BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN MINH TRANG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ
TRÊN CHUỘT BỊ THIẾU MÁU NÃO CỤC BỘ VÀ
KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE
CỦA RAU ĐẮNG BIỂN
(BACOPA MONNIERI(LINN.) WETTST)
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
(BACOPA MONNIERI(LINN.) WETTST)
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÓA SINH DƯỢC
60120408
Người hướng dẫn khoa học : TS. Nguyễn Thị Lập

TS. Phạm Thị Nguyệt Hằng
HÀ NỘI 2014
LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều sự
giúp đỡ quý báu của các thầy cô cùng đồng nghiệp.
Đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Nguyễn Thị Lập và
TS. Phạm Thị Nguyệt Hằng, hai người thầy luôn tận tình hướng dẫn và giúp đỡ

3.1. Mô hình đánh giá khả năng ức chế acetylcholinesterase 22
3.2. Mô hình đánh giá khả năng học tập không gian trên chuột 22
4. Liên quan giữa thiếu máu não cục bộ và bệnh Alzheimer 23
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
2.1. Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu 25
2.1.1. Nguyên liệu 25
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu26:
2.1.3. Hóa chất27
2.2. Phương pháp nghiên cứu 28
2.2.1. Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ in vivo bằng thử nghiệm mê lộ
nước Morris 28
2.2.2. Nghiên cứu khả năng ức chế enzyme acetylcholinesterase (AChE)
ex vivo 31
2.2.3. Nghiên cứu khả năng ức chế enzyme acetylcholinesterase (AChE)
in vitro 32
2.3. Xử lý số liệu 32
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33
3.1. Tác dụng cải thiện trí nhớ của rau đắng biển trên chuột bị suy giảm
trí nhớ đánh giá qua thử nghiệm mê lộ nƣớc Morris 33
3.1.1. Bài tập nhìn thấy bến đỗ và bài tập không nhìn thấy bến đỗ 33
3.1.2. Bài tập không có bến đỗ 36
3.2. Nghiên cứu tác dụng ức chế hoạt tính enzym acetylcholinesterase
in vitro và ex vivo của rau đắng biển 38
3.2.1. Nghiên cứu tác dụng ức chế hoạt tính enzym AChE in vitro của
các mẫu M1, M2 38
3.2.2. Nghiên cứu tác dụng ức chế hoạt tính enzym AChE ex vivo của
các mẫu M1, M2 41
Chƣơng 4: Bàn luận 43
4.1. Về tác dụng cải thiện trí nhớ của rau đắng biển 43
4.2. Về tác dụng ức chế hoạt tính enzyme AChE in vitro và ex vivo của

3.1. Tác dụng của mẫu M1 và M2 đối với thời gian tiềm ẩn
34
3.2. Tác dụng ức chế enzym AChE phụ thuộc vào nồng độ mẫu M1 và M2
38
3.3. Giá trị IC
50
của các mẫu nghiên cứu
40
3.4. Tác dụng của tacrin, M1 và M2 đối với hoạt độ AChE ex vivo
41

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình
Trang
1.1. Mối liên quan giữa protein Tau, β amyloid và ApoE4

