BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

THIẾT LẬP MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VÀ ĐIỀU KIỆN
NUÔI CẤY ĐỂ SẢN XUẤT PRODIGIOSIN TỪ VI KHUẨN
SERRATIA MARCESCENS SH1

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1051110139

:TRẦN LÂM TÚ QUYÊN
Lớp: 10DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2014


Đồ án tốt nghiệp

LỞI CẢM ƠN
Em xin được trân trọng cảm ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Thực

Sinh viên thực hiện


Đồ án tốt nghiệp

Mở Đầu
1. Tính cấp thiết của đề tài
Các nguồn tài nguyên thiên nhiên, chẳng hạn như thực vật, vi sinh vật, động vật
có xương sống và không xương sống là những nguồn có giá trị của các hợp chất
hoạt tính sinh học. Một số lượng lớn các loại thuốc đã được phát triển trong ngành
y từ các sản phẩm tự nhiên (Amador và cộng sự. 2003). Kể từ khi phát hiện và
thành công trong việc điều trị của peniciline, các vi sinh vật đã được sử dụng như
một nguồn đặc biệt của các tác nhân hoạt tính sinh học có cấu trúc đa dạng. các ứng
dụng điều trị của các chất chuyển hóa của vi sinh vật cung cấp cơ hội cho việc phát
hiện ra kháng sinh (ví dụ peniciline, erythromycin…), ức chế miễn dịch trong cấy
ghép, các tác nhân giảm cholesterol (ví dụ : lovastain và mevastatin) và tác nhân
chống ung thư (ví dụ: doxorubicin, daunorubicin, bleomycin và pentostatin).
Từ khi nền khoa học hiện đại bắt đầu, các hợp chất thứ cấp tự nhiên được chiết
xuất từ trái cây, rau, hạt, rễ cũng như từ vi sinh vật đã được sử dụng trong việc làm
thuốc đông y, mỹ phẩm, thực phẩm ,... Nhưng sau đó, các hợp chất thứ cấp tự nhiên
đã được nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc hóa học cũng như cách tổng hợp bằng
phương pháp hóa học, bởi người ta cho rằng chúng bền hơn, có thể sản xuất trên
quy mô lớn và chi phí sản xuất thấp. Tuy nhiên, các vấn đề ô nhiễm môi trường và
ảnh hưởng xấu đến sức khỏe gây ra bởi các hợp chất tổng hợp hóa học đã bắt đầu
được quan tâm.
So với các hợp chất thứ cấp từ thực vật và động vật thì các hợp chất từ vi sinh
vật ngày càng được quan tâm và phát triển, vì vi sinh vật cũng là một yếu tố tự
nhiên và an toàn để sử dụng, sản xuất được quanh năm trong các điều kiện địa lý
khác nhau và do sự tăng trưởng nhanh chóng của vi sinh vật nên sẽ làm giảm thời
gian sản xuất xuống còn chỉ một vài ngày. So với các nguồn khác từ thực vật hoặc

nhất.
4. Ý nhĩa thực tiễn
Prodigiosin là hợp chất thứ cấp vi sinh vật được nghiên cứu phát triển dược
phẩm nên được bán trên thị trường với giá rất cao. Thành công của đề tài sẽ góp
phần vào việc tìm được môi trường tốt nhất và điều kiện nuôi cấy tối ưu để sản xuất
và ứng dụng hợp chất prodigiosin.

2


Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 1. TỒNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật

1.1.1. Hợp chất thứ cấp
Hợp chất thứ cấp là chất được tạo ra từ hợp chất sơ cấp, có trọng lượng phân tử
nhỏ, thường được gọi là chất có hoạt tính sinh học đóng vai trò điều hòa quan hệ
sinh thái của chủ thể với các tác động lên chủ thể của môi trường xung quanh.
Hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật là những hợp chất được vi sinh vật tạo ra từ quá
trình chuyển hóa hợp chất sơ cấp
1.1.2. Triển vọng và tiềm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật
Vi sinh vật đã được sử dụng trong một thời gian dài cho sản xuất các phân tử
sinh học như thuốc kháng sinh, enzyme, vitamine và các tác nhân chỉ thị. Có sự
quan tâm ngày càng tăng trong ngành công nghiệp thực phẩm trong việc sử dụng
các thành phần tự nhiên. Các thành phần, chẳng hạn như hợp chất thứ cấp, được
xem là tự nhiên khi xuất phát từ nguồn gốc sinh học như động vật, thực vật hoặc
vi sinh vật. Hợp chất thứ cấp của vi sinh vật được sử dụng trong ngành công nghiệp


