BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
TRỊNH THỊ PHƢƠNG DUNG
XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH (ĐỊNH
TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG) BIFIDOBACTERIUM
LONGUM TRONG CÁC CHẾ PHẨM
PROBIOTICS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ 60 72 04 10
Người hướng dẫn khoa học: TS. Trần Việt Hùng
HÀ NỘI 2014
LỜI CẢM ƠN
Luận văn này được hoàn thành tại khoa Vi Sinh – Viện Kiểm nghiệm Thuốc
Trung Ương – Bộ Y tế. Để có được bản luận văn tốt nghiệp này tôi xin bày tỏ lòng
biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Trần Việt Hùng, người thầy đã trực tiếp hướng
dẫn, dìu dắt tôi trong suốt thời gian thực hiện nghiên cứu này.
Xin chân thành cám ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau
đại học, Bộ môn Kiểm Nghiệm Thuốc và Độc chất và các Bộ môn khác của trường
Đại Học Dược Hà Nội đã giúp tôi trang bị tri thức, tạo môi trường, điều kiện thuận
lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong quá trình hoàn
thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đoàn Cao Sơn – Viện trưởng Viện kiểm
1.3.1. Đặc điểm hình thái 7
1.3.2. Khả năng chuyển hóa carbohydrat [31]. 8
1.3.3. Cấu trúc gen cuả B. longum [24] 8
1.3.4. Vai trò của B. longum [9], [11], [24], [26] , [15], [33], [35]. 9
1.3.5. Phương pháp kiểm nghiệm B. longum trong chế phẩm probiotics 10
1.3.6. Tình hình nghiên cứu định tính và định lượng B. longum trong các chế
phẩm probiotics trong những năm gần đây 17
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
2.1. PHƢƠNG TIỆN DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU 20
2.1.1. Môi trường, hoá chất, dung môi, thiết bị 20
2.1.1.1. Môi trường 20
2.1.1.2. Hoá chất, dung môi 22
2.1.1.3. Thiết bị, dụng cụ 23
2.1.2. Phần mềm xử lý kết quả: Apiweb của hãng BioMérieux. 24
2.1.3. Chủng vi sinh vật chuẩn 24
2.2. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 25 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
2.3.1. Phương pháp định lượng B. longum trong chế phẩm 26
2.3.2. Phương pháp định danh vi sinh vật bằng kit API 20A 27
2.3.2.1. Nguyên tắc chung 27
2.3.2.2. Tiến hành 28
2.3.3. Định danh đến loài bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 31
2.3.3.1. Sơ đồ chung định tính B. longum trong các chế phẩm probiotics
bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 31
2.3.3.2. Tách DNA vi khuẩn bằng WizardR Genomic DNA Purification Kit
32
2.3.3.3. Định lượng DNA bằng phương pháp đo độ hấp thụ ánh sáng tử
3.3.3. Nhân dòng và giải trình tự 55
3.3.3.1.Tinh sạch sản phẩm PCR nhân bản các đoạn gen đặc hiệu của các vi
sinh vật phân lập từ các mẫu nghiên cứu bằng bộ kit Fermentas 55
3.3.3.2. Nhân dòng các đoạn gen đặc hiệu vào vector nhân dòng và biến nạp
vào tế bào E. coli chủng DH5α 56
3.3.3.3. Kiểm tra sự có mặt của các đoạn gen đặc hiệu trong plasmid tái tổ
hợp 57
3.3.3.4. Giải trình tự mẫu chứa phân đoạn 831 bp 60
3.4. ĐÁNH GIÁ PHƢƠNG PHÁP 62
3.4.1. Kết quả kiểm tra tính chọn lọc của môi trường định lượng BSM agar . 62
3.4.2. Độ lặp lại của phép định lượng 63
3.4.3. Thẩm định độ đặc hiệu của quy trình định danh vi sinh vật bằng kit API
20A 64
3.4.4. Đánh giá độ đặc hiệu của quy trình định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật
PCR 65
3.4.5. Xác định ngưỡng phát hiện của quy trình nhân bản đoạn gen đặc hiệu
của B. longum bằng cặp mồi đặc hiệu. 68
CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN 71
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 73
TÀI LIỆU THAM KHẢO 74
PHỤ LỤC
CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AA: Acid acetic
AL: Acid lactic
ATCC: American Type Culture Collection