đoán đến năm 2050 con số này tăng lên tới 62,8 triệu người. Việt Nam có
khoảng hơn 9 triệu người bị sa sút trí tuệ mà dạng bệnh điển hình là Alzheimer.
Alzheimer là thể bệnh nặng nhất trong nhóm các bệnh sa sút trí tuệ, hiện nay là
mối quan tâm hàng đầu của những nhà lão khoa trên toàn thế giới cũng như ở
nước ta, khi tuổi thọ trung bình ngày càng cao, số người mắc bệnh ngày càng
nhiều [5].
Bệnh nhân bị Alzheimer sẽ bị giảm khả năng xét đoán, định hướng không
gian và thời gian, ngôn ngữ, tư duy nhận thức, hành động ảnh hưởng nặng nề
đến chức năng và chất lượng cuộc sống, gây nhiều khó khăn cho người bệnh,
cho gia đình và cả cộng đồng xã hội.
Các thuốc điều trị Alzheimer chủ yếu gồm các thuốc ức chế
cholinesterase, thuốc kháng thụ thể N-methyl – D- Aspartat, thuốc tăng cường
hoạt tính serotonin. Ba nhóm này đa số là thuốc tân dược nhưng giá thành thuốc
tương đối cao và có những tác dụng không mong muốn. Do đó nhu cầu nghiên
cứu phát triển các thuốc mới có nguồn gốc từ dược liệu để hỗ trợ và điều trị
Alzheimer là rất cần thiết.
Theo Y học cổ truyền Ấn Độ, rau đắng biển (Bacopa monnieri (Linn)
Wettst. được sử dụng để điều trị rối loạn tâm thần kinh như lo lắng, sa sút trí tuệ,
trí nhớ kém. Trên thế giới cũng đã có những nghiên cứu chứng minh hiệu quả
của rau đắng biển trên hệ thần kinh của chuột và người. Rau đắng biển (Bacopa
monnieri (Linn) Wettst) nhiều năm nay đã là món ăn phổ biến với người dân
2

Việt Nam. Tuy nguồn nguyên liệu dồi dào như vậy nhưng rau đắng biển vẫn
chưa được chú trọng nghiên cứu làm thuốc điều trị Alzheimer, trong khi nhu cầu
sử dụng là khá phổ biến và bệnh nhân phải mua thuốc nhập từ nước ngoài với
giá thành khá cao. Điều này gây tổn thất về giá trị kinh tế cũng như ý nghĩa xã
hội của loài cây này. Vì vậy chúng tối tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu
tác dụng cải thiện trí nhớ trên chuột bị thiếu máu não cục bộ và khả năng
ức chế acetylcholinesterase của rau đắng biển (Bacopa monnieri (Linn)

ngày của họ cũng không bị ảnh hưởng.
Bệnh Alzheimer là nguyên nhân hay gặp nhất của các loại sa sút trí tuệ,
chiếm tỷ lệ khoảng hai phần ba tổng số các trường hợp sa sút trí tuệ. Bệnh
Alzheimer thường xuất hiện trễ nhưng một số trường hợp lại xuất hiện sớm,
trước 60 tuổi. Giữa các thể bệnh Alzheimer xuất hiện sớm và xuất hiện trễ có
những điểm khác nhau rõ rệt, trong đó rõ nhất là sự hiện diện của các đột biến di
truyền vốn hay gặp nhất trong thể bệnh Alzheimer xuất hiện sớm
1.1. Dịch tễ bệnh Alzheimer
Tỷ lệ mắc sa sút trí tuệ ở những nước phát triển, mà thể nặng nhất là
Alzheimer, lên tới 8% đối với người từ 65 tuổi trở lên. Với tuổi cao hơn (85 trở
lên), tỷ lệ ở nhiều nước có thể lên đến 50%, có nghĩa là cứ hai người thì có một
người mắc. Có một nửa số trường hợp mất trí mới phát hiện mỗi năm là mắc
4

bệnh Alzheimer. Ngoài ra còn có sự khác biệt giới tính ở các mức tỷ lệ, phụ nữ
có nguy cơ phát triển bệnh Alzheimer cao hơn nam giới. [5]
Nghiên cứu của Bệnh viện Lão khoa Trung ương tại huyện Ba Vì, Hà Nội
(2005 – 2006) cho thấy tỷ lệ người từ 60 tuổi trở lên sống tại cộng đồng có sa
sút trí tuệ (SSTT) là 4,63%, tỷ lệ mắc bệnh tăng lên 1,78 lần sau mỗi 5 tuổi. [2]