Ứng dụng

cấp

Kiểu tác động ức chế

Penicillium notatum,

Ức chế tụ cầu

Ức chế tạo polymer

Penicillium

khuẩn, nhiễm

vách tế bào vi khuẩn,

trùng kỵ khí,

ức chế hấp thu amino

giang mai, hen

acid và protein, ức chế

suyễn.

tạo enzyme

chu trình Creb…
Steptomyces

Ức chế đối với

Ức chế đặc hiệu sinh

venezuelae

bệnh lỵ, sốt cao,

tổng hợp protein vi

sốt phát ban

khuẩn liên quan đến

Chloramphenicol

peptidyl transferase
trong tiểu đơn vị
Ribosome 50s, ngăn
không cho tạo liên kết
peptide

4


Đồ án tốt nghiệp


Streptomyces fradiae

Tác dụng vi
Neomycin

Hơi độc

khuẩnn Gram âm
và Gram dương

Streptomyces
kanamycetius

Kanamycin

Điều trị lao, ức

Tác động giống như

chế vi khuẩn

streptomycin và

Gram âm và

neomycin

Gram dương
Streptomyces
lavendulae


Streptoverticillium rubrireticuli

và

Streptomyces longisporus (Khanafari và cộng sự, 2006). Hình 1.1 trình bày cấu trúc
hóa học của các hợp chất đại diện của prodigiosin.

Hình 1.1. Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003)
1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin
Mãi đến năm 1960, công thức hóa học chính xác của prodigiosin được tổng hợp
bởi Serrattia marcescens mới được biết đến (Rapoport và Holden, 1962). Do sự tiến
bộ nhanh chóng trong khoa học phân tích và quang phổ ở những năm tiếp theo,
mà cấu trúc của prodigiosin dần được nghiên cứu rõ ràng hơn (Hesse, 2000).

6


Đồ án tốt nghiệp

Prodigiosin với tên gọi (5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-ylidene)methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) có công thức phân tử C20H25N3O và
trọng lượng phân tử là 323,44 Da (Harris và cộng sự, 2004; Song và cộng
sự, 2006; Williamson và cộng sự, 2006).
Prodigiosin là một alkaloid có cấu trúc hóa học đặc biệt, với ba vòng pyrrole tạo
thành bộ khung pyrrolylpyrromethane, trong đó hai vòng đầu liên kết trực tiếp với
nhau, còn vòng thứ ba được gắn vào thông qua cầu nối methene (Qadri và Williams,
1972; Gerber, 1975). Cấu trúc của prodigiosin có bảy liên kết đôi và được miêu tả là
tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008).
Prodigiosin nhạy cảm với ánh sáng và không tan được trong nước. Prodigiosin
có thể tan tương đối trong alcohol và ether; bên cạnh đó, nó dễ tan trong

phân tử và
công thức

2-Methyl-3-amyl-6-

323,4 Da C20

methoxy prodigiosene

H25 N30

2-Methyl-3-amyl-6-

309,4 Da

hydroxy-prodigiosene

C10 H23N3O

2-Nonly-6-

363,5 Da

methoxyprodigiosene

C23H31 N3O


Đồ án tốt nghiệp



Cyclononylprodigiosin

Madurae
Nocardia
(Actinomadura)
pellctieri
Streptomyces
longisporusruber và
Nocardia