B. longum: Bifidobacterium longum
dATP: Deoxy adenosine Triphosphat
22
Bảng 2.3
Các vi sinh vật chuẩn được sử dụng
24
Bảng 2.4
Cách đọc kết quả kit Api 20A
30
Bảng 2.5
Trình tự các cặp mồi dùng cho phản ứng PCR
34
Bảng 2.6
Thành phần của phản ứng PCR kiểm tra DNA mới tách
35
Bảng 2.7
Thành phần của phản ứng PCR đơn mồi
36
Bảng 2.8
Thành phần phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector
38
Bảng 2.9
Các chủng chuẩn kiểm tra tính chọn lọc của môi trường BSM
agar
40
Bảng 2.10
Công thức tính độ đặc hiệu
42
68
Bảng 3.10
Kết quả xác định ngưỡng phát hiện
69
DANH MỤC HÌNH Trang
Hình 1.1
Hình ảnh B. longum trên kính hiển vi điện tử
8
Hình 1.2
Hình ảnh genom B. longum
8
Hình 1.3
Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase
14
Hình 1.4
Hình minh họa kỹ thuật PCR
14
Hình 2.1
52
Hình 3.8
Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen đặc hiệu
của B. longum bằng cặp mồi BlonF/BlonR
54
Hình 3.9
Kết quả điện di mẫu tinh sạch sản phẩm PCR nhân bản các
đoạn gen đặc hiệu phân lập từ các mẫu nghiên cứu trên gel
agarose 1%
55
Hình 3.10
Sơ đồ vector nhân dòng pGEMT-eseay
56
Hình 3.11
Kết quả biến nạp sản phẩm gắn vào vi khuẩn E. Coli DH5α. và
cấy trải trên môi trường nuôi cấy có bổ sung ampicillin
100µg/ml
57
Hình 3.12
Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra plasmid tái tổ hợp
mang các đoạn gen có kích thước 831bp
58
Hình 3.13
Kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn vector tái tổ hợp mang
các phân đoạn 831 bp bằng enzym EcoRI
59 Hình 3.14
chi Lactobacillus và chi Bifidobacterium, vi khuẩn sinh bào tử Bacillus, nấm
Saccharomyces cerevisiae…
Theo Robin Temmerman (2001) trong số 55 mẫu khảo sát chỉ có khoảng 20%
chế phẩm có chứa vi khuẩn đúng như trên nhãn, 16% chế phẩm không chứa một
trong các chủng probiotics được liệt kê trên nhãn [28]. Mặt khác số lượng vi sinh
vật trong các chế phẩm probiotics giảm nhiều trong thời gian bảo quản. Như vậy,
việc định tính, định lượng các loài vi khuẩn probiotics trong các chế phẩm là rất
quan trọng, đảm bảo chất lượng của chế phẩm, mang lại hiệu quả cho người dùng.
Thị trường thuốc Việt Nam hiện có hàng trăm chế phẩm probiotics dưới dạng
thuốc và thực phẩm chức năng, trong đó có rất nhiều chế phẩm có chứa
Bifidobacterium longum (B. longum là một vi khuẩn thuộc nhóm LAB) dưới dạng
đơn hoặc đa thành phần. Mặc dù trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu
để định tính và định lượng B. longum trong các chế phẩm đa thành phần, tuy nhiên
ở Việt Nam việc kiểm soát chất lượng của các chế phẩm probiotics còn đang bỏ
2
ngỏ. Cụ thể là Việt Nam chưa có một tài liệu chính thức nào hướng dẫn kiểm soát
chất lượng các chế phẩm probiotics bao gồm cả các chế phẩm chứa B. longum. Đa
số các tiêu chuẩn cơ sở của các thuốc và thực phẩm chức năng trong nước cũng như
nhập khẩu chưa định lượng riêng cũng như chưa định tính được B. longum trong
các chế phẩm có chứa hỗn hợp nhiều vi sinh vật.
Xuất phát từ nhu cầu thực tế và tính cấp thiết về yêu cầu kiểm tra chất lượng
của các chế phẩm probiotics, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng quy trình xác
định (định tính, định lượng) Bifidobacterium longum trong các chế phẩm
probiotics” với các mục tiêu:
- Xây dựng quy trình chuẩn định tính, định lượng B. longum trong các chế
phẩm đa thành phần.
- Ứng dụng quy trình đã thiết lập để khảo sát chất lượng của một số chế
phẩm probiotics có chứa B. longum đang lưu hành trên thị trường.
tiết ra các chất giống kháng sinh như acidolin, lactocidin và acidophilin.
- Sinh ra các vitamin bao gồm niacin, acid folic, biotin, vitamin B6
- Hỗ trợ cho quá trình tiêu hóa, điều chỉnh nồng độ enzym.