1.2. Yếu tố nguy cơ bệnh Alzheimer
Yếu tố nguy cơ quan trọng nhất của bệnh Alzheimer là tuổi tác cao, tỷ lệ
mắc bệnh toàn bộ bằng 0,5% trong quần thể người thuộc lứa tuổi 65, đạt 10% ở
lứa tuổi 80. Bệnh Alzheimer thường xuất hiện trễ nhưng một số trường hợp lại
xuất hiện sớm, trước 60 tuổi. Giữa các thể bệnh Alzheimer xuất hiện sớm và
xuất hiện trễ có những điểm khác nhau rõ rệt, trong đó rõ nhất là sự hiện diện
của các đột biến di truyền vốn hay gặp nhất trong thể bệnh Alzheimer xuất hiện
sớm. Yếu tố nguyên nhân trong thể bệnh Alzheimer xuất hiện trễ thì phức tạp và
đa dạng hơn, trong đó có thể có sự hiện diện của cả yếu tố di truyền, tuối tác và
tác động môi trường.

đặc biệt, nhất là về lưu giữ thông tin. Một số khác liên quan đến các trung tâm
của chú ý, tri giác, ngôn ngữ, các trung tâm xử lý thông tin.
Rối loạn về ngôn ngữ
Rối loạn ngôn ngữ được coi là những rối loạn về nhận thức hay gặp nhất
sau các rối loạn về trí nhớ. Gặp trong khoảng 40% các trường hợp sa sút trí tuệ
nhẹ và 100% trong các trường hợp nặng. Trong quá trình nói chuyện, các dấu
hiệu đầu tiên xuất hiện là tình trạng thiếu từ, được thay thế bằng dạng nói quanh.
Ngôn ngữ viết thường bị rối loạn sớm hơn ngôn ngữ nói.
Rối loạn về phối hợp động tác
Các rối loạn trong việc thực hiện các cử chỉ rất phổ biến trong bệnh
Alzheimer. Các rối loạn này hạn chế nhiều sự tự chủ của người bệnh. Khám thần
kinh có thể làm bộc lộ các rối loạn khác nhau về cử chỉ. Mất dùng động tác phản
6

xạ được định nghĩa là mất khả năng lặp lại một cách chính xác các cử chỉ của
hai bàn tay bằng cách bắt chước. Theo một số tác giả, loại mất khả năng dùng
động tác phản xạ là dấu hiệu thần kinh sớm nhất gặp trong bệnh Alzheimer.
Rối loạn nhận thức bằng giác quan
Về phương diện lâm sàng, các rối loạn nhìn hay gặp nhất, mất nhận thức
nhìn gặp trong khoảng 30% trường hợp, biểu hiện duới dạng khó nhìn các đồ vật
hoặc khó đọc, mặc dù có dùng kính điều chỉnh cũng không đỡ. Chưa có trường
hợp nào mất nhận thức về nghe được công bố.

1.4. Cơ chế bệnh sinh bệnh Alzheimer
Bệnh Alzheimer sớm hay bệnh Alzheimer trễ đều có ba đặc điểm giải phẫu
bệnh giống nhau gồm có sự hiện diện của các mảng amyloid (amyloid plaques),
các búi sợi tơ thần kinh (neurofibrillary tangles), và sự mất tế bào thần kinh. Bản
chất của mảng amyloid là sự kết tập ngoài tế bào của protein β amyloid . Sự kết
tập của protein tau và của các tiểu sợi thần kinh (neurofilament) trong thân tế
bào thần kinh tạo ra các búi sợi tơ thần kinh. Chính các mảng amyloid và các búi

chuyển hóa khác đều có nguồn gốc từ APP do sự phân giải protein. Nhiều giả
thuyết cho rằng APP và β amyloid có mối liên hệ với cơ chế bệnh sinh của
Alzheimer. Tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp protein g-secretase (enzym này có
vai trò giải phóng β amyloid peptid từ dạng tiền chất của nó chính là APP) được
hình thành bởi PS1 và PS2. Đột biến trội NST gặp ở APP, PS1 hoặc PS2 sẽ làm
thay đổi quá trình tạo ra APP, thúc đẩy quá trình tổng hợp và tích lũy β amyloid
trong não, là nguyên nhân gây khởi phát sớm bệnh Alzheimer [12].
Một số nghiên cứu đã chứng minh β amyloid làm thay đổi hoạt động của
tế bào thần kinh và các synap, đồng thời sự tích tụ amyloid trong não tạo nên
hoạt động bất thường và gây áp lực cho các synap [30]. Do việc sản xuất β
amyloid được quy định một phần bởi hoạt động của các tế bào thần kinh nên khi
hoạt động thần kinh bất thường có thể kích hoạt một vòng tuần hoàn luẩn quẩn
8