Undccylprodigiosin

(Actinomadura)
pelletieri
Streplonlyces
longisporusruber

2,4-(9-Ethylnonano)
Metacycloprodigiosin

-6methoxyprodigiosene

391,6 Da
C25H33N3O

1.2.3. Hoạt tính sinh học của prodigiosin
1.2.3.1. Hoạt tính kháng khuẩn
Prodigiosin có khả năng ức chế sự tăng trưởng của một số loài vi
khuẩn (Khanafari và cộng sự, 2006). Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin

Nhiều nghiên cứu đã dần làm sáng tỏ con đường prodigiosin gây sự tự hủy của
các tế bào (Chia-Che và cộng sự, 2011). Cơ chế kháng tế bào ung thư của
prodigiosin được mô tả cụ thể như sau:

9


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.2. Cơ chế kháng tế bào ung thư của prodigiosin (Chia-Che và cộng sự,
2011)
Quá trình acid hóa pH trong tế bào (pHi) rõ ràng là một kích hoạt quan trọng
của quá trình tự hủy trong tế bào (Lagadic-Gossmann và cộng sự, 2004). Acid hóa
nội bào là cần thiết cho cycloprodigiosin kích thích quá trình tự hủy trong tế bào
HL-60 (Yamamoto và cộng sự, 2000), cũng tương tự như prodigiosin gây ra sự tự
hủy ở tế bào ung thư ruột (Castillo-Avila và cộng sự, 2005).
Các kết cấu của BCL-2 rất quan trọng trong việc tiến hành con đường tự hủy
của ty thể bằng cách điều hòa tính thấm của màng ty thể bên ngoài. Tăng tính thấm
của màng ty thể bên ngoài sẽ dẫn đến việc hình thành cytosolic của cytochrome c,
nhằm kích hoạt caspase-9 bắt đầu caspase để tạo ra quá trình tự hủy. Prodigiosin
được biết là tác nhân gây ra sự kích thích quá trình tự hủy của protein BCL-2 BAX
trong tế bào MCF-7 (Soto-Cerrato và cộng sự, 2004). Tương tự như vậy, các nghiên
cứu cũng đã chứng minh trước đó undecylprodigiosin giảm sự ngăn chặn tự
hủy BCL-XL nhưng nâng kích thích tự hủy BIK, BIM, MCL-1S và NOXA (Ho và
cộng sự, 2007).
Survivin và XIAP là chất ức chế nội sinh của caspase. Survivin hoặc XIAP
cao sẽ tạo ra sự đề kháng, điều này rất phổ biến trong các tế bào ung thư (Schimmer
và cộng sự, 2006; Altieri, 2008). Một nghiên cứu trước đó của các tác giả thấy rằng

10

11


Đồ án tốt nghiệp

Ngoài ra, prodigiosin cũng được tìm thấy gây độc tế bào ung thư phổi và các tế
bào biểu mô kháng doxorubicin và biểu hiện tốt lên các protein đa kháng
thuốc (Lagostera và cộng sự, 2005).
1.2.3.3. Hoạt tính ức chế miễn dịch
Hoạt động ức chế miễn dịch của prodigiosin lần đầu tiên được mô tả
bởi Nakamura và cộng sự, họ đã cho thấy sự hiện diện của prodigiosin và
metacycloprodigiosin trong canh trường nuôi cấy vi khuẩn Serratia và quan sát sự
ức chế chọn lọc quá trình phát triên của các tế bào lympho T đa giá so với các tế
bào lympho B (Han và cộng sự, 2001). Sau đó, hoạt động ức chế miễn dịch đã được
chứng minh cho các chất tương tự prodigiosin khác như: undecylprodigiosin, cPrG,
MAMPDM, nonylprodigiosin,…
Bảng 1.3. Ảnh hưởng prodigiosin đến khả năng tồn tại của các tế bào miễn dịch
(Hwanmook và cộng sự, 2003)
Prodigiosin
(nM)
Đồi chứng