- Giảm pH bằng cách sinh ra acid lactic, hydrogen peroxyd do đó ức chế sự
phát triển của các vi sinh vật và nấm có hại.
- Giải độc và bảo vệ niêm mạc ruột: Lactobacillus có khả năng liên kết với
các chất độc như kim loại nặng, tế bào ung thư, các vi sinh vật này sẽ chết
cùng với chất độc và được loại trừ ra khỏi cơ thể cùng với chất độc dưới
dạng chất thải rắn.
- Giảm nồng độ cholesterol.
- Hỗ trợ hấp thu các khoáng chất, đặc biệt là calci do tác dụng làm giảm pH
ruột của chúng.
- Giảm nguy cơ bị ung thư, khối u [3], [6].
4
Với những tác dụng trên, Probiotics được sử dụng với mục đích chính là làm
cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột trong hoặc sau khi điều trị bằng kháng sinh do
kháng sinh đã làm thay đổi hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa, giảm số lượng vi
sinh vật có lợi và thường gây ỉa chảy, rối loạn tiêu hóa [34]. Ngoài ra, Probiotics
còn được sử dụng để điều trị viêm đường tiêu hóa thường gặp ở trẻ sơ sinh do bị
nhiễm Rota virus, điều trị tiêu chảy, ung thư ruột kết, đau dạ dày do nhiễm
Helicobacteria pylori, bệnh về dị ứng, ngăn cản nhiễm trùng âm đạo do Candida
albicans [3], [6].
1.1.3. Các vi sinh vật thƣờng đƣợc sử dụng trong chế phẩm probiotics
Nếu trước kia sự lựa chọn vi sinh vật cho chế phẩm Probiotics dùng làm thuốc
chủ yếu dựa trên kinh nghiệm thì hiện nay, các nhà khoa học đã đưa ra những tiêu
chí rất rõ ràng, đó là:
- Có khả năng chịu được pH thấp ở dạ dày và acid mật ở ruột non
- Có khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hóa
- Không gây bệnh, không sinh độc tố
- Thử tác dụng trên người
- Các yêu cầu về nhãn sản phẩm
- Các thử nghiệm xác định liều
- Yêu cầu ghi nhãn
- Yêu cầu trong sản xuất và thủ tục đăng ký
Hiện nay Việt Nam chưa có văn bản chính thức nào về việc đánh giá chất
lượng của các chế phẩm probiotics. Chỉ có duy nhất TCVN 7849:2008 đưa ra
phương pháp đếm L. acidophilus trong sữa và các chế phẩm sữa trên môi trường
đặc hiệu [5]. Việc kiểm soát chất lượng mới chỉ dừng lại ở xác định số lượng vi sinh
vật, định tính dựa trên kiểu hình, độ nhiễm khuẩn và các chỉ tiêu về dạng bào chế
theo tiêu chuẩn nhà sản xuất. Trong rất nhiều trường hợp, tiêu chuẩn chất lượng còn
rất sơ sài, đặc biệt chưa định danh được tất cả các vi sinh vật trong chế phẩm.
6
1.2. TỔNG QUAN VỀ CHI BIFIDOBACTERIUM
1.2.1. Đặc điểm chung của chi Bifidobacterium [30], [33],
Các vi khuẩn thuộc chi Bifidobacterium trước đây thường được gọi là
Lactobacillus bifidus và được phân loại thành 29 loài khác nhau. Ngày nay, người
ta đã phát hiện ra hơn 33 loài thuộc chi Bifidobacterium, trong số đó có khoảng 12
loài có mặt ở đường tiêu hóa của người.
Bifidobacteria là các trực khuẩn gram dương, kị khí bắt buộc. Chúng thuộc
loại vi khuẩn lên men không đồng nhất, không di động và không hình thành bào tử.
Bifidobacteria cho phản ứng catalase âm tính, phản ứng indol âm tính và phản ứng
fructose–6-phosphate phosphoketolase dương tính. Chúng phát triển ở khoảng nhiệt
độ thích hợp từ 37-41
o
C, không phát triển ở nhiệt độ dưới 20
o
C và trên 46
o
chế nấm phát triển hiệu quả hơn acid lactic và nó cũng được xem là nguồn năng
lượng cho cơ thể. Do tạo ra đồng thời acid acetic và acid lactic cũng như một số
chất có ích khác nên các vi khuẩn Bifidobacterium rất cần thiết cho đường âm đạo
và đường niệu sinh dục, nơi mà nấm và các vi khuẩn cơ hội có thể gây bệnh, cũng
như trong hệ tiêu hóa [36].
