BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
TRỊNH PHƯƠNG THẢO

NGHIÊN CỨU SO SÁNH
KHẢ NĂNG TẠO VI BỌT GIỮA
HAI PHƯƠNG PHÁP
SIÊU ÂM VÀ KHUẤY CƠ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRỊNH PHƯƠNG THẢO

NGHIÊN CỨU SO SÁNH
KHẢ NĂNG TẠO VI BỌT GIỮA
HAI PHƯƠNG PHÁP
SIÊU ÂM VÀ KHUẤY CƠ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


MỤC LỤC
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Đại cương về vi bọt 2
1.1.1. Những ứng dụng độc đáo của vi bọt 2
1.1.2. Cấu tạo vi bọt 5
1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến vi bọt trong quá trình tồn tại 7
1.1.4. Phương pháp bào chế 9
1.2. Một số nghiên cứu về vi bọt trên thế giới 12
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.1. Đối tượng, nguyên vật liệu và thiết bị 14
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 14
2.1.2. Nguyên vật liệu 14
2.1.3. Thiết bị 14
2.2. Nội dung nghiên cứu 14
2.2.1. Khảo sát thông số kỹ thuật tối ưu cho hai phương pháp 14
2.2.2. So sánh khả năng tạo vi bọt của hai phương pháp 15
2.3. Phương pháp nghiên cứu 15
2.3.1. Phương pháp bào chế vi bọt 15
2.3.2. Phương pháp đánh giá một số đặc tính của hệ vi bọt 16
2.3.3. Phương pháp xử lý hình ảnh bằng phần mềm Image J 18
Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19 3.1. Kết quả khảo sát thông số kỹ thuật tối ưu cho hai phương pháp 19
3.1.1. Kết quả khảo sát thông số kỹ thuật tối ưu cho phương pháp khuấy cơ 19

14
3
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của tốc độ quay roto đến quá trình tạo bọt và
chất lượng hệ bọt

20
4
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của thời gian khuấy đến quá trình tạo bọt và
chất lượng hệ bọt

23
5
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của cường độ siêu âm đến quá trình tạo bọt
và chất lượng hệ bọt

26
6
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của xung siêu âm đến quá trình tạo bọt và
chất lượng hệ bọt

28
7
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến quá trình tạo bọt
và chất lượng hệ bọt

30
8
Bảng 3.6: Kết quả về sự thay đổi của vi bọt được tạo bằng hai
phương pháp khi được giữ trong tiêu bản


28
5
Hình 3.5. Phân bố kích thước vi bọt ở các thời gian siêu âm khác
nhau
30
6
Hình 3.6. Phân bố kích thước vi bọt của hai phương pháp

33
7
Hình 3.7. Sự thay đổi số lượng vi bọt có đường kính nằm trong
khoảng 1-10μm trên 1 vi trường cố định theo thời gian ở hai phương
pháp

35
8
Hình 3.8. Sự thay đổi đường kính của một vi bọt nhất định theo thời
gian ở hai phương pháp
36
9
Hình 3.9. Sự thay đổi số lượng vi bọt có đường kính nằm trong
khoảng 1-10μm trên 1 vi trường theo thời gian ở hai phương pháp.
38 1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Vi bọt đã và đang được các nhà bào chế hiện đại đi sâu nghiên cứu và phát triển
bởi những ứng dụng rất thiết thực mà nó đem lại, nổi bật trong đó chính là: làm tác

các mô phải khác nhau. Không chỉ có một trở kháng âm kháng biệt đáng kể so với
mô, vi bọt còn cộng hưởng với sóng siêu âm làm tăng phản âm của máu lên đến hơn
10 lần so với các tế bào hồng cầu [22].
Vi bọt có khả năng phản âm cao do mức độ chịu nén ở các cường độ siêu âm
khác nhau là lớn hơn nhiều so với bất kỳ chất lỏng hoặc rắn nào khác nên vi bọt có
thể cung cấp được cường độ tán xạ cao [22]. Hơn nữa khi vi bọt chịu tác động của
sóng âm tại một tần số phù hợp, chúng sẽ cộng hưởng âm. Và rất may mắn là vi bọt
trong phạm vi kích thước micrometer cộng hưởng dải tần số thường dùng trong siêu
âm chẩn đoán thông thường (1-3MHz).
Tác nhân tương phản siêu âm vi bọt có hai đặc tính độc đáo mà không có ở các
tác nhân sử dụng trong kỹ thuật chụp X-quang hay chụp cộng hưởng từ. Thứ nhất, vì
vi bọt có kích thước lớn hơn 1μm nên chúng bị giới hạn phân bố bên trong không
gian mạch máu và chỉ phân bố đúng trong không gian mạch máu. Do đó, khi có bất
kỳ một tín hiệu nào nhận được thì chắc chắn đó là tín hiệu đến từ không gian mạch
máu. Thứ hai, vi bọt có thể bị phá hủy bởi chính sóng siêu âm. Chính vì vậy, tác nhân
3