Thử nghiệm

Khả năng tồn tại (%)
Ngay thứ
nhất

Ngày thứ hai


70

81

100

82

70

70

300

68

14

18

1000

74

14

14

3000


bởi Serratia marcescens UCP 1549 bằng việc sử dụng 6% nước thải từ công nghiệp
chế biến sắn và bổ sung 2% mannitol ở 28oC và pH =7 trong 48 giờ. Kết quả cho
thấy Serratia marcescens sản xuất prodigiosin ở mức cao nhất là 49,5 g/l.
Antony và cộng sự (2011), đã thực hiện quá trình tối ưu hóa sản xuất
prodigiosin bởi Serratia marcescens SU-10 và đánh giá các hoạt tính sinh học của
prodigiosin. Kết quả cho thấy điều kiện tối ưu cho việc sản xuất prodigiosin trong
môi trường Nutrient broth là ở nhiệt độ 28oC, pH = 7 và trong thời gian 72 giờ. Và
quá trình chiết xuất prodigiosin được thực hiện bằng ethanol: hydrochloric
acid (9,5: 0,5) hoặc acetone: ethyl acetate (1:1). Ngoài ra, prodigiosin thu nhận
được có tác dụng ức chế tốt ở cả vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm.
Chandni và cộng sự (2012), đã nhận thấy rằng prodigiosin có khả năng kháng
khuẩn như Staphylococcus aureus, Bacillus cereus và kháng nấm bệnh như
Candida albicans,

Candida parapsilosis

và

Cryptococcus

sp., hơn nữa,

prodigiosin có khả năng chống oxy hóa ở nồng độ 22,05 μg/ml và có tiềm năng
nhuộm, cùng với việc không bị ảnh hưởng bởi acid, kiềm , chất tẩy rửa, mà có thể
ứng dụng rộng rãi trong ngành dệt và các ngành công nghiệp trị liệu.
Shahitha và Poornima (2012), đã tiến hành cải tiến quá trình sản xuất
prodigiosin trong Serratia marcescens. Họ nhận thấy rằng trong số các môi
trường dầu khác nhau thì dầu đậu phộng sản xuất prodigiosin cao nhất (2,72
mg/ml) và có thể sử dụng để nhuộm bông tạo ra màu đẹp.
San và cộng sự (2012), đã sử dụng chất thải chế biến thủy sản như một nguồn

pyrrole của MBC. Quá trình tổng hợp sắc tố này cần có không khí và phân tử oxy
(Williams và Qadri, 1980).

Hình 1.3. So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) tử Serratia ATCC
39.600, Sma 274 và các cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) tử
Streptomyces coelicolor A3(2) (Cerdeno và cộng sự, 2001).
Prodigiosin là một chất rất dễ dàng để thực hiện thử nghiệm trong các
chất chuyển hóa của Serratia marcescens và có thể hữu ích đối với việc nghiên cứu

14


Đồ án tốt nghiệp

một hệ thống mô hình các cơ chế biểu hiện của chất chuyển hóa thứ cấp trong vi
khuẩn. Tách các phân tử tái tổ hợp mã hóa cho quá trình tổng hợp prodigiosin sẽ là
một cách tiếp cận để xác định sản phẩm gene và sự hiểu biết về enzymology và di
truyền học của quá trình sinh tổng hợp prodigiosin. Việc tách trình tự của DNA mã
hóa một phần trong quá trình tổng hợp prodigiosin bằng cách sử dụng hệ thống
nhân bản vector ở Escherichia coli cosmid đã được báo cáo (Dauenhauer và cộng
sự, 1984).
Cụm gene tổng hợp sắc tố của Serratia spp. ATCC 39.006 được biểu hiện
trong Erwinia carotovora sub sp. carotovora (25 chủng trong số 36 chủng thử
nghiệm), mặc dù nó đã không được biểu hiện trong một số chủng vi khuẩn
khác thuộc Enterobacteriaceae, bao gồm cả Escherichia coli (Thomson và
cộng sự, 2000). Trong Serratia ATCC 39.006 tổng hợp prodigiosin được quy định
bởi nhiều yếu tố, bao gồm hệ thống quorum-sensing, thông qua các đồng đẳng
LuxIR, SmaI và SmaR (Thomson và cộng sự, 2000; Slater và cộng sự, 2003). Điều
thú vị là việc sản xuất prodigiosin tạo thành N-(3 oxohexanoyl)-L-homoserine
lacton (OHHL) tùy thuộc vào sự biểu hiện trong Erwinia carotovora sub sp.

