát
hiện ra một chất tác từ tuyến tụy có khả năng thủy phân acid nucleic của nấm men,
mặc dù vào thời điểm này cấu trúc hóa học của acid nucleic nói chung và acid
ribonucleic (ARN) nói riêng còn chưa được biết đến. Sau đó Dubos và Thompson
khi tinh sạch ARN cũng phát hiện ra chất này và đặt tên là RNase vì chúng tham gia
vào quá trình depolymer hóa ARN. Tới năm 1940, Kunitz đã kết tinh được RNase,
tạo điều kiện thuận lợi cho các nghiên cứu sau này. Vào đầu những năm 1950, ba
nhà khoa học Salganik (Liên Xô), Bernet (Úc), Leclerk (Bỉ) đã tiến hành những thử
nghiệm đầu tiên về khả năng chữa bệnh virus bằng nuclease nói chung và RNase
nói riêng [6461]. Kết quả bước đầu cho thấy các enzyme này có khả năng kìm hãm
sự phát triển của một số loại virus gây bệnh như ospovaxin, herpes, adenovirus
(chứa ADN) hay virus viêm não, viêm tủy, virus cúm (chứa ARN). Năm 1958, Sie
Kevitz Palade đã xác định nơi khư trú của enzyme này là tuyến tụy nhờ kỹ thuật
kháng thể huỳnh quang.
Những năm 1960-1970 nhờ ưu thế về nguồn vật liệu, khả năng tinh chế cũng
như kích thước phân tử nhỏ (~ 14kDa), RNase tuyến tụy bò (RNase A, EC 3.1.27.5)
trở thành mô hình mẫu trong các nghiên cứu về enzyme nói riêng và nghiên cứu về
protein nói chung. RNase A là enzyme đầu tiên được xác định trình tự amino acid
và là enzyme thứ 3 được xác định cấu trúc 3D (sau lysozyme và carboxy-peptidase
A). Vào năm 1972 giải thưởng Nobel hóa học đã được trao cho Stanford Moor,
William Stein và Christian Anfinsen với những công trình nghiên cứu của họ về
RNase. Năm 1984 Bruce Merifield đã vinh dự nhận giải thưởng cao quý này với
công trình nghiên cứu cũng liên quan đến RNase A [50, 51, 52]. Từ những năm
cuối thập kỷ 80 tới nay, nhiều nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu theo hướng ứng



7
3. Theo sản phẩm thủy phân: Liên kết phosphodiester bị thủy phân từ phía
nào của phân tử ARN, tạo thành sản phẩm 5’-phosphate hay 3’-phosphate. Một số
exonuclease chỉ tác động vào phân tử polynucleotide từ phía đầu 3’, số khác lại chỉ
tác động vào phía đầu 5’.
4. Theo tính đặc hiệu với bazơ trong đơn vị nucleotide liền kề với nucleotide
bị thủy phân: Tính đặc hiệu này của nhiều enzyme là không đáng kể. Chẳng hạn các
RNase thực vật và Escherichia coli (EC 3.1.27.1) thủy phân các liên kết theo vị trí
3’ của cả purine và pyrimidine nucleotide; RNase tuyến tụy (EC 3.1.27.5) chiếm vị
trí trung gian: Thủy phân các liên kết theo vị trí 3’ của pyrimidine nucleotide bất kỳ.
Trong khi đó, enzyme mã số EC 3.1.27.3 là endonuclease đích thực, thủy phân
ARN ở vị trí 3’ của gốc Guanine nucleotide.
5. Tính đặc hiệu cấu trúc: mạch đơn hay mạch kép (đa số các nuclease thể
hiện độ đặc hiệu cao theo dấu hiệu này).
6. Tính đặc hiệu trình tự nucleotide…
Một số dấu hiệu trên được tính đến trong hệ thống phân loại enzyme vào
năm 1978. Trong hệ thống phân loại mới này, 14 phân nhóm nuclease được đưa vào
để phân loại nuclease tốt hơn. Chắc chắn trong thời gian tới hệ thống phân loại
nuclease nói chung và RNase nói riêng còn thay đổi khi cấu trúc và chức năng của
nhiều enzyme được phát hiện thêm [20]. Tuy vậy, trong mọi trường hợp một RNase
(hay nuclease) bất kỳ mà ta quan tâm luôn nằm trong sơ đồ chung phân loại
nuclease như sau:
- Phân loại nuclease dựa trên tính đặc hiệu cơ chất, phân biệt:
+ DNase (thủy phân ADN).
+ RNase (thủy phân ARN).
+ Nuclease hỗn tạp hay không đặc hiệu (theo gốc) đường thủy phân cả
ADN và ARN.
- Phân loại nuclease dựa trên vị trí liên kết bị thủy phân, phân biệt:
+ Endonuclease.