bằng cách tăng sản xuất β amyloid. Điều này làm cho bệnh Alzheimer trầm
trọng hơn.

1.5.2. Protein Tau
Bệnh Alzheimer có tác nhân là nhiều loại protein gây bệnh, tích lũy riêng
rẽ hoặc kết hợp cùng nhau ở trong não. Bệnh Alzheimer có liên quan không chỉ
với sự tích tụ bất thường các mảng amyloid mà còn của các đám rối thần kinh
(NFT). Các đám rối thần kinh hình thành trong tế bào và chủ yếu được tạo thành
do sự bất thường của quá trình biến đổi sau dịch mã sau khi tổng hợp protein
Tau, bao gồm sự tăng phosphoryl hóa và acetyl hóa [14]. Một vài nghiên cứu
gần đây đã đưa ra các quan điểm khác với truyền thống rằng chức năng chính
của protein Tau là để ổn định các vi ống và sự kết tập các protein Tau gây khiếm
khuyết thông qua cơ chế làm mất chức năng các vi ống này. Các nghiên cứu
nuôi cấy tế bào và trên chuột biến đổi gen cho thấy protein Tau có thể tạo điều
kiện hoặc kích thích việc dẫn truyền thần kinh thông qua việc điều hòa sự phân
bố các phân tử dẫn truyền tín hiệu có liên quan đến hoạt động của synap [32].

10

độc thần kinh. Ngoài ra còn có thể phát triển các thuốc bảo vệ ty thể và khung tế
bào chống lại sự tấn công của các mảnh vỡ ApoE độc hại [12].
Một số nghiên cứu gần đây đã giả định rằng những gốc tự do được sinh ra
do quá trình stress oxy hóa và viêm cũng là nguyên nhân quan trọng trong sinh
bệnh học của bệnh Alzheimer.
1.6. Acetylcholinesterase và thuốc kháng enzym acetylcholinesterase
Acetylcholin là chất trung gian hoá học có mặt trong phần lớn các synap
thần kinh trung ương, thần kinh thực vật, thần kinh - cơ. Acetylcholin tìm thấy ở
hành não, cầu não, tiểu não, thân não, não trung gian,thể vân và vỏ não mới
(nhiều nhất ở vùng vận động). Acetylcholin còn tìm thấy trong tuỷ sống, các
hạch thần kinh thực vật, các tận cùng thần kinh tiếp xúc với cơ quan ngoại vi.
AChE là một hydrolase thủy phân acetylcholin, được tìm thấy chủ yếu ở
các nút thần kinh-cơ và các khe synap, nhằm chấm dứt quá trình truyền tín hiệu
ở các khớp thần kinh. AChE có hoạt tính xúc tác cao, mỗi phân tử AChE phân
giải 25000 phân tử ACh mỗi giây. Có bốn vị trí hoạt động chính của AChE
trong quá trình thủy phân ACh là vị trí ester hóa, vị trí anion, túi acyl và vị trí
oxy-anion [38].
Nhóm thuốc ức chế enzym acetylcholinesterase được dùng để cải thiện tình
trạng suy giảm acetylcholin trong hệ thần kinh trung ương ở các bệnh nhân sa
sút trí tuệ do bệnh Alzheimer và những khiếm khuyết này gây suy giảm trí nhớ.
Các thuốc thuộc nhóm này bao gồm: tacrin, donepezil, rivastigmin, galantamin.
Donepezil (Aricept): điều trị bệnh Alzheimer trong tất cả các giai đoạn.
Donepezil là thuốc rất chọn lọc acetylcholinesterase. Sự chọn lọc này được
khẳng định là làm giảm tác dụng phụ của thuốc.
Rivastigmin (Exelon): điều trị bệnh Alzheimer's trong giai đoạn nhẹ và vừa.
Rivastigmin chủ yếu ức chế một trong bốn phân nhóm của enzym
acetylcholinesterase–G1, được tìm thấy ở vùng dưới đồi và vỏ não.
11