các chủng Serratia marcescens là môi trường phức tạp và rất giàu dinh dưỡng
(Yamashita và cộng sự, 2001; Furstner, 2003; Giri và cộng sự, 2004). Một số chất
dinh dưỡng như thiamine và acid sắt (Wei và Chen, 2005) đặc biệt quan
trọng đối với sản xuất prodigiosin, trong khi phosphate (Witney và cộng sự,
1977), adenosine triphosphate và ribose (Lawanson và Sholeye, 1975) lại có
tác dụng ức chế sản lượng prodigiosin.

Hình 1.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp prodigiosin bởi
Serratia marcescens (Sundaramoorthy và cộng sự, 2009)
Giri và cộng sự (2004), đã so sánh sự phát triển của Serratia marcescens trên
các môi trường khác nhau như: môi trường hạt mè, nutrient broth và peptone
glycerol broth,... Các môi trường cũng được so sánh tốc độ tăng trưởng và khả
năng xuất prodigiosin ở các nhiệt độ khác nhau. Các thí nghiệm này cũng giúp quan

16


Đồ án tốt nghiệp

sát vai trò của các acid béo trong việc sản xuất prodigiosin và nhận thấy nhiều
thành phần trong hạt có thể kích thích tăng mật độ tế bào và sinh tổng hợp nhiều
prodigiosin hơn. Trên môi trường peanut broth thì prodigiosin có thể tổng hợp ở
nhiệt độ 37oC trong khi trên các môi trường như nutrient broth, peptone
glycerol broth có hoặc không có bổ sung đường cũng không thể làm được
điều này (Chidambaram và Perumalsamy, 2009).
Quá trình sản xuất prodigiosin ở Serratia marcescens giảm bởi glucose và các
loại đường metabolizable khác do sự giảm pH trong canh trường nuôi cấy
Khanafari và cộng sự, 2006). Bên cạnh đó, có thể xét đến vai trò của nguồn carbon
trong quá trình sản xuất sắc tố. Điểm đầu tiên là trong nutrient broth, về cơ bản là
môi trường này không có nguồn carbon, việc bổ sung maltose hoặc glucose

Tác giả

280C

300C

370C

13,0

-

-

Môi trường dextrose bổ sung
casein

Pruss and
Matsummura,
1996

2

Ethanol và nguồn carbon

3,0

-

-

Môi trường hạt mè

16,68

9,3

0,319

Giri and cs, 2004

6

Canh dinh dưỡng bổ sung 0,5%

1,836

0,79

0,104

Giri and cs, 2004

1,698

0,29

0,104

Giri and cs, 2004


0,5% glucose

10

Môi trường dầu mè

0,767

1,006

0,107

Giri and cs, 2004

11

Môi trường hạt đậu phộng

38,75

25,98

1,49

Giri and cs, 2004

12

Môi trường dầu đậu phộng


Giri and cs, 2004

Prodigiosin được phân lập từ Serratia marcescens. Hiển thị kháng khuẩn, chống
ung thư, gây độc tế bào, ức chế miễn dịch, và chống các hoạt động đào thải trong
quá trình cấy ghép . Prodigiosin gây ra ức chế trong tế bào ung thư máu và các tế
bào có nguồn gốc từ các loại ung thư khác của con người, bao gồm cả dạ dày và đại

18


Đồ án tốt nghiệp

tràng không có độc tính đáng kể trong các dòng tế bào ác tính. Vì vậy, prodigiosin
được sản xuất mang tính thương mại trên toàn thế giới, điều đó được thể hiện trong
bảng 1.5.
Bảng 1.5. Giá trị thương mại prodigiosin trên thế giới (Santa Cruz Biotechnology,
Merck Millipore, Biovision incorporated)