H
907
N
171
O
192
S
12
với khối lượng phân tử chính xác M
r
= 13686 Da [50, 51, 52].
Về hình dạng, RNase A giống như quả thận, các gốc amino acid của trung
tâm hoạt động nằm trong vùng “hốc” (cleff) - là vùng lõm của quả thận [51]. Cấu
trúc bậc hai điển hình của RNase A gồm 4 phiến cấu trúc  nằm song song ngược
chiều kề bên cạnh 3 chuỗi xoắn  ngắn. Trong phân tử có 4 cầu nối disulfide được
tạo thành từ 8 gốc Cysteine ở các vị trí 26-84, 40-95, 58-110 và 65-72. Các cầu nối
này có thể bị phá vỡ bởi lượng -mercaptoethanol dư thừa, tạo thành 8 nhóm SH tự
do dẫn tới sự biến tính và làm mất hoạt tính của enzyme [26, 51].

9
Hầu hết các RNase thuộc siêu họ RNase A đều có cấu trúc monomer, duy chỉ
có RNase trong tinh dịch bò (BS-RNase) có cấu trúc bậc 4 (dimer) [15, 17]. BS-
RNase được tách ra ở dạng dimer trong đó hai tiểu đơn vị thành phần nối với nhau
bởi hai cầu disunfide [1917]. Enzyme này là một đồng đẳng của RNase A, ở trạng
thái cân bằng một hỗn hợp gồm 2 cấu trúc bậc IV hoàn toàn khác nhau [36].
Trung tâm hoạt động của RNase A ngoài hai nhóm chức tham gia trực tiếp
vào quá trình xúc tác là nhóm imidazol của các gốc His-12 và His-119 (trong đó
một nhóm đóng vai trò như một acid, một nhóm đóng vai trò như một bazơ trong
quá trình xúc tác) còn có mạch bên của các gốc Lys-7, Lys-41, Lys-66, Asp-121 và
mạch carbon chính của gốc Phe và Gly-11 [13, 20, 28].

RNase người đầu tiên có hoạt tính kháng khuẩn, kháng côn trùng và độc với tế bào
thần kinh. Hoạt tính nuclease của ECP thấp hơn nhiều so với RNase 2 nhưng các
đặc tính xúc tác bình thường thì gần như không đổi so với RNase 2. Tuy vậy hoạt
tính ribonucleolytic của ECP lại không cần thiết cho hoạt tính kháng khuẩn [22, 55,
61].
3.4. RNase 4
RNase 4 có trình tự amino acid tương đồng 43% với RNase 1, 31% với
RNase 2 và 30% với RNase 3. Enyme này cũng tương đồng với RNase gan bò và
gan lợn tới 90%, điều này chứng tỏ tính bảo thủ của RNase là rất lớn [55, 61].
3.5. RNase 5 (Angiogenin)
Angiogenin có trọng lượng phân tử là 14 400 Da và giống RNase A tới 65%
về trình tự amino acid, 3 trong 4 cầu disunfide và các gốc amino acid chức năng chủ
yếu trong TTHĐ của RNase vẫn được bảo tồn ỏ angiogenin. So với RNase 1, 2 và 4
thì trình tự amino acid của angiogenin tương đồng lần lượt là 35%, 27% và 39%.
Angiogenin có tính đặc hiệu yếu với cơ chất chuẩn của RNase nhưng bù lại, hoạt
tính ribonucleolytic của angiogienin lại rất quan trọng trong việc hình thành mạch
máu mới [61].
3.6. RNase 6 (RNase K6)

