_________ —

"ồ"

BÀI NGHIÊN CỨU * ^
TÀI LIỆU THAM KHÀO
1. M, N., (1987), Orgơnic-chemicol drugs and their synonyms. Berlin: Akademie-Verlag.
2. Todeschini, R. and V. Consonni (2000), Hondbook of Molecular Descriptors. 1St ed. Methods and Principles in Medicinal Chemistry, ed.
R. Mannhold, H. Kubinyi (2002), and H. Timmerman. Vol. 11., D-69469 Weinheim, Federal Republic of Germany: WILEY-VCH Verlag
GmbH. 667.
3. Marrero-Ponce, Y. and V. Romero (2002), TOMOCOMD software (TOpologicơl Molecular COMputer Design) for Windows: Central
University of Las Villas. Villa Clara. Cuba. p. ( />4. Marrero-Ponce,Y.(2004),Total and local (atom and atom type) molecular quadratic indices: significance interpretation, comparison to
other molecular descriptors, and QSPR/QSAR applications. Bioorg Med Chem. 12 (24): p. 6351-69.
5. Marrero-Ponce, Y., et al. (2005), Non-stochastic and Stochastic Linear Indices of the"Molecular Pseudograph's Atom Adjacency Matrix":
Application to'in silico'Studies for the Rational Discovery of New Antimalarial Compounds. Bioorg Med Chem. 13 (4): p. 1293-304.
6. Marrero-Ponce, Y. and F.Torrens (2008), Novel 2D TOMOCOMD-CARDD Descriptors: Atom-based Stochastic and non-Stochastic Bilinear
Indices and their QSPR Applications. J/Wứf/7 Chem. 44 (3): p. 650-673.
7. STATISTICA (data analysis software system) V 9.2009, Tulsa,OK:: StatSoft Inc.
8. OECD Principles for the Validation, for Regulatory Purposes, of (Quantitative) Structure-Activity Relationship Models, in 37^^ Joint
Meeting of the Chemicals Committee and Working Party on Chemicals, Pesticides ond Biotechnology. 17-19 November 2004. Paris.
9. OECD, in Guidance Document on the Validation of (Quantitative) structure-Activity Relationship [(Q)SAR] Models, Series on Testing
and Assessment No. 692007: Poris. p. 154pp.
10. Alvarez-Ginarte, Y.M., et al. (2008), Chemometric and Chemoinformatic Analyses of Anabolic and Androgenic Activities ofTestosterone
and Dihydrotestosterone Analogues. Bioorg Med Chem. 16 (12): p. 6448-6459.
11. Paul, S.M., et al. (2010), How to improve R&D productivity: the pharmaceutical industry's grand challenge. Nature Reviews Drug
Discovery, March. 9: p. 203-214.

Xây dựng quy trình xác định bufalin
trong sản phẩm có chứa bột cóc
bằng LC-MS/MS
Lê Đình Chi', Lê Thị Hổng Hảo^


A
nhiều loại chế phẩm chế biến từ Cóc lưu hành trên thị
trường như bột đạm cóc (Viện Dinh dưỡng), bột cóc
Royal Baby (Công ty cổ phẩn Dược Hải Phòng)... Song
trên thực tế tại Việt Nam, hiện chưa có quy định và
phương pháp phân tích chính thức để kiểm soát giới
hạn bufadienolid, trong đó có bufalin, trong các chế
phẩm có chứa bột cóc. Trên thế giới, các bufadienolid
(trong đó có bufalin) đã được phân tích bằng nhiều
kỹ thuật như miễn dịch huỳnh quang [8], sắc ký lớp
mỏng [7], sắc ký lỏng với detector PDA [9], song
phổ biến nhất là sắc ký lỏng kết nối khối phổ [5], [6],
Trước nhu cầu thực tế kể trên, để góp phẩn kiểm soát
an toàn của nhóm chế phẩm có thành phẩn từ Cóc,
nghiên cứu này nhằm mục tiêu xây dựng quy trình
để phân tích bufalin trong các chế phẩm này bằng kỹ
thuật sắc ký lỏng kết nối khối phổ hai lần (LC-MS/MS)
nhằm hướng tới chuẩn hóa giới hạn bufalin nói riêng
và các độc tố cóc nói chung trong các chế phẩm có
chứa bột cóc.