ST

GÍA THÀNH

T

SẢN PHẨM

ĐỘ
TINH

THÔNG SỐ KỸ THUẬT


đậm

một mTORC1
và mRTOC2
ức chế chất
phát triển phức
tạp. Chỉ sử
dụng cho
nghiên cứu,
không sử dụng
cho người

- Trạng thái vật lý: rắn
- Có nguồn gốc từ: Serratia
marcescens
349 $/500 𝜇g
2

= 6980000

- Độ hòa tan: Hòa tan trong
>95%

VNĐ/ 500 𝜇g

ethanol, methanol, DMF hoặc
DMSO. Tan trong nước hạn chế
- Bảo quản: ở nhiệt độ -20°C
- Điểm nóng chảy: 151-152ºC

- Xuất hiện: rắn, màu đỏ đậm

hợp chất tế

- Lưu trữ dài hạn: -20 ° C

bào thẩm thấu

- Độ hòa tan: Hòa tan trong

có hiển thị ức

ethanol, methanol, DMF hoặc

chế miễn dịch

DMSO. Tan trong nước hạn chế.

và chống khối

- Đóng gói khí trơ

u đặc tính
không phân
biệt tình trạng
p53 và kháng
đa thuốc.

1.3.4. Thu nhận, tinh sạch và định lượng prodigiosin
1.3.4.1. Thu nhận và tinh sạch

Các chất chiết xuất được hòa tan và được thực hiện quét từ bước sóng 200 – 700
nm. Hỗn hợp dung môi dichloromethane, chloroform và acetone với tỷ lệ 2,5: 2,5:
0,5 đã được sử dụng để tách một cách hiệu quả các tạp chất từ chiết xuất cùng với
các sắc tố bằng sắc ký lớp mỏng. Cột silicagel có kích thước từ 80 – 100 mesh đã
được sử dụng để phân tách các tạp chất không màu từ các sắc tố. Mẫu tinh khiết
cho thấy có độ hấp thụ cao duy nhất tại 535 nm trong quang phổ UV. Nó được tiếp
tục phân tích để xác định trọng lượng phân tử bằng việc sử dụng máy quang phổ
khối. Các sắc tố prodigiosin tinh khiết được đem phân tích quang phổ khối cho
thấy chúng có trọng lượng phân tử là 324 Da (Giri và cộng sự, 2004).
- Prodigiosin được chiết xuất bằng cách lắc môi trường nuôi cấy tế bào
Serratia marcescens 2170 với methanol có tính acid (1ml dung dịch HCl 1N: 24ml
methanol) và dịch trong suốt được làm cho bay hơi trong chân không. Sắc ký lỏng
cao áp của các chiết xuất được thực hiện trên silicagel với dung môi chloroform và
methanol. Các sắc tố thu được sẽ được rửa giải trong methanol và phân tích
bởi phương pháp phổ khối (ESI-MS). Sau đó, các sắc tố chưa tinh khiết đã thu
được sẽ tiếp tục được thực hiện phương pháp HPLC. Một cột đảo pha Nucleosil
C18 (250x4 mm, 10 vm) đã được sử dụng với một gradient tuyến tính 0% đến
100% trong 30 phút (A: 10mM amoni acetate, pH 7,0, B: 100% acetonitrile). Việc

21


Đồ án tốt nghiệp

rửa giải được theo dõi bằng cách sử dụng cả hai máy dò UV diode-array và ESI-MS
(Montaner và Perez-Tomas, 2001; Tomas và Montaner, 2003).
- Sau khi lên men Serratia marcescens phân lập từ đất, canh trường được lấy
từ những chất hấp thụ trong bioreactor (IAB) và sau đó, 1 lít ethanol 95% (v/v) đã
acid hóa (pH 3,0) được thêm vào IAB. Các sắc tố được chiết xuất bằng
cách sử dụng một vòng tròn giải hấp impller trong IAB, ở 200 vòng trong 5 giờ,