Một số lợi khuẩn Bifidobacterium có tác dụng tốt đối với cơ thể người do
chúng có thể làm thay đổi hệ miễn dịch. Trong một số trường hợp chúng giúp tăng
cường hệ miễn dịch cũng như có tác động chống viêm.
Một số Bifidobacteria hay được dùng trong các chế phẩm thuốc, thực phẩm
chức năng với vai trò là probiotics là Bifidobacterium longum, Bifidobacterium
infantis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium breve…
1.3. TỔNG QUAN VỀ B. LONGUM
1.3.1. Đặc điểm hình thái
B. longum thuộc nhóm vi sinh vật sinh acid lactic và thuộc chi
Bifidobacterium.
B. longum là vi khuẩn Gram dương, hình que phân nhánh, kỵ khí bắt buộc,
không di động, không sinh bào tử và cho phản ứng catalase âm tính. B. longum tăng
trưởng tối ưu ở 38 - 39°C, tối thiểu ở 19-20°C, tối đa ở 44,5-45°C. B. longum tăng
trưởng tối ưu ở pH 7-8, không tăng trưởng ở pH 5,0 hoặc 9,5 [12].
8 Hình 1.1. Hình ảnh B. longum trên kính hiển vi điện tử
1.3.2. Khả năng chuyển hóa carbohydrat [31].
B. longum có khả năng lên men các đường: arabinose, xylose, glucose,
fructose, mannose, galactose, maltose, sucrose, lactose, melibiose, raffinose. Sản
phẩm cuối cùng của quá trình lên men đường là acid lactic (AL) và acid acetic
(AA), với tỷ lệ từ 1,0 (AL): 1,7 (AA) đến 1,0 (AL): 2.0 (AA).
B. longum không lên men các đường: rhamnose, melezitose, cellobiose,
người sử dụng B. longum đạt được kết quả giảm cân và cải thiện táo bón tốt hơn so
với những người dùng thuốc nhuận tràng [11].
Một nghiên cứu khác hiện được thực hiện tại Nhật Bản nhằm xác định liệu B.
longum có thể được sử dụng như là vector chuyển gen để điều trị ung thư hay
không. Tiến hành thực nghiệm trên chuột cho thấy B. longum có thể xâm nhập vào
khối u và tích lũy trong khối u. Đây là một nghiên cứu rất tích cực và hy vọng nó sẽ
giúp cho các nhà nghiên cứu tìm ra cách mới để đưa thuốc trực tiếp vào khối u [15].
Do có vai trò rất quan trọng đối với sức khỏe con người nên B. longum được
sử dụng rộng rãi trong các chế phẩm thuốc, thực phẩm chức năng, sữa
10
1.3.5. Phƣơng pháp kiểm nghiệm B. longum trong chế phẩm probiotics
1.3.5.1. Phương pháp định lượng vi sinh vật trong chế phẩm [14], [19], [21].
a. Phương pháp đếm trên đĩa thạch
Phương pháp đếm trên đĩa thạch được sử dụng nhiều nhất để định lượng B.
longum trong chế phẩm Probiotics do có độ chính xác cao, đơn giản, dễ thực hiện ở
quy mô phòng thí nghiệm, đồng thời có thể định lượng riêng được B. longum trong
hỗn hợp. Vi sinh vật trong chế phẩm ban đầu được pha loãng đến nồng độ thích
hợp, sau đó được cấy trộn vào môi trường dinh dưỡng trong đĩa petri và nuôi cấy ở
nhiệt độ, thời gian thích hợp. Sau thời gian nuôi cấy, đếm số khuẩn lạc và tính số
lượng vi sinh vật có trong chế phẩm ban đầu
Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là tốn thời gian nuôi cấy, khó
khăn trong việc lựa chọn môi trường đặc hiệu cho vi sinh vật cần định lượng trong
hỗn hợp gồm nhiều vi sinh vật khác nhau.
b. Định lượng bằng phương pháp real-time PCR
Real-time PCR là một trong những kỹ thuật cho phép định lượng chính xác
nhất số lượng trình tự DNA trong một mẫu thí nghiệm. Khác với việc định lượng
khi quá trình khuếch đại đã hoàn tất, kỹ thuật này cho phép kiểm soát và định lượng
số lượng DNA ngay cả khi phản ứng đang xảy ra. Trong kỹ thuật này, ở mỗi chu
kỳ, lượng DNA được khuếch đại sẽ phát ra một lượng tín hiệu huỳnh quang nhất
trước nồng độ.
c. Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH-fluorescent insitu
hybridization).