tương phản vi bọt đã giúp cải thiện đáng kể chất lượng hình ảnh trong siêu âm, thể
hiện cụ thể trong các trường hợp sau:
 Hình ảnh buồng tim
Sử dụng các tác nhân tương phản vi bọt để lấp đầy buồng tim đã cho những tín
hiệu nổi bật ở khoang thất trái giúp đánh giá chuyển động của nó trong quá trình tâm
thu. Phân định rõ được biên giới của tâm thất còn giúp đánh giá toàn bộ chức năng
tim bằng cách đo phân suất tống máu (tỉ lệ máu trong tâm thất trái được đẩy ra trong
một nhịp tim) và theo dõi chuyển động của thành tim hay sự tưới máu của động mạch
vành để phát hiện bệnh thiểu năng mạch vành.
 Hình ảnh mạch máu
Khi tiến hành chụp ảnh mạch máu, tác nhân tương phản siêu âm vi bọt giúp
chúng ta dễ dàng đạt được các mục đích sau:
- Xác định được rằng các mạch máu có bị tắc hay không.

Việc phát hiện các dấu hiệu đặc trưng cụ thể ở mức phân tử của một bệnh lý nào
đó thì được gọi là hình ảnh phân tử. Để làm được điều này, người ta gắn lên vỏ vi bọt
một số tác nhân sao cho chúng có khả năng hướng đích là vị trí đang cần có hình ảnh
phân tử. Khi chúng tập trung tại đó, hình ảnh siêu âm sẽ trở nên rõ nét hơn. Chẳng
hạn như, khi kết hợp phosphotidylserine vào vỏ lipid, vi bọt sẽ hấp dẫn bạch cầu bắt
giữ chúng ngay tại các ổ viêm [20]. Vi bọt nhắm đích được tạo ra bằng cách gắn các
phối tử thích hợp bao gồm cả kháng thể lên vỏ của chúng thông qua các liên kết hóa
trị hoặc qua khớp nối avidin/biotin. Các loại mô mục tiêu hay được hướng tới gồm
huyết khối, mảng xơ vữa, ổ viêm, khối u. Ví dụ, để có được hình ảnh rõ ràng về huyết
khối, người ta sử dụng tác nhân tương phản là vi bọt có gắn trên bề mặt các thụ thể
GPIIb/IIIa được tìm thấy trên tiểu cầu đã được kích hoạt [26], [36].
1.1.1.2. Tác nhân phân phối thuốc và gen
Không có khả năng cung cấp acid nucleic nhắm tế bào đích bằng một hệ thống
phân phối đang là rào cản lớn nhất trong liệu pháp gen. Sử dụng kỹ thuật siêu âm kết
5

hợp với vi bọt đã khắc phục tốt được hạn chế này. Gen hướng đích được phân phối
bằng cách tiêm đồng thời DNA plasmid và vi bọt có thể mang lại hiệu quả thông qua
mức độ biểu hiện của gen, nhưng phương pháp này yêu cầu một lượng lớn DNA kết
hợp để có thể định lượng được [1]. Do acid nucleic dễ bị nuclease phân giải và nhanh
chóng đào thải qua hệ thống lưới nội mô khi được đưa vào trong máu, vì vậy vi bọt
đã được sử dụng làm chất mang để bảo vệ chúng khỏi bị thoái hóa, tăng thời gian lưu
thông trong mạch máu, cải thiện tính đặc hiệu của việc phân phối tới đích.
Phân phối thuốc tới đích được thực hiện bằng cách kết hợp các phân tử thuốc
và vỏ của vi bọt. Khác với các acid nucleic, các phân tử thuốc hiếm khi liên kết tĩnh
điện với bề mặt vi bọt, thay vào đó chúng kết hợp cùng lớp vỏ hoặc ngay dưới bề mặt
của lớp vỏ hoặc chúng được kết hợp với một chất mang khác có thể liên kết với bề
mặt vi bọt. Sau khi vi bọt tới đích chúng sẽ bị phá vỡ bởi lực siêu âm và giải phóng
thuốc. Như vậy, sử dụng vi bọt làm tác nhân phân phối thuốc sẽ mang lại nhiều lợi
ích như:

thích sinh học hơn so với polymer hay chất diện họat. Còn vỏ polymer thường dày và
cứng hơn vỏ lipid bởi nó được tạo thành nhờ các liên kết ngang, chéo giữa các phân
tử polymer. Lớp vỏ dày tuy bền và ổn định hơn nhưng lại làm giảm khả năng cộng
hưởng âm ở dải tần số sử dụng trong điều trị [25]. Chính vì vậychúng thường được
ứng dụng làm tác nhân tương phản trong siêu âm nhiều hơn là phân phối thuốc và
gen do lớp vỏ khá bền vững khó bị phá vỡ hơn.
1.1.2.2. Lõi khí
Là phần không gian được bao bọc bởi lớp vỏ ngoài. Có thể gồm 1 khí hoặc là
hỗn hợp của nhiều khí. Khi hỗn hợp khí gồm 2 khí thì khí chính được gọi là khí sơ
cấp, thường là không khí, đôi khi là N
2
. Khí còn lại là khí thứ cấp, là 1 tác nhân khí
thẩm thấu, khí này ít hòa tan trong máu và huyết thanh và có áp suất riêng phần ở
nhiệt độ cơ thể đủ để cung cấp một hiệu lực thẩm thấu mong muốn. Khí kết hợp được
7

dùng để tạo ra sự khác biệt trong áp suất riêng phần và tạo áp suất khí thẩm thấu qua
đó ổn định vi bọt, PFC là khí hay được dùng nhất.
1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến vi bọt trong quá trình tồn tại
Trong quá trình tồn tại, bản thân vi bọt chịu sự tác động của rất nhiều yếu tố
nhưng phải kể đến trước tiên đó là áp lực Laplace ΔP cho bởi:
ΔP = 2
𝜎
𝑟

Trong đó: σ là sức căng bề mặt khí/nước
r là bán kính của vi bọt
Áp lực này càng lớn thì vi bọt càng nhanh chóng bị biến mất, có nghĩa là khi
sức căng bề mặt càng lớn và bán kính vi bọt càng nhỏ thì thời thời gian tồn tại của vi
bọt càng ngắn. Ngoài áp lực Laplace còn có huyết áp, nhiệt độ, độ nhớt môi trường,

tụ thành chất lỏng để kéo dài thời gian tồn tại của vi bọt.
Muốn kéo dài tuổi thọ vi bọt đồng nghĩa với việc phải kéo dài khoảng thời gian
mà trong đó vi bọt vẫn ổn định về kích thước và độ bền. Chẳng hạn vi bọt tối thiểu
phải tồn tại được trong một khoảng thời gian đủ để tiến hành siêu âm khi nó được sử
dụng làm tác nhân tương phản. Có rất nhiều giải pháp để giải quyết vấn đề này nhưng
điều được cân nhắc trước tiên vẫn là việc lựa chọn thành phần cho lõi khí và lớp vỏ
ngoài.
Chọn lựa nguyên liệu làm lớp vỏ được xem xét kỹ càng vì nó quyết định độ bền,
tính đàn hồi của vi bọt nên ảnh hưởng trực tiếp tới thời gian tồn tại, khả năng cộng
hưởng âm của vi bọt. Lớp vỏ tạo ra phải vừa bền vững, vừa linh hoạt, có khả năng co
giãn tốt để đảm bảo tính phản âm cho vi bọt. Khi sử dụng các chất có khả năng hoạt
động bề mặt, sức căng bề mặt càng nhỏ thì áp lực Laplace càng nhỏ do đó vi bọt tồn
tại được lâu hơn và ngược lại. Các thành phần để tạo vỏ ngoài tốt nhất là những chất
dễ chuyển hóa, dễ bài tiết và có rất ít tác dụng phụ, tương thích sinh học, hay tốt hơn
nữa là có thể vô trùng được bằng nhiệt và có thời gian sử dụng lâu dài.
9

Đối với phần lõi khí, thành phần và tỉ lệ các khí dùng để đưa vào bên trong vi
bọt cũng được cân nhắc và tính toán kỹ lưỡng. Thông thường khí kết hợp hay khí thứ
cấp phải đáp ứng được hai yêu cầu là: phải có hệ số Ostwald thấp (<10
-4
) và áp suất
hơi bão hòa ở nhiệt độ cơ thể phải tương đối cao (>3.10
4
Pa), khi đó tuổi thọ của vi
bọt sẽ được gia tăng đáng kể. Các PFC chính là lựa chọn lý tưởng có thể đáp ứng
được các yêu cầu trên, ngoài ra khi vi bọt bị hòa tan các khí này còn được bài tiết ra
dưới dạng nguyên vẹn qua đường thở mà không gây ảnh hưởng đến sức khỏe con
người.
1.1.4. Phương pháp bào chế

giai đoạn tiếp theo.
1.1.4.3. Khuấy tốc độ cao
Vi bọt được chế tạo bằng cách dùng lực khuấy đảo chia cắt của cánh khuấy để
phân tán pha khí hoặc pha lỏng vào một dung dịch của nguyên liệu tạo vỏ. Các phân
tử chất tạo vỏ sẽ tự động tìm đến và sắp xếp trên bề mặt mới trong dung dịch và hình
thành nên vi bọt. Kích thước vi bọt có thể kiểm soát được nhờ tốc độ cánh khuấy hay
tỉ lệ pha lỏng, pha khí. Tương tự phương pháp siêu âm, phân bố kích thước vi bọt bào
chế bằng phương pháp này khá lớn, cần phải được phân loại trước khi đem đi sử
dụng.
1.1.4.4. Màng nhũ hóa
Vi bọt được tạo ra bằng cách đẩy hỗn hợp chứa nhiều thành phần đi qua một
màng xốp một hoặc nhiều lần, tạo thành các giọt lỏng [13]. Sau đó cũng tiến hành
các bước tiếp theo như phương pháp bay hơi dung môi để tạo vi bọt, hoặc có thể tạo
ngay vi bọt bằng cách sử dụng khí tạo lõi cho vi bọt như một pha phân tán [19].
Ưu điểm của phương pháp này đó là kiểm soát kích thước vi bọt tốt hơn, phân
bố kích thước hẹp hơn rất nhiều so với phương pháp siêu âm hay bay hơi dung môi
[18]. Và quan trọng hơn là số lượng vi bọt tạo thành không bị giảm theo thời gian hay
11

khối lượng của hỗn hợp các thành phần tạo vi bọt. Kích thước cũng như phân bố kích
thước của hệ vi bọt phụ thuộc nhiều vào đặc điểm của các lớp màng (phân bố kích
thước lỗ màng, độ xốp của màng) [15].
1.1.4.5. Phun sấy kiểm soát bằng điện trường
Đây là kỹ thuật được sử dụng nhằm cải thiện tính đồng nhất của vi bọt được tạo
ra [19]. Các vi bọt được tạo thành từ một vòi phun bằng thép không gỉ (đường kính
đầu phun 20-50μm) được cung cấp dịch phun trong buồng phun có nhúng một điện
cực. Bằng cách thay đổi điện thế của điện cực, xung áp suất sẽ được tạo ra trong lòng
dịch phun, với mỗi xung áp suất một giọt chất lỏng sẽ được đẩy ra khỏi vòi phun và
dịch phun lại được tiếp tục hút vào buồng phun. Để thu được các vi giọt, có thể phun
trực tiếp vào không khí hoặc phun chìm vào trong một môi trường lỏng.

pha dầu sau khi thoát ra khỏi đầu mao dẫn sẽ đi vào dung dịch polymer để tạo một hệ
phân tán có chứa có vi bọt có cấu trúc lõi khí và vỏ trong pha nước. Vi bọt vỏ polymer
thu được sau đó sẽ được làm sạch bằng cách bay hơi dung môi.
Một cách tiếp cận khác tương tự cũng đã được sử dụng để tạo vi bọt nhiều lớp
với một nhũ tương kép và thiết bị hệ vi dẫn đồng trục hoặc kết hợp hai mô hình hệ vi
dẫn khác nhau: dòng chảy tập trung và giao nhau hình chữ T [34], [37]. Kích thước
vi bọt có thể được kiểm soát nhờ tốc độ dòng chảy, độ nhớt của chất lỏng, áp suất của
dòng khí và kích thước các đầu kim hệ vi dẫn.
Có thể tạo các vi bọt đa thành phần bằng cách kết hợp các thành phần này vào
pha dầu để tạo lớp vỏ trong cùng. Phương pháp bào chế này rất thuận lợi để nghiên
cứu số lượng vi bọt ổn định dựa vào bán kính và độ dày vỏ. Tuy nhiên so với các
phương pháp khác thì phương pháp hệ vi dẫn có năng suất tương đối thấp.
1.2. Một số nghiên cứu về vi bọt trên thế giới
Các sản phẩm thương mại về vi bọt xuất hiện đầu tiên trên thế giới vào những năm
1990 ở châu Âu và Hoa Kỳ đó là Echovist (Schering AG, Đức) và Alnunex (Hoa Kỳ).
13

