BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ VIỆT NGÂN XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HỢP CHẤT NHÓM
ANTHOCYANIN TRONG RAU CỦ BẰNG
PHƯƠNG PHÁP HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. TS. Lê Đình Chi
2. TS. Lê Thị Hồng Hảo
Nơi thực hiện :
1. Bộ môn hóa phân tích – độc chất
2. Viện kiểm nghiệm ATVSTP Quốc gia
HÀ NỘI – 2015

LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp, với sự giúp đỡ tận tình của thầy cô giáo,
tôi đã hoàn thành khóa luận của mình.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn tới TS. Lê Đình Chi
đã tận tình hướng dẫn, đóng góp ý kiến cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài
và viết khóa luận.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực
phẩm Quốc gia, TS. Lê Thị Hồng Hảo đã tạo điều kiện, giúp em hoàn thành đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn TS. Lê Thị Hồng Hảo, ThS. Vũ Thị Trang đã tận tình
hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Em gửi lời cảm ơn
tới các anh chị, những người làm việc ở Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực
phẩm Quốc gia đã quan tâm, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện cho em hoàn thành khóa

1.5. Sự phân bố của Anthocyanin 8

1.6. Một số phương pháp phân tích Anthocyanin 9

1.7. Tổng quan về HPLC 10

1.7.1. Khái niệm chung 10

1.7.2. Một số khái niệm cơ bản trong sắc ký 10

1.7.3. Thiết bị sắc ký lỏng 12

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1. Đối tượng nghiên cứu 17

2.2. Nguyên vật liệu - thiết bị 17

2.2.1. Nguyên vật liệu 17

2.2.2. Thiết bị 18

2.2.3. Nội dung nghiên cứu 19

2.3.

Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1. Khảo sát các điều kiện phân tích Anthocyanin bằng HPLC 19


3.3.3. Độ lặp lại 37

3.3.4. Độ thu hồi 40

3.3.5. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 43

3.4.

Kết quả áp dụng phương pháp xác định Anthocyanin trong một số thực
phẩm rau củ 44

3.5. Bàn luận 44

3.5.1. Lựa chọn phương pháp 44

3.5.2. Điều kiện xử lý mẫu 45

3.5.3. Xây dựng phương pháp định lượng 45

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

4.1.

Kết luận 47

4.2.Kiến nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


TEM Ion source Temperature Nhiệt độ nguồn
PDA

Photodiode Array

Mảng diod quang

DEL Delphinidin
CYA Cyanidin
PEL Pelargonidin
DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng Trang
Bảng 1.1: Cấu trúc của 6 chất phổ biến nhất trong nhóm anthocyanin 4
Bảng 1.2: Hàm lượng anthocyanin toàn phần có trong một số mẫu thực
vật tại Việt Nam
8
Bảng 1.3: Một số phương pháp phân tích anthocyanin 9
Bảng 2.1: Danh mục các pha động HPLC khảo sát 20
Bảng 3.1: Chương trình gradient 1 24
Bảng 3.2: Chương trình gradient 2 25
Bảng 3.3: Chương trình gradient 3 26
Bảng 3.4: Chương trình gradient 4 27
Bảng 3.5: Hàm lượng các chất theo thời gian thủy phân 29
Bảng 3.6: Hàm lượng các chất tại các nhiệt độ thủy phân khác nhau 30
Bảng 3.7: Hàm lượng các chất tại các tỷ lê dung môi chiết khác nhau 32
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của chất chuẩn
delphinidin
35
Bảng 3.9: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của chất chuẩn cyanidin 36
Bảng 3.10: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của chất chuẩn

Hình 3.5: Sắc ký đồ dung dịch dung dịch 3 chất chuẩn với chương trình
gradient 2 (trên) và mẫu thực rau (dưới)
26
Hình 3.6: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 3 chất với chương trình gradient 3 26
Hình 3.7: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 3 chất với chương trình gradient 4 27
Hình 3.8: Hàm lượng các chất khi thủy phân trong thời gian khác nhau
(60, 90, 120, 150 phút)
29
Hình 3.9: Hàm lượng các chất tại nhiệt độ thủy phân khác nhau 30
Hình 3.10: Hàm lượng các chất theo phần trăm HCl 2N trong dung môi
chiết mẫu
31
Hình 3.11: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp 33
Hình 3.12: Sắc ký đồ của mẫu rau không chứa anthocyanin 34
Hình 3.13: Sắc ký đồ của mẫu rau không chứa anthocyanin được thêm
chuẩn hỗn hợp
34
Hình 3.14: Đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ
delphinidin
35
Hình 3.15: Đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ
cyanidin
36
Hình 3.16: Đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ
pelargonidin
37 1



