BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

QUẢN DUY QUANG XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG
PHÁP ĐỊNH LƯỢNG DICLOFENAC
TRONG DỊCH TIỀN PHÒNG MẮT THỎ
VÀ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ
DỤNG CỦA NHŨ TƯƠNG NANO NHỎ
MẮT DICLOFENAC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI – 2014


HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN

Trong những dòng đầu tiên này, tôi xin phép được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới:
PGS.TS. Nguyễn Văn Long
TS. Nguyễn Trần Linh
DS. Đặng Thị Hiền
là những người thầy đã nhiệt tình hướng dẫn và hết lòng giúp đỡ, tận tình chỉ bảo
tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, thực hiện khóa luận vừa qua.
Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả thầy cô, các anh, chị kĩ
thuật viên bộ môn Bào chế đã hết sức tạo điều kiện, giúp tôi hoàn thành đề tài.
Nhân đây, tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo và
cán bộ công nhân viên trường Đại học Dược Hà nội – những người đã dạy bảo, giúp
đỡ tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè – những người
đã dành cho tôi sự giúp đỡ và động viên quý báu trong suốt thời gian qua.

Hà nội, ngày 8 tháng 5 năm 2014
Sinh viên

Quản Duy Quang

1.6.3. Một số nghiên cứu về dược động học của thuốc nhỏ mắt 19 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
2.1. Nguyên liệu, thiết bị, động vật thí nghiệm 20
2.1.1. Nguyên liệu 20
2.1.2. Thiết bị 20
2.1.3. Động vật thí nghiệm 21
2.2. Nội dung nghiên cứu 21
2.3. Phương pháp nghiên cứu 21
2.3.1. Phương pháp bào chế nhũ tương nano nhỏ mắt diclofenac 21
2.3.2. Phương pháp bào chế dung dịch nhỏ mắt diclofenac so sánh 22
2.3.3. Phương pháp định lượng 23
2.3.4. Thẩm định phương pháp định lượng diclofenac trong dịch tiền phòng 24
2.3.5. Đánh giá sinh khả dụng và các thông số dược động học 26
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 31
3.1. Thẩm định phương pháp định lượng diclofenac trong dịch tiền phòng 31
3.1.1. Tính chọn lọc 31
3.1.2. Tính tuyến tính 32
3.1.3. Giới hạn định lượng dưới 35
3.1.4. Độ đúng, độ chính xác 36
3.1.5. Độ ổn định 38
3.2. Đánh giá sinh khả dụng và các thông số dược động học 40
3.2.1. Xác định khối lượng riêng của các dạng bào chế 40
3.2.2. So sánh nồng độ diclofenac trong dịch tiền phòng của nhũ tương nano và
dạng dung dịch 40
3.2.3. Xây dựng đường biểu diễn mức độ giải phóng in vivo của nhũ tương nano so
với dung dịch 45
3.2.4. Khảo sát một vài thông số dược động học 47
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

KTTP Kích thước tiểu phân
LLOQ
Giới hạn định lượng dưới
(Lower Limit of Quantitation)
LOD
Giới hạn phát hiện
(Limit of detection)
LQC
Mẫu kiểm tra nồng độ thấp
(Low Quality Control)
MQC
Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình
(Medium Quality Control)
MRT
Thời gian lưu trung bình
(Mean residence time) NSAIDs
Nhóm thuốc chống viêm không steroid
(Nonsteroidal anti-inflammatory drugs)
NTN Nhũ tương nano
PdI
Chỉ số đa phân tán
(Polydispersity index)
SKD Sinh khả dụng
USP
Dược điển Mỹ
(The United States Pharmacopeia)


p
– t trong mô hình không ngăn 17
Hình 3.1. Sắc ký đồ của dịch tiền phòng trắng 31
Hình 3.2. Sắc ký đồ của dịch tiền phòng có chứa diclofenac ở nồng độ 500 ng/mL 31
Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ diclofenac trong dịch tiền
phòng và diện tích peak 33
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn đường cong nồng độ - thời gian trung bình 3 lô 43
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn mức độ giải phóng in vivo của NTN so với dung dịch 46

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
NSAIDs – nhóm chống viêm không steroid là một nhóm dược chất quan trọng
dùng cho mục đích giảm đau, chống viêm trong các bệnh về mắt với nhiều ưu điểm so
với thuốc chống viêm steroid như không làm giảm đáp ứng miễn dịch, không gây ra
đục thủy tinh thể, tăng nhãn áp và không ức chế sự tái tạo của lớp biểu mô giác mạc.
Diclofenac là một dược chất điển hình thuộc nhóm này. Tuy nhiên trên thị trường hiện
chỉ có dạng dung dịch nhỏ mắt natri diclofenac 0,1% với nhiều hạn chế của dạng bào
chế quy ước như sinh khả dụng thấp, thời gian tác dụng ngắn, người bệnh phải dùng
thuốc ít nhất 3 – 5 lần mỗi ngày.
Gần đây, cùng với sự phát triển của công nghệ nano, rất nhiều dạng bào chế mới đã
ra đời với nỗ lực khắc phục những nhược điểm của dạng bào chế cổ điển trong đó có
dạng nhũ tương nano với nhiều ưu điểm nổi trội. Chính vì vậy, bộ môn Bào chế đã tiến
hành nghiên cứu bào chế nhũ tương nano nhỏ mắt diclofenac nhằm làm tăng tính thấm
của dược chất, kiểm soát giải phóng thuốc, duy trì tác dụng kéo dài, hiệu quả và thuận
tiện cho người sử dụng. Hiện tại, công thức cơ bản cho chế phẩm cũng như phương
pháp bào chế đã bắt đầu được xác định [7], [8], [9], [10].
Tiếp theo những nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng diclofenac trong dịch tiền
phòng mắt thỏ và bước đầu đánh giá sinh khả dụng của nhũ tương nano nhỏ mắt

 Tính chất hóa học:
Là một dẫn chất của anilin, diclofenac có thể bị oxy hóa:
 Dung dịch trong methanol, thêm acid nitric đặc sẽ có màu đỏ nâu [4], [5].
 Dung dịch trong ethanol cho phản ứng với các dung dịch kali fericyanid, sắt (III)
clorid, và acid hydrocloric sẽ cho màu xanh và có tủa [4], [5].

3

 Định tính:
 Dựa trên các phản ứng đặc trưng trình bày ở mục tính chất hóa học.
 Đo phổ hồng ngoại và sắc kí lớp mỏng: so sánh với chất chuẩn [5].
 Định lượng:
 Chuẩn độ trong môi trường khan: acid diclofenac có thể định lượng bằng dung
dịch kali hydroxyd trong methanol trong môi trường cloroform [4].
 Đo mật độ quang [5].
 Sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC [5].
1.1.3.Tác dụng dược lí
Diclofenac thuộc nhóm chống viêm không steroid – NSAIDs, có tác dụng ức chế
tổng hợp prostagladin rõ rệt, tạo ra tác dụng chống viêm, giảm đau mạnh.
Các thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh, diclofenac có khả năng ngăn chặn co
đồng tử xảy ra trong quá trình lấy tinh thể đục, làm giảm viêm và đau mắt trong tổn
thương biểu mô giác mạc sau một số phẫu thuật can thiệp khác. Không có dấu hiệu nào
cho thấy diclofenac có tác dụng phụ làm ảnh hưởng đến quá trình lành vết thương [6].
1.2. Thuốc nhỏ mắt
1.2.1. Định nghĩa
Thuốc nhỏ mắt là những chế phẩm lỏng, có thể là dung dịch hay hỗn dịch vô
khuẩn, có chứa một hay nhiều dược chất, được nhỏ vào túi kết mạc với mục đích chẩn
đoán hay điều trị bệnh ở mắt. Thuốc nhỏ mắt cũng có thể được bào chế dưới dạng bột
vô khuẩn và pha với một chất lỏng vô khuẩn thích hợp ngay trước khi dùng [1].
1.2.2. Sinh khả dụng thuốc nhỏ mắt

1.3.2. Một số ưu điểm của nhũ tương nano
 Sử dụng đơn giản và tiện lợi như dung dịch nhỏ mắt, tránh cảm giác cộm mắt khi sử
dụng hệ tiểu phân rắn, hệ cài đặt, tránh mờ mắt của dạng thuốc mỡ…[29].
5

 Giảm kích ứng mắt với các dược chất dễ gây kích ứng do dược chất được hòa tan
trong pha nội [29].
 Các tiểu phân nano như một kho chứa thuốc, khuếch tán từ từ, kiểm soát và duy trì
giải phóng, thích hợp với các bệnh mạn tính, cải thiện sinh khả dụng của các thuốc
có thời gian bán thải ngắn, thuốc được giải phóng kéo dài, giảm số lần dùng thuốc
trong ngày so với dạng thuốc nhỏ mắt, hạn chế tác dụng phụ và tổn thương tế bào
biểu mô mắt [29].
 Các tiểu phân có sức căng bề mặt nhỏ làm tăng khả năng thấm ướt, giúp hệ phân
tán rộng và tăng thời gian tiếp xúc của thuốc với giác mạc [29].
 Dễ tiệt khuẩn [29].
 Độ ổn định cao, ít bị lên bông, kết tụ, sa lắng như các nhũ tương micro [29].
1.3.3. Các nghiên cứu nhũ tương nano diclofenac đã thực hiện
Cùng với xu hướng chung của thế giới, tại Việt nam các hệ siêu vi tiểu phân cũng
đã được triển khai nghiên cứu rất nhiều. Tuy nhiên, dạng nano nhũ tương nhỏ mắt chứa
diclofenac chỉ mới lần đầu tiên được nghiên cứu bắt đầu ở bộ môn Bào chế - trường
Đại học Dược Hà nội từ năm 2011.
Đầu tiên, Vũ Ngọc Mai (2011) sử dụng phương pháp siêu âm đã bào chế thành
công NTN diclofenac (cả dạng acid và dạng muối) với ba loại pha dầu là isopropyl
myristat, Labrafac PG và Miglyol cùng với CDH Tween 80, Cremophor EL, Span 80,
ĐDH Transcutol HP. Đồng thời, tác giả cũng đánh giá được ảnh hưởng của các loại hệ
đệm, lượng pha dầu, nồng độ CDH và ĐDH đến độ ổn định vật lý và khả năng giải
phóng dược chất in vitro [7].
Trên cơ sở đó, Nguyễn Thị Phượng (2012) lựa chọn dạng acid của diclofenac, pha
dầu isopropyl myristat với tỉ lệ các CDH và ĐDH thích hợp để so sánh phương pháp
bào chế siêu âm và siêu âm kết hợp đồng nhất hóa áp suất cao. Kết quả cho thấy, tuy

7

1.4.1. Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học
Để có khả năng áp dụng và đảm bảo chính xác, bất kì một phương pháp phân tích
nào cũng cần thẩm định. Theo hướng dẫn của FDA [18], quá trình thẩm định phương
pháp phân tích trong dịch sinh học được tiến hành qua ba giai đoạn:
 Chuẩn bị chất chuẩn.
 Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích.
 Áp dụng phương pháp thẩm định cho các mẫu phân tích thường qui và các tiêu
chuẩn chấp nhận cho lô mẻ phân tích.
1.4.1.1. Chuẩn bị chất chuẩn
Để kết quả phân tích có giá trị trước hết phải hiệu chuẩn được phép đo bằng các
mẫu thử chứa chất chuẩn với nồng độ biết trước. Mức độ tinh khiết của chất chuẩn
dùng để pha mẫu thử sẽ ảnh hưởng đến quá trình hiệu chuẩn. Chính vì vậy mà cần phải
biết chính xác tỉ lệ các thành phần trong chất chuẩn (phần trăm dạng acid, base tự do,
phần trăm dạng muối, este…) [18].
Có 3 loại chất chuẩn thường được sử dụng:
 Chuẩn được cấp chứng chỉ (Vd: chuẩn USP).
 Chuẩn thương mại từ các công ty sản xuất có uy tín.
 Chuẩn phòng thí nghiệm.
Tất cả chất chuẩn đều phải có nguồn gốc, số lô, hạn dùng, mức độ tinh khiết [18].
1.4.1.2. Thẩm định phương pháp phân tích
Phương pháp phân tích cần phải được thẩm định trên các tiêu chí sau:
a- Tính chọn lọc (Selectivity)
Tính chọn lọc là khả năng phân biệt và định lượng chất cần phân tích khi có mặt
các chất khác trong mẫu.
Các mẫu có nguồn gốc sinh học thường lẫn nhiều chất như chất nội sinh, chuyển
hóa của cơ thể…Phương pháp phân tích cần phải chỉ ra được sự khác biệt trong phép
8


quá thấp [18].
 Độ tìm lại thường được khảo sát với các quy trình có xử lý mẫu bằng chiết lỏng
– lỏng hay chiết pha rắn. Để xác định độ tìm lại cần chuẩn bị ít nhất 3 lô mẫu ở
nồng độ thấp, trung bình và cao trong khoảng khảo sát [18].
c- Xây dựng đường chuẩn (Calibration Curve)
Đường chuẩn là đường biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích peak và nồng độ thuốc
trong dịch sinh học.
 Xây dựng đường chuẩn cần chuẩn bị ít nhất 6 mẫu chuẩn khác nhau với các
nồng độ biết trước trong khoảng cần khảo sát trong đó có nồng độ LLOQ [18].
 Đa phần đường chuẩn được thiết lập theo mô hình hồi quy tuyến tính. Hiện tại,
không có một quy định cụ thể nào cho hệ số tin cậy R. Tuy nhiên để có tính
tuyến tính cao, phân tích chính xác, giá trị R nên ít nhất lớn hơn 0,98.
 Sau khi xây dựng được đường chuẩn, tính lại nồng độ dược chất có trong mẫu
theo phương trình hồi quy đã xây dựng. Yêu cầu phải có ít nhất 75% số mẫu có
độ đúng so với giá trị nồng độ thực đạt từ 85 – 115%. Độ đúng của mẫu có nồng
độ thấp nhất được phép trong khoảng từ 80 – 120% [18].
d- Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)
Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) là nồng độ thấp nhất có khả năng định lượng.
Giới hạn định lượng dưới phải thỏa mãn yêu cầu:
 Đáp ứng ở nồng độ này ít nhất phải bằng 5 lần đáp ứng của mẫu trắng [18].
 Độ đúng phải bằng 80 -120 % so với giá trị nồng độ thực [18].
 Độ chính xác tính theo hệ số biến thiên CV của ít nhất 5 mẫu không được vượt
quá 20% [18].
e- Độ ổn định (Stability)
10

Trên thực tế, các mẫu sinh học thu được thường ít khi được phân tích ngay lập tức.
Do vậy, cần phải nghiên cứu xem chất phân tích có bị biến đổi không trong quá trình
bảo quản cũng như quá trình tiến hành thí nghiệm ở nhiệt độ phòng.
Đánh giá độ ổn định với ít nhất 2 nồng độ (nồng độ thấp và nồng độ cao trong

(chứa 0,065%
triethylamin)
= 495:505
3 ng/mL
(V
tiêm mẫu

=20 µL)
2
[22]
Tiêm trực tiếp
vào cột
Điện hóa
(ECD)
Điện cực chỉ
thị được phân
cực ở 950 mV
Regis SPS
100 RP-8
(5 µm, 150 x
4,6 mm i.d.)
Tốc độ dòng
1,3 mL/phút
Acetonitril :
Sodium acetat
(30mM) pH 3
= 40:60 hoặc
50:50
0,5 ng/mL


10 ng/mL
(V
tiêm mẫu

=20 µL)
11

4
[21]
Tạo dẫn xuất
phát huỳnh
quang bằng
chiếu tia UV
254 nm
Huỳnh quang
(FLD)
λ
kt
=286 nm
λ
px
=360 nm
Regis SPS
100 RP-8
(5 µm, 150 x
4,6 mm i.d.)
Tốc độ dòng
1 mL/phút
Acetonitril :
Sodium acetat

12

Bảng 1.2. Một số đặc điểm giải phẫu, sinh lý của mắt người và mắt thỏ [25]
Thông số Thỏ Người
Thể tích nước mắt (µL) 5 – 10 7 – 30
Tốc độ thay thế nước mắt (µL/phút) 0,6 – 0,8 0,5 – 2,2
Tốc độ chớp mắt tự phát 4 – 5 lần/giờ 6 – 15 lần/phút
Màng nhấp nháy Có Không
pH nước mắt 7,14 – 7,82 7,14 – 7,82
Áp suất thẩm thấu của nước mắt (mOsm/L) 305 305
Bề dày giác mạc (nm) 0,4 0,52
Đường kính giác mạc (nm) 15 12
Diện tích giác mạc (cm
2
) 1,5 – 2,0 1,04
Thể tích dịch tiền phòng (mL) 0,25 – 0,3 0,1 – 0,25
Tốc độ thay thế dịch tiền phòng (µL/phút) 3 – 4,7 2 – 3
Hiện tại, có khá nhiều phương pháp để đánh giá sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt
trên thỏ tuy nhiên đều gặp phải hạn chế bởi lượng mẫu lấy được từ mỗi thời điểm rất ít
và rất khó lấy mẫu. Các phương pháp phổ biến có thể kể đến là:
 Định lượng dược chất trong dịch tiền phòng.
 Định lượng dược chất ở một số mô trong mắt (giác mạc, kết mạc …).
 Đo các đáp ứng trên lâm sàng (đếm số bạch cầu với thuốc chống viêm, đo nhãn
áp với thuốc chống tăng nhãn áp…).
Mỗi phương pháp đánh giá đều có những ưu, nhược điểm riêng và được áp dụng
tùy theo mục đích nghiên cứu. Tuy nhiên, với những thuốc mà đích tác dụng là trong
nhãn cầu thì định lượng dược chất trong dịch tiền phòng là phù hợp nhất bởi đây là khu
vực trung gian vận chuyển các chất đến các mô và tổ chức trong mắt [28]. Vì vậy
phương pháp này đã được lựa chọn để đánh giá sinh khả dụng nhũ tương nano nhỏ mắt
diclofenac.

1.6.1. Mô hình ngăn (Compartmental Modelling)
1.6.1.1. Mô hình ngăn
Mô hình ngăn coi cơ thể như là một hay nhiều ngăn đồng nhất, trong đó thuốc
được hấp thu, phân bố, chuyển hóa và thải trừ theo những quy luật nhất định [3]. Áp
dụng với các thuốc nhỏ mắt, tiền phòng thường được coi là ngăn trung tâm và/hoặc có
thể được coi là ngăn chứa thuốc [28]. Giả thiết này phù hợp đặc điểm cấu tạo sinh lý
bởi dịch tiền phòng chứa trong tiền phòng được vận chuyển tuần hoàn tới tất cả các mô
và tổ chức của mắt. Giác mạc, kết mạc, thủy tinh thể, mống mắt, màng mạch, hậu
phòng có thể được tách rời hoặc kết hợp thành một hay nhiều ngăn ngoại vi [28]. Một
số mô hình ngăn đã được áp dụng có thể tham khảo ở hình 1.3.

Hình 1.3. Một số mô hình ngăn cho thuốc nhỏ mắt [28]
Trong các nghiên cứu, tuy mô hình một ngăn (duy nhất ngăn tiền phòng) là mô
hình không giống với sự phân bố thực của thuốc nhất nhưng lại hay được sử dụng vì
15

đơn giản. Giả sử thuốc được hấp thu và thải trừ theo động học bậc nhất. Diễn biến
nồng độ thuốc theo thời gian sẽ là:
C(t) = ࡯
(૙)
࢑
૙૚
࢑
૙૚
ି࢑
૚૙
(ࢋ
ି࢑
૚૙∙
࢚

Trong đó: A: lượng thuốc được hấp thu.
W: lượng thuốc hiện có trong cơ thể.
E: lượng thuốc đã thải trừ.
 Thuốc thải trừ theo động học bậc 1 nên:
W = V
d
. C
p
→ dW = V
d
. dC
p

݀ܧ
݀ݐ
= ܹ.ܭ
௘
→
݀ܧ
݀ݐ
= ܭ
௘
.ܸ
ௗ
.ܥ
௣

16

Trong đó: V

t
: phần trăm thuốc hấp thu tại thời điểm t
Các phương trình (1) và (2) được sử dụng để xác định tốc độ hấp thu bằng cách
xác định phần trăm hấp thu A
t
/A
∞
theo thời gian, sử dụng phương pháp đồ thị có thể
xác định được cơ chế động học của quá trình hấp thu.
Ngoài ra, từ phương trình (2) còn có thể so sánh SKD tương đối của hai dạng bào
chế của cùng một hoạt chất trên cùng một nhóm đối tượng tham gia thử nghiệm:
ܣ
ஶଵ
ܣ
ஶଶ
=
ܣܷܥ
∞ଵ
ܣܷܥ
∞ଶ

1.6.2. Mô hình không ngăn (Noncompartmental Modelling)
1.6.2.1. Mô hình không ngăn
Để có được mô hình ngăn sát với mô hình sinh lý của mắt thì số ngăn phải nhiều
và rất chi tiết, lấy mẫu và tính toán sẽ vô cùng phức tạp. Tuy nhiên vẫn còn có một
cách tiếp cận khác để nghiên cứu dược động học của thuốc nhỏ mắt. Đó là mô hình
không ngăn hay còn gọi là phương pháp mô hình độc lập.
Cơ sở lý thuyết của phương pháp dựa trên quan điểm “Sự độc lập ngẫu nhiên của
các phân tử” (Molecular Stochastic Independence – MSI) coi sự tồn tại của từng phân
tử thuốc trong cơ thể là độc lập với nhau và thời gian tồn tại của một phân tử thuốc