Echovist gồm các vi tinh thể galactose đóng vai trò là mầm mống hình thành nên các
vi bọt không khí lơ lửng trong nước [33], còn Albunex gồm các vi bọt không khí có
vỏ là protein biến tính của con người [8]. Các dạng vi bọt này đã được sử dụng, tuy
nhiên chúng không đủ ổn định để vượt qua các lòng mao mạch phổi và đến được tâm
thất khi tiêm tĩnh mạch. Thời gian bán thải của chúng chỉ được tính bằng giây nên
việc sử dụng các dạng sản phẩm này là có giới hạn. Schering sau đó đã phát triển
Levovist bằng cách bổ sung thêm acid palmitic, lớp vỏ của vi bọt được hình thành
sau khi được khuấy mạnh, đồng thời cũng tăng tính ổn định của vi bọt [9], [27]. Nối
tiếp sau đó là sự ra đời của hàng loạt các sản phẩm khác nhau như:
- Optisona: vỏ albumin người, lõi khí perfluoropropane
- Sonovuea: vỏ albumin người và lõi khí SF
6


Nguồn gốc
Tiêu
chuẩn
1
Glycerylmonostearate Cấu thành lớp vỏ
Công ty cổ phần Sao
Thái Dương
USP
2
Poloxamer 188
Trung Quốc
USP
3
Cremophor A25
Công ty cổ phần Sao
Thái Dương
TCCS
4
Nitrogen
Thành phần lõi khí
Việt Nam
TCCS
5
Nước cất
Dung môi
Việt Nam
TCCS

chất lượng hệ bọt, từ đó lựa chọn các thông số tối ưu.
 Phương pháp siêu âm:
- Cường độ siêu âm
- Thời gian siêu âm
- Xung siêu âm
 Phương pháp khuấy cơ học:
- Thời gian khuấy
- Tốc độ quay của roto
Sự ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật đến quá trình tạo bọt được đánh giá
thông qua các chỉ tiêu:
 Hình thức vi bọt
 Kích thước và phân bố kích thước vi bọt
 Thể tích cột bọt
 Thời gian phân lớp của hệ bọt
2.2.2. So sánh khả năng tạo vi bọt của hai phương pháp
Sau khi lựa chọn được các thông số kỹ thuật tối ưu, tiến hành tạo vi bọt bằng
hai phương pháp theo các thông số đó, rồi so sánh khả năng tạo bọt của hai phương
pháp bằng cách đánh giá và so sánh các chỉ tiêu:
 Hình thức vi bọt
 Kích thước và phân bố kích thước vi bọt
 Thể tích cột bọt
 Thời gian phân lớp của hệ bọt
 Độ bền của vi bọt theo thời gian
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp bào chế vi bọt
2.3.1.1. Chuẩn bị dịch tạo bọt
16

- Cân pha nước: 0,1g poloxamer 188 và 0,1g cremophor A25.
- Cân pha dầu: 0,1g glycerolmonostearat.

- Đuổi không khí: Sục khí N
2
trong 1 phút, sau đó nâng đầu ống dẫn khí N
2
lên khỏi
bề mặt dịch tạo bọt. Cố định lưu lượng khí N
2
.
- Đặt đầu dò của máy siêu âm sâu tiếp xúc với bề mặt dịch tạo bọt. Cài đặt thông
số máy rồi bắt đầu quá trình tạo bọt.
- Sau khi tạo bọt xong, đổ dịch đã tạo bọt vào một ống nghiệm thủy tinh để tiến
hành các bước đánh giá.
2.3.2. Phương pháp đánh giá một số đặc tính của hệ vi bọt
2.3.2.1. Hình thức vi bọt: quan sát vi bọt trong tiêu bản qua kính hiển vi.
2.3.2.2. Kích thước và phân bố kích thước vi bọt
17

Các bước tiến hành:
- Chuẩn bị mẫu: Sau khi tạo bọt, tại thời điểm t= 10 phút, hút dịch chứa bọt tại một
vị trí cố định đã chọn trong ống nghiệm rồi nhỏ lên tiêu bản, đem soi trên kính
hiển vi kết nối camera ở vật kính 40, chụp và lưu hình ảnh.
- Xử lý hình ảnh: sử dụng phần mềm hỗ trợ Image J.
- Xử liệu thống kê dữ liệu về đường kính của vi bọt trong ảnh.
Đánh giá:
 Kích thước: đường kính trung bình của vi bọt
 Phân bố kích thước: đường kính trung bình ± 2SD (độ lệch chuẩn)
95,45% vi bọt có kích thước nằm trong khoảng này.
2.3.2.3. Thể tích cột bọt: Thể tích cột bọt tạo thành được tính theo công thức:
V= V
1