3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ANTHOCYANIN
1.1. Giới thiệu
Các Anthocyanin thuộc một trong những nhóm các chất màu tự nhiên
flavonoid tan trong nước lớn nhất trong thế giới thực vật [24]. Thuật ngữ
anthocyanin bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp, trong đó anthocyanin là sự kết hợp giữa
Anthos – nghĩa là hoa và Kyanos – nghĩa là xanh thẫm [24]. Tuy nhiên, không
chỉ có màu xanh, anthocyanin còn mang đến cho thực vật nhiều màu sắc rưc rỡ
khác như hồng, đỏ, cam và các gam màu trung gian [25].
1.2. Cấu trúc hóa học của Anthocyanin
Anthocyanin là những glycosid do gốc đường glucose, glactose kết hợp với
gốc aglycon có màu (anthocyanidin). Các anthocyanin khi mất hết nhóm đường
được gọi là anthocyanidin hay aglycon. Mỗi anthocyanidin có thể bị glycosyl
hóa acylat bởi các loại đường và các acid khác tại các vị trí khác nhau. Aglycon
của chúng có cấu trúc cơ bản được mô tả trong hình 1.1. Các gốc đường có thể
được gắn vào vị trí 3,5,7; thường được gắn vào vị trí 3 và 5 còn vị trí 7 rất ít [3].
Phân tử anthocyanin gắn đường vào vị trí 3 gọi là monoglycosid, ở vị trí 3 và 5
gọi là diglycosid. Sự khác biệt giữa chúng là số lượng các nhóm hydroxy hóa,
bản chất và số lượng các gốc đường liên kết với cấu trúc của chúng. Đến nay có
những báo cáo của hơn 500 anthocyanin khác nhau và 23 anthocyanidin, tuy
nhiên trong đó chỉ có sáu chất phổ biến nhất Pelargonidin, Peonidin, Cyanidin,
Malvidin, Petunidin và Delphinidin [25]. Trong bài báo cáo này chúng tôi tiến
hành xác định Pelargonidin, Cyanidin, Delphinidin trong thực phẩm rau củ.
4


′ R
4
′ R
5
′ R
3
R
5
R
6

R
7Cyanidin −OH −OH

−H −OH

−OH

−H

−OH

Delphinidin −OH −OH

−OH −OH

−OH


Peonidin −OCH
3

−OH

−H −OH

−OH

−H

−OH

Petunidin −OH −OH

−OCH
3

−OH

−OH

−H

−OH

Các aglycon của anthocyanin khác nhau chính là do các nhóm gắn vào vị trí R
1


Màu sắc anthocyanin thay đổi phụ thuộc vào nhiệt độ, các chất màu và nhiều
yếu tố khác,… Khi tăng số lượng nhóm OH trong vòng benzen thì màu càng
xanh đậm [3].
Mức độ methyl hóa các nhóm OH ở vòng benzen càng cao thì màu càng đỏ.
Nếu nhóm OH ở vị trí thứ ba kết hợp với các gốc đường thì màu sắc cũng sẽ thay
đổi theo số lượng các gốc đường được đính vào nhiều hay ít [25].
Các Anthocyanin cũng phụ thuộc rất mạnh vào pH của môi trường [3]:
- Khi pH > 7 các Anthocyanin có màu xanh và khi pH < 7 các Anthocyanin có
màu đỏ.
- Ở pH = 1 các Anthocyanin thường ở dạng muối oxonium màu cam đến đỏ.
- Ở pH = 4 - 5 chúng có thể chuyển về dạng base Cacbinol hay base Chalcon
không màu.
- Ở pH = 7 - 8 lại về dạng base Quinoidal Anhydro màu xanh.

Hình 1.2: Sự phụ thuộc cấu trúc anthocyanin vào pH.
6

Màu sắc của anthocyanin còn có thể thay đổi do hấp thụ ở trên polysaccharid.
Khi đun nóng lâu dài các anthocyanin có thể phá hủy và mất màu [3].
Anthocyanin có bước sóng hấp thụ trong miền nhìn thấy, khả năng hấp thụ
cực đại tại bước sóng 510 – 540 nm. Độ hấp thụ là yếu tố liên quan mật thiết đến
màu sắc của các anthocyanin chúng phụ thuộc vào pH của dung dịch, nồng độ
anthocyanin: thường pH thuộc vùng acid mạnh có độ hấp thụ lớn, nồng độ
anthocyanin càng lớn độ hấp thụ càng mạnh [3].
Như vậy, trong môi trường acid, các anthocyanin là những base mạnh và có
thể tạo muối bền vững với acid. Anthocyanin cũng có khả năng cho muối với
base. Như vậy chúng có tính chất lưỡng tính. Muối với acid thì có màu đỏ, còn
muối với kiềm thì có màu xanh [3].
1.4. Tác dụng của anthocyanin
Trong thực vật, anthocyanin có tính kháng khuẩn, kháng nấm, có vai trò tạo

tổng hợp BHA [31]. Ngoài các tác dụng chống oxy hóa, anthocyanin còn được
sử dụng như chất màu tự nhiên tạo ra nhiều màu sắc hấp dẫn cho thực phẩm và
khá an toàn. Ví dụ: dịch chiết anthocyanin từ các loại rau củ có màu đỏ như vỏ
quả nho, dâu tây, vỏ khoai lang… đã được dùng để làm chất màu thay thế màu
tổng hợp trong sản xuất kẹo cứng [31].
Anthocyanin bên cạnh vai trò là màu thiên nhiên được sử dụng trong thực
phẩm, còn là hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học quý như: khả năng chống oxy
hóa cao, chống lão hóa, tăng cường sức đề kháng, làm bền thành mạch, chống
8

viêm, hạn chế sự phát triển của các tế bào ung thư, tác dụng chống các tia phóng
xạ [14], [16].
1.5. Sự phân bố của Anthocyanin
Anthocyanin tập trung ở những cây hạt kín và những loài ra hoa, phần lớn nằm ở
hoa và quả, ngoài ra cũng có ở lá và rễ. Trong những loại thực vật này,
anthocyanin được tìm thấy chủ yếu ở các lớp tế bào nằm bên ngoài như biểu bì.
Các hợp chất anthocyanin xuất hiện rộng rãi trong khoảng ít nhất 27 họ, 73 loài
và trong vô số giống thực vật sử dụng làm thực phẩm [11]. Các họ thực vật như
họ nho (Vitaceae) và họ hoa hồng (Rosaceae) là các nguồn anthocyanin chủ yếu.
Bên cạnh đó còn có một số loài thuộc các họ khác: Cà tím (Solanaceae), quả lý
(Saxifragaceae), quả việt quất (Ericaceae) và bắp cải tím (Brassicaceae)… Các
loại anthocyanin phổ biến nhất là các glycosid của cyanidin, kế đến là
pelargonidin, peonidin và delphinidin, sau đó petuidin và maldivin. Số lượng các
3 – glycosid nhiều gấp 2,5 lần các 3,5 – glycosid. Loại anthocyanin hay gặp nhất
chính là Cyanidin – 3 – glycosid [29].
Bảng 1.2: Hàm lượng anthocyanin toàn phần có trong một số mẫu thực vật tại
Việt Nam [8].
STT

Mẫu

liệu
tham
khảo
1 HPLC
Mẫu bắp
cải tím
-
Cột: C
18
Waters (250 x 4.6
mm, 5 µm)
- Pha động: A (H
3
PO
4
1,5 %)
B (H
3
PO
4
1,5 %,
CH
3
COOH 20 % trong hỗn
hợp CH
3
CN – H
2
O (25:75)
- Tốc độ dòng: 1.0 mL/min

CN – HCOOH (9:1))
- Detector PDA tại 530 nm
- Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút
- Nhiệt độ cột: 25
o
C
-
Thể tích tiêm mẫu: 25 µL
Nghiền, hòa tan
trong HCl 10 %,
lọc sau đó chạy
sắc ký
[22]
3
HPLC-
PDA-
MS/MS
Trái cây
nhiệt
đới: quả
sơ ri và
acai
-
Cột: Shim – pack CLCODS
C
18
(250 × 4,6 mm, 5 µm)
- Pha động: HCOOH -
CH
3

-
Cột: YMC – pack ODS –
AM C
18
(250 × 4,6 mm, 5
µm)
- Pha động: CH
3
CN – H
2
O –
HCOOH, gradient dung môi
- Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút
- Nhiệt độ cột: 40
0
C
- Thể tích tiêm: 25 µL
-
Detector: ESI – MS/MS.
Mẫu được chiết
bằng CH
3
OH –
HCOOH (97:3)
trước khi chạy
sắc ký
[12]
5 HPLC
Bilberry
extract