11
RNase 6 tồn tại chủ yếu ở thận và một ít ở các cơ quan khác như nhau thai,
tim, phổi. Gen mã hóa protein này dài 120 Kb và mARN tương ứng có trong các tế
bào bạch cầu trung tính và các bạch cầu đơn nhân máu ngoại vi. Trong các RNase
người thì RNase 6 gần với 2 protein của tế bào bạch cầu acid nhất [55, 61].
3.7. RNase 7
RNase 7 là enzyme kiềm tính hoạt động mạnh (pI = 10,1) có Mr là 14 546
Da, được tìm thấy trong các tế bào và mô biểu bì (đường tiêu hóa, đường sinh dục
và đường ruột). RNase biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh, tham gia vào hệ
miễn dịch không đặc hiệu, bảo vệ đường hô hấp… [30]
3.8. RNase 8

= 8 - 8,5.
- RNase H
2
: Mr = 33 kDa tách từ nhau thai và tham gia vào quá trình sao mã
tổng hợp ARN. Hoạt động của RNase H
2
trong vùng pH
opt
= 8,5 - 9 và cần ion
Mg
2+
.
4.2. Chức năng tiêu hóa
Chức năng tiêu hóa là chức năng sinh lý rất quan trọng của RNase. Một
lượng lớn ARN có trong thức ăn bị phân hủy bởi RNase A hay RNase 1 (ở người).
Dưới tác dụng của RNase, mạch ARN bị phân giải từng bước thành các
oligonucleotide hoặc mononucleotide và phosphate vô cơ. Sau đó các dạng này
được chuyển hóa nhờ các enzyme tiêu hóa khác thành những sản phẩm dễ hấp thụ
[55, 61].
4.3. Tham gia vào quá trình chế biến và chín của ARN
Quá trình chế biến và chín của ARN là những quá trình sinh hóa phức tạp
với sự tham gia của nhiều loại RNase khác nhau. Một trong những RNase đó là
RNase P. Enzyme này có mặt ở cả các sinh vật thuộc nhóm đơn giản như vi khuẩn
cổ (Archaea), vi khuẩn (Bacteria) tới các loài nhân chuẩn (Eucaria). RNase P là một
enzyme có hai thành phần chính là ARN và protein gắn với nhau, trong đó tiểu đơn
vị protein chiếm khối lượng phân tử nhỏ còn tiểu đơn vị lớn ARN đóng vai trò là
trung tâm hoạt động và chiếm khối lượng chủ yếu trong thành phần enzyme. ARN
có cấu trúc bậc 2 và có biểu hiện hoạt tính ngay cả khi không có tiểu phần protein.
RNase P giữ vai trò thủy phân liên kết phosphodieste trên phân tử tiền chất
tARN (pre-tARN) tạo nên tARN hoạt động tham gia vào quá trình sinh tổng hợp

Ở động vật, BS-RNase tách từ tinh dịch bò cũng đóng vai trò đặc biệt về mặt
sinh sản. BS-RNase ức chế phản ứng miễn dịch của bò cái chống lại tinh trùng nên
tạo điều kiện cho quá trình thụ tinh xảy ra. Ngoài ra, protein này còn thể hiện hoạt
tính chống sinh tinh trùng [36].
4.6. Hoạt tính cytotoxin
Hoạt tính cytotoxin là một trong các hoạt tính sinh học quan trọng của
RNase.[41, 50] Trong số hơn 100 enzyme thuộc siêu họ RNase A được biết cho đến
nay, chỉ có BS-RNase (enzyme từ tinh dịch bò) [11, 14, 36, 49,] và các RNase từ 3

14
loài ếch: ếch báo phương bắc Rana pipiens [38, 50], ếch bò Rana catesbeiana [32,
50] và ếch đồng Nhật Bản Rana japonica [50] - là có hoạt tính cytotoxin. Cơ sở của
hoạt tính cytotoxin là khả năng thoát khỏi sự kiểm soát của protein ức chế RNase
(RI) trong bào tương [12, 28, 29, 44, 45], nhờ đó RNase dễ dàng phân cắt cơ chất
ARN đặc hiệu trong tế bào, giúp diệt hiệu quả khối u. Hai enzyme có hoạt tính
cytotoxin được nghiên cứu nhiều là onconase (ONC) và BS-RNase.
- Onconase kìm hãm sự phân chia tế b ào ở giai đoạn G1 bằng cách liên kết
với các vị trí đặc hiệu trên màng huyết tương của tế bào đích glioma (mô đậm thần
kinh). Sau đó ONC tiếp cận với ARN tế bào đích rồi phân giải ARN qua đó ngăn
cản quá trình tổng hợp protein làm cho tế bào bị tiêu diệt [35].
Hoạt tính cytotoxin của ONC có thể bị ức chế bởi NaNO
3
và 2-
deoxyglucoze. Khả năng ức chế quá trình tổng hợp protein của tế bào của ONC đã
bị ankyl hóa giảm tới 100 lần tương ứng với hoạt tính ribonucletylic còn lại khoảng
2% so vói dạng ban đầu [56].
- BS-RNase là đồng đẳng với RNase A được tách từ tinh dịch bò có hoạt tính
độc với các động vật có vú. Hoạt tính cytotoxin của enzyme này phụ thuộc vào cấu
trúc bậc 4 của nó: dạng BS-RNase monomer không độc với tế bào vì chúng liên kết
chặt chẽ với chất ức chế RI trong tế bào chất. Chỉ có dạng BS-RNase dimer mới có

xương, da, mật, mỡ, máu, nọc… làm nguồn thực phẩm và dược liệu quí để bồi bổ
sức khỏe và chữa trị bệnh tật. Trong các sản phẩm từ rắn thì nọc rắn được quan tâm
nghiên cứu nhiều hơn cả, đặc biệt là nọc của loài rắn độc.
Rắn có thành phần chủ yếu sau:
Thịt rắn có: protein, mỡ, 0,55% chất saporozit.
Mật rắn: chlestrin, acid panmitic, acid stearic và taurin.
Nọc rắn: glycoprotein thrombin, lipase và 3 loại chất chống đông.
Nọc rắn mới tiết ra là một chất lỏng trong, màu hơi vàng với tỉ trọng 1,01 -
1,03 và độ dính cao, hàm lượng nước lên tới 70-80%. Sau 24h nọc rắn có thể bị
biến chất. Nếu làm khô, nọc rắn sẽ ở dạng tinh thể nhỏ, màu răng và giữ nguyên
tính độc hàng chục năm. Về thành phần, nọc rắn là hỗn hợp của nhiều chất có hoạt
tính sinh học, trong đó chủ yếu là các enzyme như proteinase, phospholipase (A, B,

16
C, D), ATPase, hydrolase, phosphatase kiềm, phosphatase acid, DNase, RNase,
ATPase, cholinesterase… Trong số các enzyme của nọc rắn, chỉ có phospholipase
và protease là được nghiên cứu nhiều còn RNase thì mới bắt đầu được quan tâm
nghiên cứu trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Độc tố chủ yếu của nọc rắn gây ra
bởi các toxin mang bản chất peptide và các protein phân tử lượng thấp như độc tố
neutotoxin, độc tố cardiotoxin, laticotoxin, erabutoxin b, các chất gây chảy máu và
chống đông máu, các chất gây dị ứng. Chúng tác động lên hệ cơ, hệ thần kinh, hệ
tim mạch, hệ hô hấp… gây nên nhiều triệu chứng như tê liệt thần kinh cơ, giảm khả
năng đông máu, tổn thương thành mạch máu trong, tan tiểu cầu dẫn đến xuất huyết
ở phổi, màng bụng và tim.
Nọc rắn được sử dụng làm thuốc chữa bệnh như: Thuốc gây mê, thuốc giảm
đau sau mổ, thuốc an thần, thuốc chống viêm…
5.2. Một vài đặc điểm và tính chất quan trọng của RNase tách từ nọc rắn
Theo các nghiên cứu về RNase tách từ nọc của loài rắn hổ mang vùng Trung
Á của Liên Xô trước đây và Ấn Độ thì hoạt tính RNase trong nọc của ba loài rắn ở
vùng Trung Á và Liên Xô là Vipera, Leleetina, Naja oxiana và Echiscorinatus có


17
độ cao > 2,5mM lại có tác dụng hoạt hóa. Các ion kim loại nặng phần lớn là những
chất ức chế [42].
Các nghiên cứu ở Việt Nam mới đây cho thấy nguồn enzyme từ nọc rắn hổ
mang Việt Nam có nhiều điểm khác biệt so với các RNase đã được nghiên cứu trên
thế giới: pH
opt
= 2,62  0,6; RNase rất bền với nhiệt và Mg
2+
không phải là chất
hoạt hóa RNase… [2, 3, 7]. Những kết quả trên cho thấy ở các loài rắn khác nhau
thì tính đặc trưng của RNase cũng khác nhau và có thể tồn tại nhiều dạng phân tử
RNase nọc rắn với bản chất protein khác nhau.
6. NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA RNASE TRONG Y HỌC
RNase có một ý nghĩa hết sức to lớn đối với nhiều loại bệnh trong y học.
Ngoài chức năng tiêu hóa và tham gia vào các hoạt động sao mã, phiên mã, sinh
tổng hợp protein, các RNase còn thực hiện nhiều vai trò trong phòng chống virus, vi
khuẩn, kháng giun…
Nồng độ và hoạt tính của RNase trong dịch bào và các dịch cơ thể có liên
quan tới trạng thái bệnh lý của nhiều loại bệnh khác nhau: Nồng độ enzyme tăng là
kết quả phản ứng của cơ thể chống lại bệnh tật. Đôi khi chính RNase lại là tác nhân
gây bệnh vì chúng gây độc cơ thể.
Những ứng dụng trực tiếp của RNase trong điều trị bệnh virus cho người và
vật nuôi đã được tiến hành ở Liên Xô vào những năm 70 của thế kỷ trước. Trong
liệu pháp người ta có thể dùng những chất hoạt hóa, chất ức chế hay thậm chí cả
những RNase và dạng hợp thể của RNase để trị bệnh.
Ví dụ: chất ức chế không chọn lọc enzyme photphodiesterase là teophilin
hay chất ức chế chọn lọc rolipram có tác dụng giải phóng các neurotoxin ECP, EDN
từ các bạch cầu axit giúp giảm hiệu ứng ngộ độc thần kinh. Chất ức chế RNase của

- Thiết bị: Cân điện tử, máy li tâm lạnh, máy khuấy từ, máy quang phổ UV-
Visable Spectrophotometer UV-1601 của hãng Shimatzu, thiết bị sắc kí FPLC, máy
đo pH…
2.1.3. hóa chất
- Hóa chất: Superdex 75, SP (sulfopropyl) Sepharose 4 Fast Flow và ARN
tổng số từ nấm men của hãng Sigma, Glycine (Gly) của hãng Prolabo, các hóa chất
khác như NaCl, KH
2
PO
4
, citrate natri, acid citric, KOH, HCl … đều có độ sạch
phân tích.
Các dung dịch đệm:
- Các dung dịch đệm sử dụng cho sắc kí: các đệm citrate 10 mM với pH 4,0;
4,5; 5,0; 5,5 và 6,0, không chứa muối NaCl và chứa muối NaCl với các nồng độ
0,15 M và 1,0 M; các dung dịch đệm phosphate 10 mM với pH 6,5; 7,0 và 7,5,
không chứa muối NaCl và chứa muối NaCl với các nồng độ 0,10; 0,15 M và 1,0 M.
Các dung dịch đệm citrate và đệm phosphate 10 mM không chứa muối NaCl được
gọi là các dung dịch đệm ban đầu (dung dịch A), các dung dịch đệm chứa muối
NaCl ở nồng độ 1,0 M được gọi là dung dịch B.
- Dung dịch đệm glycine (Gly) 10 mM, pH 2,5, một seri hỗn hợp đệm 4
thành phần Glycine-Citrate-Phosphate-Tris tổng nồng độ 40 mM, mỗi chất với nồng
độ 10 mM.
2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

20
2.2.1. Phương pháp xác định hoạt tính RNase [1]
- Nguyên lý: ARN hấp phụ cực đại ở bước sóng 260 nm. Khi ARN bị thủy
phân bởi RNase, mật độ quang (OD
260

260
thực của hỗn hợp phản ứng tính tại thời điểm bắt
đầu phản ứng, thì phải tính đến sự pha loãng này. Đây chính là nguyên nhân vì sao
phải sử dụng hệ số điều chính k. Hệ số k được xác định như sau:
Đo OD
260
của (1000 - x) l dung dịch cơ chất, kí hiệu là OD
0”
S
. Sau đó thêm
vào x l dung dịch đệm pha cơ chất, khuấy đều và đo OD
260
, giá trị OD đo được kí
hiệu là OD
0”
S+buf
, khi đó:
k = OD
0”
S+buf
/OD
0”
S
(2)
- Một đơn vị (U) hoạt tính RNase là lượng enzyme xúc tác thủy phân ARN trong
điều kiện tiêu chuẩn (nồng độ cơ chất bão hòa, nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu, dung dịch
đệm thích hợp…) làm tăng mật độ quang của hỗn hợp phản ứng (1 ml) lên 1 đơn vị
OD
260
sau 30 giây phản ứng (thời gian phản ứng tính từ lúc bắt đầu cho enzyme vào

rửa cột bằng 36 ml dung dịch, mối phân đoạn thu 3 ml (gồm 15 ml dung dịch ban
đầu – dung dịch A, và 21 ml dung dịch ban đầu chứa 0,15 M NaCl có giá trị pH
tương ứng), sau đó chạy gradient nồng độ NaCl 0,15  0,80 M với thể tích chung
của gradient bằng 150 ml, mối phân đoạn thu 2 ml. Sau khi kết thúc chạy gradient
NaCl, rửa tiếp cột bằng 60 ml dung dịch B, mỗi phân đoạn thu 3 ml. sắc kí ở giá trị
pH = 7,0, toàn bộ quá trình sắc kí được tiến hành tương tự, chỉ khác ở điểm là thay

22
đệm ban đầu chứa 0,15 M NaCl dùng để rửa cột bằng đệm ban đầu chứa 0,10 M
NaCl và thay gradient 0,15  0,80 M bằng gradient 0,15  0,7 M NaCl, còn khi sắc
kí ở giá trị pH = 7,5 thì chỉ dùng dung dịch đệm ban đầu (dung dịch A) để rửa cột
và thay gradient 0,15  0,80 M bằng gradient 0,0  0,60 M NaCl
Toàn bộ quá trình sắc kí được tiến hành tự động trên thiết bị FPLC theo
chương trình phần mềm sau:
Main 0.00 Base Volume
0.00 Block Dieukienbandau
(Dieukienbandau)
0.00 Base SameAsMain
0.00 Alarm_Pressure Enabled, 3 {MPa}, 0.00 {MPa}
0.00 Alarm_UV Disabled, 3000 {mAU}, 0 {mAU}
0.00 Flow 1.00 {ml/min}
0.00 Buffer ValveA A1
0.00 Column Position Position2
0.00 End_Block
0.00 Block Loadmau
(Loadmau)
0.00 Base SameAsMain

0.00 Base SameAsMain
0.00 Gradient 0.00 {%B} 45{Base}
0.00 FractionationStop
600.00
End_Block2.2.2.2. Phương pháp sắc kí sàng lọc phân tử trên cột Superdex 75
Cơ sở: Phương pháp sắc kí sàng lọc phân tử (hay còn gọi là sắc kí lọc gel)
dựa trên sự khác biệt trong hình dạng và kích thước phân tử của các protein khác
nhau trong một hỗn hợp protein. Khi cho một hỗn hợp protein có kích thước phân
tử khác nhau đi qua cột lọc gel, thì những protein có kích thước phân tử lớn hơn lỗ
của các hạt gel sẽ không đi vào bên trong các hạt gel, và ra khỏi cột trong cái gọi là
thể tích tự do của cột; còn những protein có kích thước phân tử nhỏ hơn kích thước
lỗ của các hạt gel, và chúng sẽ đi vào bên trong các hạt gel, tức là chúng được phân
bố giữa 2 pha – bên trong và bên ngoài các hạt gel với các hệ số phân bố tương ứng.
Các protein này sẽ đi ra khỏi cột lọc gel theo thứ tự ngược với kích thước phân tử
của chúng, tức là các protein nào có kích thước phân tử lớn thì ra khỏi cột trước và
những protein nào có kích thước phân tử nhỏ hơn sẽ ra sau, các chất muối (thường

24
có mặt trong các chế phẩm protein) ra khỏi cột sau cùng (chính vì vậy mà cột lọc
gel thường được sử dụng để loại muối khỏi các dung dịch protein) [62, 63].
Phương pháp sắc kí sàng lọc phân tử cũng được tiến hành tự động trên thiết
bị sắc kí FPLC. Trong phạm vi luận văn này chúng tôi chỉ tiến hành sắc kí sàng lọc
phân tử chế phẩm nọc rắn hổ mang đông khô ở 2 giá trị pH khác nhau là 5,5 (trong
đệm citrate 10 mM) và 7,5 (trong đệm phosphate 10 mM). Trong mỗi thí nghiệm đã
sử dụng khoảng 20 mg nọc rắn đông khô để cho lên cột.
+ Đầu tiên cột được cân bằng với dung dịch đệm ban đầu (đệm citrate hay
đệm phosphate, xem phần trên).

0.00 Flow 1.00 {ml/min}
0.00 End_Block

25
0.00 Block Loadmau
(Loadmau)
0.00 Base SameAs Main
0.00 Sample Flow 1.00 {ml/min}
0.00 InjectionValve Load
2.00 End_Block
0.00 Block chaycotlocgel
(Chaycotlocgel)
0.00 Base SameAs Main
0.00 InjectionValve Inject
0.00 Fractionation 18mm, 100 {ml}, Tube Number [B9], Volume
75.00
End_Block
0.00 Block Taisinhcot
(Taisinhcot)
0.00 Base SameAsMain
0.00 InjectionValve Inject
0.00 FractionationStop
300.00
End_BlockHàm lượng protein được ghi tự động liên tục trên máy sắc kí. Tuy nhiên, sau
khi quá trình sắc kí kết thúc đã tiến hành đo hoạt tính RNase và hàm lượng protein
trong tất cả các phân đoạn thu được.
2.2.2.3. Phương pháp phân tích kết quả phân tách protein