FISH dò tìm và phát hiện ra các trình tự acid nucleic của vi sinh vật cần định
lượng bằng cách dùng đầu dò được đánh dấu huỳnh quang lai đặc hiệu với các trình
tự đặc hiệu bổ sung với nó bên trong tế bào nguyên vẹn (không cần phá vỡ tế bào)
Quy trình thực hiện bao gồm các bước:
- Chuẩn bị mẫu và đầu đò
- Cố định mẫu
- Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu nằm trong tế bào
- Rửa mẫu để loại bỏ các đầu dò không được lai
- Dò tìm mẫu (bước này có thể bỏ qua nếu sử dụng đầu dò phát huỳnh quang
trực tiếp)
12
- Quan sát, hiển thị và lưu trữ kết quả bằng kính hiển vi quét laze đồng tiêu
hoặc kính hiển vi gắn thêm bộ lọc dải hẹp nhiều tần cùng với một máy ảnh
và phần mềm xử lí hình ảnh.
Các đầu dò thường được sử dụng là các oligonucleotide rRNA 16S để đảm
bảo sự liên kết bổ sung đạt hiệu quả cao nhất trong quá trình lai.
Đầu dò thường được đánh dấu bằng cách gắn trực tiếp chất nhuộm huỳnh quang lên
đầu dò hoặc kết hợp đầu dò với một số chất chỉ thị như Digoxygenin, sau đó chúng
sẽ được dò tìm thông qua một chất phản huỳnh quang
Ưu điểm của 2 phương pháp Realtime PCR và FISH là nhanh, cho độ chính
xác cao. Tuy nhiên nhược điểm là đòi hỏi đầu tư thiết bị đắt tiền, yêu cầu trình độ
kỹ thuật cao và không phân biệt được vi khuẩn sống hay vi khuẩn chết.
1.3.5.2. Định danh
a. Định danh kiểu hình
Dựa theo khóa phân loại được công nhận quốc tế: Dựa vào đặc điểm hình thái,
phản ứng sinh hóa. Để tiến hành kiểm tra các đặc điểm sinh hóa thì phương pháp sử
- Kỹ thuật nhân gen PCR (Polymerase Chain Reaction) [8].
PCR là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại
và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử.
PCR dựa trên cơ sở phản ứng kéo dài primer nhờ enzym Taq DNA
polymerase để khuếch đại in vitro các acid nucleic đặc hiệu trong thiết bị điều nhiệt
tuần hoàn (thermocycler) hay còn gọi là máy PCR. PCR cho phép khuếch đại theo
hàm mũ lên đến hàng triệu lần các đoạn DNA có chiều dài từ 200- 3000 bp. Đoạn
DNA được khuếch đại (DNA đích) được nhận dạng nhờ cặp primer đặc hiệu
(oligonucleotid) thường có chiều dài khoảng 20 nucleotide.
Taq DNA polymerase là một loại enzym DNA polymerase chịu nhiệt (có ở vi
khuẩn chịu nhiệt cao Thermus aquaticus), được dùng để tổng hợp các đoạn DNA
mới trong môi trường có bốn loại deoxyribonucleotid (dATP, dCTP, dGTP và
dTTP) và hai primer, trên cơ sở khuôn mẫu của một đoạn DNA nhất định đã biết
hoặc chưa biết trình tự. Các đoạn DNA mới hình thành lại được sử dụng làm khuôn
mẫu. Sau nhiều chu kì, số lượng đoạn DNA nói trên được nhân lên gấp nhiều lần,
nhờ vậy có thể đủ số lượng để tách ra, phân tích trình tự hoặc tạo dòng
14
Nguyên tắc của phản ứng khuếch đại gen được trình bày tổng quát trong Hình
1.3 và Hình 1.4
Hình 1.3. Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase
Hình 1.4.
15
Nguyên tắc của PCR được trình bày trong Hình 1.3 và Hình 1.4. Theo đó, từ
chu kỳ thứ hai, Taq polymerase (Taq pol) bắt đầu tạo ra các đoạn DNA có chiều dài
xác định. Các primer thường là một oligonucleotid tổng hợp, có khoảng 10 - 20
nucleotid hoặc hơn. Nếu biết trình tự của đoạn gen cần khuếch đại thì có thể tổng
cm thì dừng lại. Nhuộm bản gel trong dung dịch ethidium bromide (EtBr) ở nồng độ
50 g/ l trong 15-30 phút. Sau đó, gel được lấy ra và soi dưới ánh sáng tử ngoại
của máy soi chụp gel, các băng gắn với EtBr xuất hiện dưới dạng các băng màu
sáng trên nền gel màu đen.
Copyright: Tài liệu đại học ©