12

Butyrylcholinesterase
Sự dẫn truyền thần kinh xảy ra khi acetylcholin được giải phóng từ màng
trước synap rồi liên kết với các thụ thể nicotinic hoặc muscarinic ở màng sau
synap. Bộ não của động vật có vú thường có hai dạng chính của enzym
cholinesterase: acetylcholinesterase và butyrylcholinesterase. Cả hai dạng này
đề có khả năng thủy phân acetylcholin, Hai enzym này khác nhau về mặt di
truyền, cấu trúc và động học. AChE nằm ở khe synap (dạng hòa tan) và màng
synap (dạng liên kết với màng), còn butyrylcholinesterase (BuChE) chủ yếu có
liên quan đến tế bào thần kinh đệm. Một tính chất quan trọng vê sự khác biệt
giữa các chất ức chế cholinesterase là tính đặc hiệu với mỗi loại enzym bị ức
chế. Có ba tác nhân ức chế AChE là ba enzym chính đóng vai trò điều hòa bằng
cách làm giảm nồng độ acetylcholin trong não. Mặc dù chỉ chiếm 10% tổng hoạt
độ cholinesterase trong vỏ thái dương của não khỏe mạnh, 27 nghiên cứu gần
đây đã chỉ ra rằng enzym này có khả năng thủy phân acetylcholin và đóng vai
trò quan trọng trong việc dẫn truyền thần kinh hơn so với nó từng được đánh giá
trước đây. Tầm quan trọng của BuChE trong dẫn truyền thần kinh càng tăng khi
bệnh Alzheimer tiến triển. Bởi vì khi đó hoạt động của enzym AChE giảm tới
45% trong khi hoạt động của BuChE tăng từ 40% đến 90% [19].
Bệnh Alzheimer được đặc trưng bởi sự mất chức năng của hệ cholinergic,
trong đó các thuốc điều trị triệu chứng tỏ ra có hiệu quả cho đến nay là các chất
ức chế cholinesterase nhằm tăng cường hoạt động của cholinergic. Ở não bộ
khỏe mạnh, acetylcholinesterase (AChE) chiếm ưu thế (80%) và
butyrylcholinesterase (BuChE) được đánh giá là chỉ đóng vai trò nhỏ trong việc
điều hòa mức độ acetylcholin. Trong não của bệnh nhân mắc Alzheimer, hoạt độ
của BuChE tăng trong khi hoạt độ của AChE không thay đổi hoặc giảm. Vì vậy
cả hai enzym này đều có khả năng tham gia vào quá trình điều hòa mức
acetylcholin và là mục tiêu trong điều trị bệnh Alzheimer nhằm cải thiện tình
trạng thiếu hụt acetylcholin. Hai enzym này khác nhau về vị trí, tính chất và

Tại Ấn Độ: Tên Brahmi được gọi chung cho rau đắng biển và cả rau má.
Tại Pakistan: rau đắng biển được gọi là Bamb, Ionika. Tại Việt Nam cây còn
được gọi là rau sam trắng, rau sam đắng, cây ruột gà.

Đặc điểm thực vật
Rau đắng biển là dạng cây thảo sống quanh năm, có thân nhẵn, mọc bò rễ
dài 10-40cm. Các cành mọc đứng mềm, không lông, rất đắng. Lá mọc đối,
không cuống, thuôn hình muỗng, dài cỡ 1cm, gân chính hơi khó thấy. Hoa màu
tím xanh hoặc trắng nhạt, mọc riêng lẻ ở nách lá. Quả nang hình trứng có mũi,
nhẵn, có đài tồn tại [8].