Hình 1. Công thức cổu too của buUn
Nguyên vật liệu và phưcAig pháp nghiên cứu
Nguyên tìẹu
- Chất đối chiếu bufalin mã số B0261 (hàm lượng
98,0% nguyên trạng, số lô: 0001445062) của hãng
Sigma - Adrich, Mỹ.
- Mẳu chế phẩm có thành phẩn bột cóc không
nhiễm bufalin để làm nển mẫu trắng (mã hóa; mẫu

gổm các giai đoạn: Xử lý mẫu để chiết bufalin và phân
tích bufalin trên hệ thống LC/MS-MS.
- Xử lý kết quả bằng phương pháp thống kê có sử
dụng phần mềm Microsoft Excel.

,3

Kết quả nghiên cúu
Xâỵ dựng quỵ trình chiết bufalin từ mẫu chế
phẩm
Để thu được quy trình xử lý mẫu cho phép chiết
được hết bufalin từ mẫu chế phẩm có bột cóc, dung
môi chiết và các điểu kiện khác của quá trình chiết
bao gồm thể tích dung môi sử dụng, thời gian chiết,
điểu kiện lỵ tâm sau chiết đã được khảo sát. vể dung
môi chiết, quá trình khảo sát sơ bộ được thực hiện
với methanol, ethanol, acetonitril, ethyl acetat và
cloroform. Kết quả thực nghiệm cho thấy methanol
cho phép chiết bufalin với hiệu suất tốt nhất (trên
80%, xem thêm phẩn thẩm định quy trình), do đó,
methanol được dùng làm dung môi chiết bufalin từ
nển mâu. Sau đó, các thông số: thể tích methanol
đem chiết, loại cột SPE sử dụng đều được khảo sát để
chọn ra điểu kiện thích hợp. Từ kết quả thực nghiệm,
quy trình chiết bufalin từ nển chế phẩm có bột cóc
được thiết lập gổm các bước như sau:
- Cân chính xác khoảng 1,00 gam mẫu vào ống ly
tâm 50 ml, thêm vào ống 10 ml methanol.
- Lắc xoáy ống ly tâm 1 phút, sau đó lắc siêu âm 15
phút ở nhiệt độ phòng.

acid formic 0,1 %

80
20
20
80
80

Acetonitril

20
80
80
20
20

- Cho dịch lọc qua cột chiết pha rắn Supra-poly® bufalin cho mảnh mẹ có m/z = 387 và hai mảnh con
HLB đã hoạt hóa trước bằng 1 ml methanol và 1 ml có m/z lẩn lượt là 351 và 255 (hình 2). Sử dụng cả ba
nước.
mảnh này để định danh bufalin cho phép đạt số điểm
-Thu dịch lọQ cô cách thủy lấy cắn, hòa tan trong định danh (Identification point - IP) là 4, phù hợp với
1,00ml methanol và tiêm vào hệ thống sắc kí.
quy định của EC về định danh bằng khối phổ hai lẩn
Xây dựng quy trình phân tích bufalin bằng LC/ [3]. Mảnh ion con m/z = 351 có cường độ mạnh nhất
MS-MS
được sử dụng để định lượng bufalin.
Để phân tích bufalin trong mẫu chế phẩm, các
Thẩm định quy trình phân tích bufalin trong
điểu kiện của hệ thống sắc ký, điểu kiện phân tích MS- chế phẩm
MS và các thông tin sửdụng để định danh, định lượng

^muÊrnU

arfitSfma

Ĩ

i..

Hình 3. Khởo sát độ đặc hiệu củũ quy trình (A: nên mẫu trâng (chếphẩm không chỨQ buíũlin), B: nên mẫu trâng thêm buíơlin chuẩn, C: mău chếphẩm có chứa buíolin)

Độ thích hợp hệ thống
Độ thích hợp hệ thống được đánh giá qua độ lặp lại vé thời gian lưu và diện tích pic buíalin khi tiêm 6 lẩn
dung dịch chuẩn buíalin 20 ng/ml. Kết quả thực nghiệm cho thấy hệ thống sắc ký có điểu kiện đã chọn thích
hợp cho việc phân tích định lượng buíalin, qua độ dao động thấp vể thời gian lưu (RSD = 0,1 %) và diện tích pic
(RSD = 0,6%) với buíalin.
Độ tuyến tỉnh
Độ tuyến tính được đánh giá trong khoảng nồng độ buíalin từ 10 ng/ml đến 1000 ng/ml. Đáp ứng diện tích
pic của buíalin ở các nồng độ khác nhau được trình bày tại bảng 2.
Bâng 2. Quan hệ tuyển tính giữơ diện tích pic và nông độ buíũlin

Nổng độ bufolin (ng/ml)

10,0

20,0

50,0

100,0


Như vậy, trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng
độ bufalin.
Độ lặp lợi, độ đúng
Độ lặp lại của quy trình được đánh giá thông qua kết quả phân tích độc lập 6 lần trên mẫu M2 xác định sơ
bộ có phát hiện thấy bufalin. Độ đúng được đánh giá qua việc xác định độ thu hổi khi thêm chuẩn bufalin vào
nền mẫu M2 ở ba mức khối lượng khác nhau. Kết quả đánh giá độ lặp lại và độ đúng (bảng 3) cho thấy khi phân
tích bufalin quy trình cho độ lặp Ịại tốt (RSD = 4,6% trên mẫu có hàm lượng bufalin thấp, khoảng 14 ng/g) và độ
đúng phù hợp (tỷ lệ thu hổi từ 81,0 - 88,2% cho cả ba mức thêm chuẩn).

Số 1/2015

Nghiên Cứu duợcĩhỏngtln thuốc 13


BÀI NGHIÊN CỨU '
Bảng 3. Kồ quả đánh gió độ lặp lại
Chỉ tiêu
Độ lặp lại (n = 6)
Độ đúng (3 mức, mỗi mức
phân tích 3 lẩn)

LOD

LOQ

Kết quả thẩmđịnh
- Hàmlượng buíalỉn (Trung bình ± SD): 14,3 ng/g ± 0,7 ng/g
-RSD:4,6%
- Tỷlệthuhổi chung trêncả3mứcsau9lánphântích: 81,0- 88,2%
- Kết quảtìmlại cụthểởmỗi mức:


Kết quả phân tích bufalin (hàm ỉượng ± SD)
tính theo ng/g(ppb)

M2(n = 6)

14,3 ±0,7

M3 (n = 3)

19,0 ±0,1

14 I Nghiên CỨU duộclhôngtlnthuõc I SỐ1/2015


s

Bàn luận
Những kết quả thực nghiệm khi thẩm định
phương pháp đã được so sánh với quy định vể náng
lực phương pháp phân tích của EC [3]. vể độ đặc hiệu,
quy trình đã đáp ứng được yêu cầu tối thiểu về điểm
định danh (với IP = 4). vể độ lặp lại, trên nền mẫu
M2 có nồng độ bufalin khoảng 14 ng/g (14 |Lig/kg),
quy trình cho RSD = 4,6%, đạt quy định của EC (CV
= 20% với hàm lượng từ > 10 |ig/kg đến 100 |ig/kg)
[3]. Tương tự, độ đúng của quy trình (với độ thu hồi
từ 81,0 đến 88,2% ở nồng độ chuẩn bufalin thêm vào
nền mẫu từ 10 - 100 ng/ml) cũng đạt quy định của EC
(cho phép dao động độ đúng 80 - 110% với khoảng

mức dưới 20 ppb.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, 965-968.
2. Trần Minh Hoàng (2010), Làm gì để ngăn chặn những cái chết thương tâm do Cóc, Thông tin - truyền thông ATTP, Mạng Thông tin Y
tế Sởy tế Bình Dương ( />3.

Commission of the European Communities (2002), Commission decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/
EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results (2002/657/EC), OfficialJournol of European
Communities, L22V8 - L221/35.

4.

R.Verpoorte, Phan Quốc Kinh, A.B.Svendsen (1979), Chemical constituents of Vietnamese toad venom collected from Bufo
meìanostịctu, Journal of Ethnophơrmơcoly, 1 (2), 197-202.

5.

Y.Cao, LZhao, Q.Liang, et al. (2007), study of the determination and pharmacokinetics of bufadienolides in dog's plasma after
administration of Liu-Shen-Wan by high performance liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry, Journal of
Chromatography B, 853 (1-2), 227-233.

6.

Y.Hu, Z.Yu, ZJ.Yang, G.Zhu, W.Fong (2011), Comprehensive chemical analysis of Venenum Bufonis by using liquid chromatography/
electrospray ionization tandem mass spectrometry, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 56 (2), 210-220.

7.

H-J.Lee, F-RKoung, K-R.Kwon, et al. (2012), Comparative Analysis of the Bufonis Venenum by Using TLC, HPLC, and LC-MSfor Different