BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐINH THU HƯƠNG
NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ CHIẾT
ENZYM PROTEASE TỪ VI KHUẨN
Bacillus subtilis natto

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Thị Thanh Thảo cùng toàn thể các thầy, cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn
Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể gia đình, các
thầy cô giáo trong trường và tất cả bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình học tập.

Hà Nội, tháng 10 năm 2013
Học viên
Đinh Thu Hương MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ


1.3.2. Các nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến
khả năng sinh enzyme Nattokinase của vi khuẩn………………….
13
1.3.3. Protease và phương pháp chiết tách protease ngoại bào của vi
sinh vật………………………………………………………………
14
1.3.3.1. Protease và chiết tách protease ngoại bào của vi sinh vật
thuộc chi Bacillus……………………………………………………
14
1.3.3.2. Các phương pháp chiết tách protease ngoại bào của B.
17
subtilis natto…………………………………………………………
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
20
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ……………………………………
20
2.1.1. Vi sinh vật sử dụng……………………………………………
20
2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất và thuốc thử…………………………
20
2.1.3. Môi trường ……………………………………………………
20
2.1.4. Máy móc và dụng cụ…………………………………………
21
2.2. Nội dung nghiên cứu …………………………………………
21
2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy
đến khả năng tạo enzyme protease của Bacillus subtilis natto………
21
2.2.2. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tách chiết và thử hoạt tính

31
Chương 3: THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ …………………….
33
3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả
năng tạo enzyme protease của Bacillus subtilis natto……………
33
3.1.1. Sơ bộ xác định các enzyme có mặt trong môi trường nuôi cấy
B. subtilis natto……………………………………………………
33
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn hydratcarbon………………
34
3.1.3. Lựa chọn nồng độ maltose thích hợp nhất……………………
36
3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của đậu tương và chất cảm ứng lên khả
năng tạo enzyme của vi khuẩn B. subtilis natto………………….
38
3.1.5. Khảo sát ảnh hưởng của một số muối vô cơ …………………
39
3.1.6. Đánh giá khả năng sinh enzyme protease ngoại bào của vi
khuẩn B. subtilis natto trên môi trường kết hợp……………………
40
3.2. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tách chiết và thử hoạt
tính tiêu fibrin của enzyme protease thu được …………………
41
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH dung môi đến hoạt tính enzyme
protease ngoại bào của B. subtilis natto……………………………
41
3.2.2. Lựa chọn phương pháp tách chiết protease ngoại bào của B.
subtilis natto……………………………………………………….
43

4.2.4. Về kết quả điện di một số phân đoạn thu được sau tinh chế…
61
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ……………………………………….
63
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt

Tên đầy đủ
AS


Lần thí nghiệm
nKat

nano Katal
pI

Điểm đẳng điện của protein
Điện di SDS – PAGE

Điện di gel polyacrylamid với sự có mặt của
sodium dodecyl sulfat
SD

Độ lệch chuẩn (Standard deviation)
Tb

Trung bình
TLPT

Trọng lượng phân tử
t – PA

Tissue plasminogen activator (các tác nhân hoạt hóa
plasminogen ở mô)

DANH MỤC CÁC BẢNG

36
Bảng 3.5: Đường kính vòng phân giải casein của dịch lên men khi
nuôi cấy trong môi trường MT2 và MT2 có bổ sung maltose ở các
nồng độ khác nhau
37
Bảng 3.6: Đường kính vòng phân giải tinh bột và CMC của dịch
lên men khi nuôi cấy trong môi trường MT2 có bổ sung maltose ở
các nồng độ khác nhau
37
Bảng 3.7: Đường kính vòng phân giải cơ chất của dịch lên men
khi nuôi cấy trong môi trường MT2 và môi trường MT2 có bổ
sung đậu tương và casein
38
Bảng 3.8: Đường kính vòng phân giải cơ chất của dịch lên men
khi nuôi cấy trong môi trường MT2 và MT2 có bổ sung muối vô
cơ
39
Bảng 3.9: Đường kính vòng phân giải cơ chất của dịch lên men
khi nuôi cấy trong môi trường MT2 và môi trường kết hợp
40
Bảng 3.10: Thời gian tiêu fibrin của dịch lên men thu được khi
nuôi cấy trong môi trường MT2 và môi trường kết hợp
41
Bảng 3.11: Đường kính vòng phân giải casein của dịch trong ở
các pH khác nhau
42
Bảng 3.12: Kết quả thử hoạt tính phân giải cơ chất và thời gian
tiêu fibrin của enzyme protease ngoại bào thu được khi kết tủa
bằng các tác nhân khác nhau
44


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ
Tên hình
Trang
Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis natto
2
Hình 1.2: Cấu trúc bậc 3 của Nattokinase
6
Hình 1.3: Cơ chế tiêu fibrin của Nattokinase
8
Hình 1.4: Hiệu suất và mức tinh sạch của protease chiết tách từ
môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, các chế phẩm enzyme được sản xuất và sử dụng ngày càng rộng
rãi trong nhiều lĩnh vực của đời sống con người. Trong số đó, protease – enzyme
phá vỡ liên kết peptid giữa các acid amin của protein – là enzyme có nhiều ứng
dụng trong một số ngành như chế biến thực phẩm, sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da…
Đặc biệt trong lĩnh vực y tế, các protease đã được sử dụng làm thuốc điều trị và cho
hiệu quả tốt.
Bên cạnh các protease thu nhận được từ các tổ chức của động vật (renin,
trypsin), thực vật (bromelanin, papain), protease có nguồn gốc từ vi sinh vật cũng
đang được nghiên cứu để tìm ra các phương pháp tách chiết tối ưu. Một trong số các
loài vi sinh vật có khả năng sinh ra protease và được ứng dụng nhiều là vi khuẩn
thuộc chi Bacillus [24]. Vi khuẩn B. subtilis natto thuộc chi Bacillus, loài Bacillus
subtilis được biết đến là “nguyên liệu” ủ cùng với đậu tương nấu chín, lên men tạo
nên món ăn truyền thống Natto của Nhật Bản. Năm 1980, giáo sư Sumi người Nhật
đã phát hiện ra trong Natto có chứa Nattokinase – một enzyme thuộc nhóm các
enzyme protease có khả năng phân giải fibrin [28]. Từ đó đến nay, nhiều nghiên
cứu về B. subtilis natto đã được tiến hành và kết quả cho thấy chủng vi khuẩn này
có khả năng sinh ra nhiều enzyme nhóm protease như Nattokinase [21], elastase
[27], bacillopeptidase F [57]…
Trong điều kiện lên men chìm, vi khuẩn B. subtilis natto có khả năng sinh
nhiều enzyme ngoại bào như protease, amylase, cellulase Việc thay đổi môi
trường dinh dưỡng có thể ảnh hưởng đến sự sinh enzyme của vi khuẩn. Vì thế, lựa
chọn môi trường tốt nhất cho B. subtilis natto sinh lượng lớn protease và giảm bớt
các enzyme khác đóng vai trò quan trọng trong việc tách chiết protease, trong đó có
Nattokinase. Vì vậy, luận văn “Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và chiết enzyme
protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis natto
” được thực hiện với 2 mục tiêu:
1. Nghiên cứu được ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy đến khả năng
tạo enzyme protease của Bacillus subtilis natto.

1.1.3. Đặc điểm hình thái

Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis natto (độ phòng đại 100 lần) [64]
Bào tử
Tế bào vi khuẩn

3

B. subtilis natto là trực khuẩn hiếu khí bắt màu tím khi nhuộm Gram, nội bào
tử hình que có kích thước dưới 1μm. Các tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ hay nối với
nhau thành chuỗi (hình 1.1). Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám nhạt, có
kích thước lớn và hình dạng bất định. Bề mặt hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan
rộng trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch [49],[55].
1.1.4. Đặc điểm sinh dưỡng
B. subtilis natto là sinh vật dị dưỡng, có khả năng sử dụng nhiều nguồn
hydratcarbon: đường đơn như glucose, fructose , đường đôi như maltose, lactose,
saccharose , polysaccharid như tinh bột Nguồn nitơ cần thiết cho sự phát triển
của vi khuẩn là protein và amino acid. B. subtilis natto có thể sử dụng dễ dàng acid
glutamic, arginin, acid aspartic nhưng không sử dụng được threonin, tryptophan,
phenylalanin và methionin [55].
1.1.5. Đặc điểm sinh lý
B. subtilis natto là sinh vật hiếu khí, có thể phát triển ở nồng độ oxy lớn hơn
3%. B. subtilis natto phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng (30 – 50
0
C), tối thích là
37
0
C. Nhiệt độ tối thích cho sự nảy mầm của bào tử là 40
0
C. Ở 55

hoạt động của enzyme là 55
0
C, pI = 3,9. Trung tâm hoạt động là bộ ba xúc tác:
Asp33, His81, Ser259 [32],[60].
1.2. Nattokinase
1.2.1. Các enzyme có khả năng tiêu huyết khối trước Nattokinase
Trước khi Nattokinase được nghiên cứu rộng rãi, có nhiều enzyme đã được
ứng dụng trong trị liệu về huyết khối như Streptokinase, Urokinase, Alteplase Cơ
chế chung của các enzyme này là hoạt hóa plasminogen thành plasmin có tác dụng
phân giải fibrin, fibrinogen cùng các yếu tố của quá trình đông máu (yếu tố V, VIII,
XIIIa), đồng thời các sản phẩm giáng hóa của fibrin và fibrinogen cũng có tác dụng
kháng thrombin, ức chế kết tập tiểu cầu để ngăn quá trình đông máu. Vì thế plasmin
có tác dụng làm tan huyết khối, giúp tái lập lại sự tưới máu cho các mô [2]. Căn cứ
vào tính chọn lọc trên fibrin mà người ta chia các enzyme tiêu huyết khối thành hai
nhóm:
a. Enzyme tiêu huyết khối không tác dụng chọn lọc trên fibrin: là những thuốc tác
động đến cả plasminogen gắn hoặc không gắn với fibrin vì thế gây tác dụng không
mong muốn là chảy máu toàn thân. Một số enzyme điển hình của nhóm này như:
- Streptokinase: chiết xuất từ môi trường nuôi cấy các chủng Streptococcus
haemolyticus tan huyết β nhóm C. Streptokinase là protein lạ nên khi vào cơ thể sẽ
kích thích cơ thể sinh kháng thể làm mất hoạt tính và gây dị ứng [2].
- Urokinase: chiết xuất từ nước tiểu người, từ môi trường nuôi cấy tế bào thận
bào thai, hoặc có thể sản xuất bằng công nghệ gen [2].

5

- Anistreplase: là streptokinase thay đổi cấu trúc phân tử bằng công nghệ sinh
học [2].
b. Enzyme tiêu huyết khối tác dụng chọn lọc trên fibrin: là những enzyme hoạt hóa
plasminogen gắn trên fibrin nên có ưu điểm là ít gây chảy máu toàn thân, hiệu lực

nhóm carboxyl của Asp-32. Cơ chất đặc hiệu của Nattokinase là: Suc-Ala-Ala- Pro-
Phe-pNA [9],[63]

Hình 1.2.Cấu trúc bậc 3 của Nattokinase [23]
c. Tính chất
Nattokinase bền vững ở pH từ 6,0 – 10,0, bất hoạt ở pH nhỏ hơn 5 và pH lớn
hơn 11, hoạt tính tối ưu ở pH = 8 – 9. Nattokinase bền vững ở nhiệt độ dưới 40
0
C,
bị giảm hoạt tính khi nhiệt độ tăng lên 50
0
C và bị phân hủy ở 70
0
C [19]. Hoạt tính
của Nattokinase bị ức chế 1 phần bởi HgCl
2
, H
2
O
2
và bị ức chế hoàn toàn bởi
phenylmethylsulfonyl fluorides (PMSF), ethylendiamin tetraacetic acid (EDTA),
các ion Fe
3+
và Al
3+
cũng ức chế enzyme này [19],[23]. Hoạt tính của Nattokinase
tăng lên khi có mặt MgSO
4
, CaCl

-
Không đánh giá đặc
hiệu Nattokinase.
(*1)
-
Có sự
khác nhau
giữa các lần thử
nghiệm do chất thử
là sản phẩm tự
nhiên.

7

Chất
thử tổng
hợp
IU (*2).
U
Plasmin
S-2251
(*3)
-
Đơn giản
-
Có thể cho
kết quả trong
thời gian
ngắn
-

enzyme khác, đặc
biệt là Nattokinase.
Đĩa
fibrin
mm2
(hoặc U
*6)
Enzyme tan
huyết
Fibrin
-
Khá đơn giản
-
Chất thử đặc
hiệu

-

Tính chính xác kém
và không phù hợp
để định lượng
-
Có sự khác nhau
giữa các lần thí
nghiệm do chất thử
là tự nhiên.
Giáng
hóa
fibrin
FU Nattokinase Fibrin

khác nhau:

8 Hình 1.3: Cơ chế tiêu fibrin của Nattokinase [42]
- Nattokinase trực tiếp giáng hoá fibrin trong cục máu đông, làm biến đổi
fibrin từ dạng polymer không tan thành các sản phẩm giáng hoá có trọng lượng
phân tử thấp, hoà tan. Như vậy, Nattokinase có cơ chế tiêu fibrin giống với plasmin.
- Nattokinase giáng hoá fibrin gián tiếp bằng cách hoạt hoá Pro-urokinase
thành Urokinase, dẫn đến thúc đẩy quá trình biến đổi plasminogen thành plasmin,
làm tăng plasmin nội sinh là enzyme phân giải fibrin tự nhiên trong cơ thể.
- Nattokinase giáng hoá fibrin gián tiếp bằng cách hoạt hoá quá trình tổng
hợp t- PA trong huyết tương. Kết quả là tăng cường tạo thành plasmin.
Đặc biệt, Nattokinase không ảnh hưởng đến quá trình hình thành fibrin từ
fibrinogen, do đó không làm suy giảm cơ chế đông máu bình thường của cơ thể. Vì
vậy, Nattokinase không gây ra biến chứng chảy máu như các thuốc chống đông máu
bình thường [42].
f. Công dụng
Trong các protease ngoại bào của B. subtilis natto, Nattokinase có nhiều tiềm
năng được ứng dụng làm dược phẩm. Rất nhiều các nghiên cứu về hiệu quả của
enzyme này trong điều trị bệnh huyết khối và bệnh tim mạch liên quan như nghiên
cứu tiền lâm sàng và lâm sàng của Fujita năm 1995 [21], Maruyama năm 1998 [39],
Haritha M năm 2011 [25] đã chứng minh Nattokinase có tác dụng làm tan cục máu
đông và phòng chống huyết khối thông qua các cơ chế: trực tiếp giáng hóa fibrin
trong cục máu đông; hoạt hóa quá trình tổng hợp t – PA trong huyết tương; thúc đẩy
quá trình biến đổi plasminogen thành plasmin; tăng cường plasmin nội sinh [21]

9



10

phẩm viên nén từ enzyme này giá khoảng 10.000 đồng/viên (hoạt tính 1000 FU), và
được khuyến cáo sử dụng hàng ngày. Các sản phẩm bán trong nước hiện tại giá dao
động trong khoảng 4.000 - 5.000 đồng/viên (hoạt tính 300 FU) dưới dạng thực
phẩm chức năng. Từ đó cho thấy nguồn nguyên liệu enzyme này có thị trường rất
tiềm năng.
Các sản phẩm Nattokinase trên thị trường hiện nay:

Sản phẩm từ Nhật Bản
Sản phẩm Việt Nam, nguyên liệu nhập khẩu

11

Bảng 1.2: Thực phẩm chức năng chứa Nattokinase
Sản phẩm
Hàm lượng
Nattokinase
(FU)
Dạng bào

Ngày nay, người ta có thể tổng hợp enzyme bằng phương pháp hóa học
(synzym), tìm ra các kháng thể có hoạt tính xúc tác (abzym), acid ribonucleic có
hoạt tính xúc tác (ribozym)… Tuy nhiên, đa số các enzyme hiện nay vẫn được chiết
tách từ các tổ chức của động vật; thực vật; và chủ yếu là từ vi sinh vật [4].
Vi sinh vật là nguồn thu enzyme rất phong phú trong đó có những enzyme
mà cơ thể động vật và thực vật không thể tổng hợp được. Vi sinh vật có khả năng
sinh tổng hợp enzyme với một lượng lớn, trong thời gian ngắn. Con người có thể
tác động vào vi sinh vật để thu được enzyme theo ý muốn. Mặt khác enzyme vi sinh
vật thường có hoạt tính mạnh [11],[29].
Quy trình thu nhận chế phẩm enzyme từ vi sinh vật gồm bốn giai đoạn chủ
yếu:
 Phân lập, tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật
 Nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme
 Chiết tách và thu nhận enzyme
 Tinh sạch thu chế phẩm enzyme
1.3.1. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự tổng hợp enzyme từ vi sinh vật
a. Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng

12

Dinh dưỡng là yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển và tổng
hợp enzyme của vi sinh vật. Cùng một loại vi sinh vật nhưng nếu nuôi cấy trên các
môi trường có thành phần dinh dưỡng khác nhau thì mức độ tạo thành enzyme và
thành phần enzyme được tạo thành cũng khác nhau. Hiện tượng này chỉ thấy ở vi
sinh vật chứ không thấy ở động và thực vật. Khi trong môi trường có những chất
khó đồng hóa, vi sinh vật phải tiết vào môi trường những enzyme tương ứng để
phân hủy chúng thành những chất đồng hóa được. Vì vậy khi cho chất cảm ứng vào
môi trường dinh dưỡng thì khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật có thể
tăng lên gấp nhiều lần so với trường hợp bình thường.Trong công nghệ sản xuất
enzyme cần phải lựa chọn chất cảm ứng thích hợp và xác định nồng độ tối ưu của

men bán rắn chủng B. subtilis natto trên cơ chất đậu nành nấu chín hoặc lên men
dịch thể. Một số hướng nghiên cứu Nattokinase tái tổ hợp cũng đang được tiến hành
đem lại kết quả bước đầu khả quan. Mới đây, Weng và cộng sự đã nghiên cứu cải
thiện tính bền nhiệt và hạn chế sự oxy hóa Nattokinase tái tổ hợp ở E. coli bằng đột
biến điểm: thay thế Methionin tại vị trí 222 (vì gần vị trí xúc tác Ser221 của
enzyme) bằng Alanin đã giảm khả năng bị oxy hóa enzyme này [59]. Trong nước,
Nguyễn Thị Thảo và cộng sự (2008) đã nhân dòng, phân tích trình tự và biểu hiện
gen mã hóa Subtilisin từ các chủng B. subtilis G1 và RD23 trong E. coli
BL21/pESUb [11]…. Tuy nhiên công nghệ lên men tạo enzyme Nattokinase vẫn là
một hướng nghiên cứu lâu đời và có nhiều triển vọng trong sản xuất enzyme nhằm
sản xuất với số lượng lớn và giảm giá thành sản xuất cho sản phẩm.
Trong những năm gần đây có nhiều nghiên cứu về tối ưu hóa môi trường
nuôi cấy vi khuẩn cho sản lượng Nattokinase cao nhất.
a. Ngoài nước

Junguo Liu và cộng sự (2005) nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện dinh
dưỡng cho sinh tổng hợp Nattokinase sử dụng chủng B. subtilis natto NLSSE. Khảo
sát các nguồn nitrogen: (NH
4
)
2
SO
4
, NaNO
3
, natri glutamat, casein, pepton từ đậu
nành và khảo sát các nguồn carbon: glucose, saccharose, maltose, xylose và
glycerol với hàm lượng 20 g/l. Tối ưu hóa 6 nhân tố dinh dưỡng: nguồn C, N,
MgSO
4