Mẫu được hòa
trong CH
3
OH –
H
2
O (85:15),
rung siêu âm, lọc
trước khi chạy
sắc ký
[33]
1.7. Tổng quan về HPLC
1.7.1. Khái niệm chung
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance Liquid Chromatography –
HPLC) là kỹ thuật tách sắc ký trong đó các chất phân tích hòa tan trong pha
động là chất lỏng và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tùy thuộc vào
ái lực của chất phân tích với pha động và pha tĩnh mà các chất di chuyển với
tốc độ khác nhau, do đó thứ tự rửa giải khác nhau. Thành phần pha động đưa
chất phân tích ra khỏi cột được thay đổi để rửa giải các chất với thời gian hợp
lý [1].
1.7.2. Một số khái niệm cơ bản trong sắc ký [1], [2]
11

Thời gian lưu:
Khoảng thời gian từ lúc bơm mẫu vào cột đến khi pic đến detector là thời gian
lưu t
R
.
Thời gian chết: Thời gian t
M

V
V
K
VC
VC
.
.
.

=
M
MR
t
tt 

V
S
, V
M
tương ứng là thể tích của pha tĩnh, pha động.
k’ phụ thuộc vào bản chất chất phân tích, bản chất 2 pha vào hệ số V
S
/V
M

Thông thường chọn k’ = 1 – 5.
Hệ số chọn lọc α:
Hệ số chọn lọc α đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B:
α =
 

, k’
B
tương ứng là hệ số dung lượng của chất A, B.
12

(t
R
)
A
, (t
R
)
B
tương ứng là thời gian lưu của chất A, B.
Hai chất A và B chỉ có thể tách được khỏi nhau nếu  > 1. Trong phân tích sắc
ký, thường lựa chọn điều kiện phân tích để có được α = 1,05 – 2. Nếu α quá lớn,
thời gian phân tích kéo dài.
Số đĩa lý thuyết:
Số đĩa lý thuyết là đại lượng đặc trưng cho hiệu lực cột sắc ký
2
2/1
2
54,516








S
=
   
 
   
 
BA
A
R
B
R
BA
A
R
B
R
WW
tt
WW
tt
,
2/1
,
2/1
.18,1
.
2
1



a. Hệ thống cung cấp pha động:
- Nguốn cấp pha động: Pha động trong sắc ký lỏng thường là 2 dung môi
hòa tan vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp, được chứa trong
bình thủy tinh hoặc thép không rỉ.
- Bộ phận loại khí (degasser): Trước khi sử dụng cần lọc (màng lọc 0,45
µm) và đuổi khí hòa tan trong pha động để tránh việc khí hòa tan có thể làm biến
dạng pic, giảm hiệu lực cột, làm nhiễu đường nền. Có thể loại khí hòa tan bằng
cách: chạy siêu âm, sục khí trơ….
- Bộ phận trộn pha động (mixer): Trộn các dung môi ở áp suất thấp hoặc
áp suất cao
 Chương trình dung môi ở áp suất thấp: Mỗi bình chứa dung môi có một
van riêng lấy lượng dung môi xác định đưa vào bình hòa trộn, sau đó chỉ
dùng một bơm đưa pha động vào van tiêm mẫu.
 Chương trình dung môi ở áp suất cao: Mỗi dung môi có một bơm riêng,
việc hòa trộn được thực hiện ở áp suất cao.
- Bơm: về mặt kết cấu có 3 loại thường gặp: Bơm đẩy một pittong, bơm
làm đầy nhanh và bơm kép đẩy kéo.
Hệ thống cấp
dung môi
Bơm Bộ phận tiêm mẫu
Cột sắc ký
Detector
Hệ thống thu
nhận và xửa lý
số liệu (máy ghi,
máy tính)
Buồng cột
14

b. Bộ phận tiêm mẫu

)
 Gốc octyl (C
8
)
 Gốc phenyl propyl
- Pha tĩnh phân cực có R’ là:
 Cyano
 Amino
 Diol
Dựa vào độ phân cực tương đối của pha tĩnh và pha động đã hình thành hai loại
sắc ký phân bố là sắc ký phân bố pha thuận và sắc ký phân bố pha đảo:
- Sắc ký phân bố pha thuận: thường dùng pha tĩnh lỏng phân cực như
C
2
H
2
(OC
2
H
4
OH)
2
, H
2
O. Còn pha động là dung môi ít phân cực hơn như
hexan.
- Sắc kí phân bố pha đảo: pha tĩnh không phân cực như hydrocacbon (C
18
hoặc
C