Hình 1.2. Hình ảnh rau đắng biển (Bacopa monnieri (Linn) Wettst)
(nguồn trích dẫn hình ảnh: http://en.wikipedia.org/wiki/Bacopa)
2.2. Phân bố
Rau đắng biển sống rộng rãi ở Ấn Độ, Pakistan, Afghanistan, Nepal, Sri
Lanka, châu Phi, châu Úc, vùng cận nhiệt đới ở Mỹ, vùng nhiệt đới ở châu Á từ
Ấn Độ, Sri Lanka, Nam Trung Quốc, Đài Loan sang Đông Nam Á, trong đó có
Việt Nam. Cây mọc tại tại ruộng, trên đất có pha cát, ven ruộng, vùng bãi cỏ ẩm
nơi thấp đến độ cao khoảng 1000m. Tại Việt Nam, cây được gặp hầu như trên
toàn quốc, tại các vùng đồng bằng và trung du Bắc và Nam Việt Nam.
2.3. Thành phần hóa học
15

Một số thành phần hóa học có tác dụng dược lý trong rau đắng biển gồm
alkaloid, saponin và sterol. Mặc dù alkaloid brahmin là thành phần đầu tiên
được xác định trong rau đắng biển nhưng Saponin mới là chất có hoạt tính
chính. Các saponin là glycosid, một đơn vị đường gắn với 1 aglycon
(sapogenin). Phần sapogenin quyết định loại saponin là steroid hoặc triterpenoid.
Thành phần đem lại hiệu quả cải thiện trí nhớ trong rau đắng biển là saponin
triterpenoid có tên là bacosid [33].

Bacopasaponin A, bacopasaponin B và bacopasaponin C:
- Ba saponin triterpenoid được phân lập tiếp theo là bacopasaponin A, B
và C, được xác định tên khoa học:
- Bacopasaponin A: 3-O-α-L-arabinopyranosyl-20-O-α-L-
arabinopyrasonyl –jujubogenin
- Bacopasaponin B: 3-O-[α-L arabinofuranosyl- (1→2)-α-L-
arabinopyranosyl] pseudojujubogenin
- BacopasaponinC: 3-O-β-Dglucopyranosyl(1→3)-{α-L-
arabinofuranosyl-(1→2)}-α-L arabinopyrasonyl] pseudojujubogenin
[21]
Bacopasaponin D, bacopasaponin E, bacopasaponin F, bacopasaponin G
- Bacopasaponin D là một pseudojujubogenin glycoside có tên là 3-O-[α-
L-arabinofuranosyl- (1→2)-β-Dglucopiranosyl] pseudojujubogenin [42].
- Bacopasaponin E và bacopasaponin F (khác nhau ở phần jujubogenins):
được phân lập bởi Mahato và cộng sự năm 1996 [28].
- Bacopasaponin G: Hou và cs đã phân lập được một saponin mới năm
2002 đặt tên là bacopasaponin G, một dẫn xuất được Matsutaka đặt tên là
(3R) - 1- octan- 3yl- (6-O-sulfonyl) - β- D - glucopyranoside, một
phenylethanoid glycoside mới là 3,4-dihydroxyphenylethyl alcohol (2-O-
feruloyl)-β-D-glucopyranoside và một glycoside mới khác là phenylethyl
alcohol [5-O-p-hydroxybenzoyl- β -D-apiofuranosyl-(1→2)]-β-D-
glucopyranoside [41].
Một số saponin khác:
17

Ba saponin mới được phân lập từ rau đắng biển là bacopasids III, IV, V
có tên là : 3-O α-L- arabinofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyljujubogenin, 3-
O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-Larabinopyranosyljujubogenin,3-O-β-D-
glucopyranosyl-(1→3)-α-Larabinofuranosyl pseudojujubogenin [42].
Các thành phần khác: